本发明涉及生物医药
技术领域：
：，具体涉及微生物在鉴别和/或区分不同种族个体中的应用，更具体的，涉及检测allisonella菌属的相对丰度，并与阈值比较，鉴定个体种族来源的方法。
背景技术：
：：高原反应即高原病，是人到达一定海拔高度后，身体为适应因海拔高度而造成的气压差、含氧量少、空气干燥等的变化而产生的自然生理反应。高原反应的症状一般表现为头疼、心慌、疲倦、胸闷、气短、呕吐、食欲减退、抽搐、意识恍惚、认知能力骤降等。体征为心率加快、呼吸加深、血压轻度异常、颜面或四肢水肿、口唇紫绀等。高原心脏病是高原病的一种，由于高原低压缺氧环境引起的心脏结构功能受损，以肺动脉高压和右心功能受损为特征。青藏高原的藏族居民是全球主要高海拔人群，对高原的低氧、低气压环境进行了长期的生理和遗传适应，低氧环境下肺血管收缩反应性降低，具备更好的运动能力。人体肠道中存在大量的共生菌群，其数量超过1000万亿个，大约是人体细胞总数的10倍。同时肠道内微生物基因的数量约为300万个，大约是人类基因组基因数量的100多倍，如此海量的基因能够帮助微生物适应多变的环境，形成了与人体密不可分的共生关系。不同遗传背景和生活习惯的居民其肠道菌群组成存在较大差异，例如拟杆菌属是西方居民肠道中相对含量最多且个体间差异最大的细菌属，韩国居民是栖粪杆菌属。菌属的差异也暗示个体对当地环境的耐受能力。对于个体在高原环境下的耐受能力或者高原病的诊断标志物，目前研究广泛。例如，专利cn106248947a公开了一种脂质和多糖的复合物脂多糖作为哺乳动物高原脑水肿标志物的用途，实验检测进入高原低氧环境后哺乳动物血浆中脂多糖的含量，当血浆中脂多糖的含量超过0.5eu/ml时，哺乳动物脑组织含水量明显增加。专利cn104614462b公开了c8-神经酰胺、鞘氨醇和谷氨酰胺作为高原肺水肿诊断标志物，检测此诊断标志物的诊断试剂盒诊断结果准确度高，为高原肺水肿的诊断提供了可量化的、客观灵敏的临床诊断指标。专利cn102605089b公开了以单核苷酸多态性为标志物检测高原红细胞过度增多的易感性，其中提供了检测单核苷酸多态性引物及试剂盒。专利cn101135666b、cn101470095b、cn101470096a、cn101135665b、cn101469345b、cn101135667b、cn1898394b均公开了以单核苷酸多态性为标志物检测高原肺水肿的易感性，其中提供了检测单核苷酸多态性引物及试剂盒。但是，迄今为止，尚未见以allisonella菌属作为标志物，来鉴别和/或区分不同种族个体的技术方案。技术实现要素：本发明的第一方面，提供了微生物在鉴别和/或区分不同种族个体中的应用。优选的，所述的微生物为allisonella菌属。进一步优选的，所述的微生物为肠道或粪便中的allisonella菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述的微生物为肠道或粪便中的allisonellahistaminiformans。优选的，所述的不同种族为高原环境的种族和平原环境的种族。在本发明的一个具体实施方式中，所述的不同种族为藏族和汉族。在本发明的一个具体实施方式中，所述的不同种族为高原环境下生活的藏族和汉族。本发明的第二方面，提供了一种鉴别和/或区分不同种族个体的方法，所述的方法包括检测所述不同种族个体的肠道和/或粪便中微生物的丰度，将所述的微生物的丰度值与阈值比较，确定所述不同种族个体为高原环境的种族或平原环境的种族。本发明所述的高原环境为海拔2000m以上，具有低压、缺氧的条件。优选的，所述的高原环境为海拔2700m以上，具有低压、缺氧的条件下。在本发明的一个具体实施方式中，所述的高原环境为海拔3500m以上，具有低压、缺氧的条件下。在本发明的一个具体实施方式中，所述的高原环境为海拔5500m以上，具有低压、缺氧的条件下。优选的，所述的方法包括如下步骤：1)提取待测个体粪便或肠道中的微生物核酸；2)扩增步骤1)提取的微生物核酸；3)对步骤2)扩增的核酸进行测序；4)计算allisonella菌属的相对丰度；5)将步骤4)所述的allisonella菌属的相对丰度值与9.98×10-5相比；其中，allisonella菌属的相对丰度值大于9.98×10-5确定为藏族人，allisonella菌属的相对丰度值小于9.98×10-5确定为汉族人。本发明的第三方面，提供了检测微生物丰度的产品在鉴别和/或区分不同种族个体中的应用。优选的，所述的微生物为allisonella菌属。优选的，所述的不同种族为高原环境的种族和平原环境的种族。本发明的第四方面，提供了一种检测微生物丰度的产品，所述的产品包括检测微生物相对丰度的试剂和/或装置，优选的，所述的微生物为allisonella菌属。本发明的第五方面，提供了检测allisonella菌属的试剂在制备评估个体高原环境下耐受能力的产品中的应用。优选的，所述的allisonella菌属为肠道中的allisonella菌属。本发明所述的检测allisonella菌属的试剂为检测allisonella菌属丰度的试剂。优选的，所述的检测allisonella菌属的试剂为检测个体肠道中的allisonella菌属丰度的试剂。在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测allisonella菌属的试剂为检测个体粪便中的allisonella菌属丰度的试剂。本发明所述的高原环境下耐受能力为高原病的易感程度。本发明所述的高原环境为海拔2000m以上，具有低压、缺氧的条件。优选的，所述的高原环境为海拔2700m以上，具有低压、缺氧的条件下。在本发明的一个具体实施方式中，所述的高原环境为海拔3500m以上，具有低压、缺氧的条件下。在本发明的一个具体实施方式中，所述的高原环境为海拔5500m以上，具有低压、缺氧的条件下。本发明的第六方面，提供了一种鉴别和/或区分不同种族个体的微生物，所述的微生物为allisonella菌属。优选的，所述的微生物为肠道或粪便中的allisonella菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述的微生物为粪便中的allisonella菌属。本发明的第七方面，提供了一种评估高原环境耐受能力的标志物，所述的标志物为allisonella菌属。优选的，所述的标志物为肠道内的allisonella菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述的标志物为粪便中的allisonella菌属。本发明的第八方面，提供了一种评估个体高原环境下耐受能力的产品，所述的产品包含检测allisonella菌属的试剂。优选的，所述的检测allisonella菌属的试剂为检测个体肠道中的allisonella菌属丰度的试剂。在本发明的一个具体实施方式中，所述的检测allisonella菌属的试剂为检测个体粪便中的allisonella菌属丰度的试剂。本发明所述的产品包含检测allisonella菌属的试剂及检测其他菌的试剂。本发明的第九方面，提供了一种检测allisonella菌属丰度的方法，所述的方法包括对样本进行16srrna测序，和对测序获得的reads进行otu聚类及物种注释。优选的，所述的16srrna测序之后、otu聚类之间还包括对测序获得的reads进行低质量部分剪切、拆分各样本的数据和/或去除嵌合体序列。优选的，所述的聚类方法选自sortmerna、mothur、trie、uclust_ref、usearch、usearch_ref、blast、usearch61、usearch61_ref、sumaclust、swarm、prefix_suffix、cdhit或uclust。优选的，所述的聚类算法选自furthest、nearest或average。优选的，所述的注释算法选自rdp、blast,rtax、mothur、uclust或sortmerna。在本发明的一个具体实施方式中，所述的otu聚类以97％的一致性将序列聚类。本发明的第十方面，提供了一种提高个体高原环境耐受能力的方法，所述的方法包括向个体移植allisonella菌属。优选的，所述的方法包括向个体肠道内移植allisonella菌属。在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法包括在个体去高原环境之前移植allisonella菌属。优选的，所述的提高个体高原环境耐受能力为提高平原地区人适应高原环境的能力。本发明所述的高原病选自在高原环境下产生的急性高原病和/或慢性高原病。所述的急性高原病选自高原昏迷、高原脑水肿、高原肺水肿或脑、肺异常症状同时存在的混合型疾病；和/或所述的慢性高原病选自高原心脏病、高原红细胞增多症、高原高血压、高原低血压、高原心脏病、红细胞增多症同时存在的混合型疾病。优选的，所述的高原病为抗高原心肺及血管损伤；进一步优选的，所述的高原病为高原心脏病。在本发明的一个具体实施方式中，所述的高原病为肺动脉高压和/或右室肥厚。本发明所述高原病的临床表现选自头疼、头昏、心慌、心率加快、疲倦、胸闷、气短、呼吸加深、恶心、呕吐、失眠、乏力、眼花、嗜睡、食欲减退、抽搐、意识恍惚、手足麻木、唇指发绀、颜面水肿、四肢水肿或认知能力骤降中的一种或两种以上的组合。本发明所述的allisonella菌属的丰度或相对丰度为allisonella菌属在特定菌群中的相对丰度，在本发明的实施例中为allisonella菌属在肠道菌群中的丰度程度。本发明所述的allisonella菌属为从个体分离纯化或购买获得。本发明所述的allisonella菌属以活的形式被提供。本发明所述的allisonella菌属以冻干、冷冻干燥或喷雾干燥的形式被提供。本发明所述的allisonella菌属以孢子形式被提供。本发明所述的allisonella菌属为allisonellahistaminiformans。本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。本发明所述的“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。本发明所述的“鉴别”表示将一个或两个以上的个体判断或确定为一个或两个以上的属性，例如，本发明实施例中的“鉴别”为将一个或两个以上的个体判断或确定为来源是汉族或藏族。本发明所述的“区分”表示将两个以上的个体分开为不同的属性，例如，本发明实施例中描述的“区分”为将两个以上的个体区分为来源为汉族或来源为藏族。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：图1：为藏族士兵组(zang)与汉族士兵(han)组粪便中allisonella菌属的丰度的差异。图2：allisonella菌属相对丰度鉴别和/或区分个体来源是汉族或藏族的敏感性和特异性的roc曲线。图3：为藏族士兵组(zang)粪便中群落组成。图4：汉族士兵(han)组粪便中群落组成。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一、材料与方法：1.1研究人群根据strobe声明设计病例对照研究，纳入某年某月至某年某月在中国某部队服役128个习服海拔3500米高原以上的藏族男性士兵为实验组，根据藏族士兵年龄匹配128个平原汉族士兵进行对照。严格控制两组人群的进行相同的中国部队混合饮食，保持相同的海拔3500米训练环境和训练强度，戒烟、酒，持续3个月。排除有慢性炎性疾病、口服抗生素、急性感染和胃肠道疾病的士兵。1.2粪便样品收集每一个研究对象在纳入后均收到一个马桶粪便收集器，在排出大便后将大便装入粪便收集管，即刻保存在-20℃冰箱，次日将粪便标本转运至-80℃冰箱保存，统一储存备用。1.3dna提取吸取1000μl十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide，ctab)裂解液至2.0mlep管里，加入溶菌酶，再将500μl左右的样品加入裂解液中，65℃水浴，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解。离心取上清，加酚(ph8.0)：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。取上清，加氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min。吸取上清至1.5ml离心管里，加入异丙醇，上下摇晃，-20℃沉淀。12000rpm离心10分钟，倒出液体，注意不要倒出沉淀。用1ml75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。超净工作台吹干或者室温晾干。加入ddh2o溶解dna样品，加rnasea1μl消化rna，37℃放置15min。之后利用琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，取适量的样本dna于离心管中，使用无菌水稀释样本dna至1ng/μl。1.4pcr扩增、混样和纯化以1.3稀释后的基因组dna为模板，根据测序区域16sv3-v4，选择使用带barcode的特异引物515f和806r，newenglandbiolabs公司的high-fidelitypcrmastermixwithgcbuffer，和高效高保真酶(taqdnapolymerase)进行pcr，确保扩增效率和准确性；其中，特异性引物515f为：5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’(seqidno：1)特异性引物806r为：5’-ggactachvgggtwtctaat-3’(seqidno：2)。pcr产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据pcr产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1×tae浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化pcr产物，剪切回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是thermoscientific公司genejet胶回收试剂盒回收pcr产物。1.5文库构建和上机测序使用thermofisher公司的ionplusfragmentlibrarykit48rxns建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过qubit定量和文库检测合格后，使用thermofisher的ions5tmxl进行上机测序。1.6数据分析1.6.1测序数据处理使用cutadapt(v1.9.1，http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)先对reads进行低质量部分剪切，再根据barcode从得到的reads中拆分出各样品数据，截去barcode和引物序列初步质控得到原始数据，经过以上处理后得到的reads需要进行去除嵌合体序列的处理，reads序列通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。1.6.2运算的分类单位(operationaltaxonomicunit，out)聚类和物种注释利用uparse软件(uparsev7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97％的一致性将序列聚类成为otus(operationaltaxonomicunits)，同时会选取otus的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是otus中出现频数最高的序列作为otus的代表序列。对otus序列进行物种注释，用mothur方法与silva(http://www.arb-silva.de/)的ssurrna数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在属水平统计汉族士兵组、藏族士兵组的群落组成(见图3、4)。1.6.3菌属相对丰度计算和差异比较菌属相对丰度用allisonella菌属otu值/检测样本检测到的所有菌属otu值表示，差异比较因为样本非正态分布采用mann-whitney检验。绘制roc曲线鉴别/区分个体种族来源或评估菌属相对丰度对高原环境下耐受能力诊断的敏感性和特异性，计算界值，p＜0.05为差异有统计学意义，采用spss22.0软件包进行统计学处理。二、实验结果2.1汉族和藏族人群粪便标本中allisonella菌属相对丰度差异汉族人群中allisonella菌属的相对丰度[中位数(四分位数)]为[6.50×10-5(0，3.33×10-4)]，藏族人群中allisonella菌属的相对丰度[中位数(四分位数)]为2.22×10-4(2.02×10-5，4.47×10-4)，表明藏族人群allisonella菌属相对丰度显著高于汉族人群，差异具有显著性，如图1所示。2.2allisonella菌属相对丰度鉴别/区分汉藏来源的敏感性和特异性如图2所示，roc曲线显示allisonella菌属相对丰度鉴别/区分汉藏来源或评估高原环境下耐受能力的敏感性和特异性，roc曲线下的面积(areaundercurve，auc)值为0.64977，菌属相对丰度为9.98×10-5时。精确度(accuracy)为0.659，特异度性为0.733，敏感度为0.589，c统计量(f1-score值)为0.64，可得到最大的约登指数0.360。上述结果表明，利用16srrna测序检测粪便标本allisonella菌属相对丰度，可以鉴别人群来源是藏族还是汉族，或者，评估个体对于高原环境下耐受能力，当相对丰度大于9.98×10-5可判定个体为藏组人，且对于高原环境下耐受能力很强。实施例2验证实验根据strobe声明设计病例对照研究，选择5名志愿者，严格控制5名志愿者进行相同的中国部队混合饮食，保持相同的海拔3500米环境和运动强度，戒烟、酒，持续3个月。5名志愿者均排除有慢性炎性疾病、口服抗生素、急性感染和胃肠道疾病。实验步骤：1、粪便样品收集；2、dna提取；3、pcr扩增、混样和纯化；4、文库构建和上机测序；5、测序数据处理；6、运算的分类单位聚类和物种注释。步骤1-6具体操作如实施例1所述。实验结果5名志愿者中，有3名志愿者allisonella菌属相对丰度值低于阈值，判定为汉族；2名志愿者allisonella菌属相对丰度值高于阈值，判定为藏族。实验检测后经询问及调查证实，3名志愿者确实为汉族，2名志愿者确实为藏族，实验结果准确。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。序列表<110>中国人民解放军总医院<120>微生物在鉴别和/或区分不同种族个体中的应用<130>1<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtgccagcmgccgcggtaa19<210>2<211>20<212>dna/rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggactachvgggtwtctaat20当前第1页12当前第1页12