本发明属于检测技术领域，具体涉及一种提高易起泡液态食品中金黄色葡萄球菌检出限的方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)是一种常见的食源性致病菌，广泛存在自然界中。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属中产生脂溶性黄色色素的革兰氏阳性球菌，直径约0.8-1.0μm，显微条件下呈或散布或凝聚葡萄状，无芽孢、鞭毛，多数无荚膜。
金黄色葡萄球菌极易污染食品，美国疾病控制与预防中心报告显示，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占第2位，仅次于大肠杆菌，占整个细菌性食物中毒的33％。近年来，我国每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已居第4位，严重危害人类身体健康和生命安全。金黄色葡萄球菌造成食物中毒的重要因素是其产生的肠毒素，当金葡菌污染达到一定数量后产生的肠毒素累积会引起食物中毒。因此提高金黄色葡萄球菌的检出限，准确检测食品中的金黄色葡萄球菌数量显得尤为重要。
目前金黄色葡萄球菌成熟的检测方法仍沿用传统的国家标准方法gb4789.10-2016，取样量为25g(ml)，因此只能检测25g(ml)样品中的部分活菌，检出率较实际样品中的污染低，极易容易出现假阴性结果，危害广大消费者安全，造成食品安全隐患。因此，迫切需要改进和提高食品中金黄色葡萄球菌检测的前处理方法，对样品中的微生物进行高效富集，提高金黄色葡萄球菌的检出限和灵敏度。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高易起泡液态食品中金黄色葡萄球菌检出限的方法，加大取样量，使用有效的消泡剂解决样品前处理富集过程中起泡的问题，采用真空滤膜抽滤富集样品中的微生物至微孔滤膜上，提高食品中金黄色葡萄球菌的检出限和灵敏度。采用本方法处理液态食品样品后，液态食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度、检出限和检测准确率都得到了很大提高，检测结果假阴性大大降低。
基于上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种提高易起泡液态食品中金黄色葡萄球菌检出限的方法，包括以下步骤：
1)取500ml易起泡的液态食品样品加入10ml聚二甲基硅氧烷(pmx)消泡，于20℃无菌条件下8000rmp/min离心6min，收集清液；
2)所得上清液用聚醚pes微孔滤膜抽滤，将微生物富集于微孔滤膜上；
3)将微孔滤膜置于φ55mm50ml具塞平底玻璃杯中，用10mlhanks洗脱液冲洗浸泡，于微型振荡器震荡2min，使微孔中微生物释放到溶液中得样品浓缩液；此操作要在3min内完成；
4)样品中金黄色葡萄球菌检测
取1ml样品浓缩液与9ml磷酸缓冲液混合得到稀释菌悬液，10倍梯度稀释，每梯度的菌悬液1ml，涂布于baird-parker琼脂平板；36℃培养24-48h计数金黄色葡萄球菌典型菌落，计算出的菌落数即为样品中金黄色葡萄球菌的数量。
步骤2)中，聚醚pes微孔滤膜采用φ50mm0.45μm聚醚pes微孔滤膜。
步骤4)中，混合时采用漩涡震荡，震荡时间为2min。
本发明首先加大了检测的取样量，对易起泡的液态食品样品进行消泡处理，20℃条件下高速离心，去除食品样品中的脂肪、蛋白等大分子物质，然后采用微孔滤膜过滤，将样品中的金黄色葡萄球菌富集于微孔滤膜上，用具有保护性的洗脱液洗脱滤膜上的目标菌，收集洗脱后的菌液为样品待测液，取待测液进行baird-parker平板计数检测。本方法使用有利于金黄色葡萄球菌生长和保护作用的洗脱液洗脱滤膜上和滤膜孔径中的目标菌，解决了标准方法检测液态食品金黄色葡萄球菌检出限低的问题，达到富集液态食品中金黄色葡萄球菌的目的，提高了液态食品中金黄色葡萄球菌的检出限和灵敏度。
具体说来，表现在以下方面：
1)本发明加大了检测的样品取样量，由标准方法的取样25g/ml，可增加至500g/ml。取样量的增加，使目标微生物金黄色葡萄球菌的检出率大大增加，避免的金黄色葡萄球菌漏检、少检、假阴性、检测数值较实际污染值低的问题；
2)针对易起泡的样品，加入消泡剂聚二甲基硅氧烷(pmx)做预处理，可避免后续离心、微孔滤膜抽滤过程中起泡外溢的问题；
3)本发明采用低温高速离心处理样品，能够有效去除样品中富含的脂肪和蛋白等大分子组分干扰物，有利于下一步的微孔滤膜过滤富集操作；
4)本发明采用0.45μm的聚醚砜(pes)微孔滤膜真空条件下抽滤食品样品匀液，富集样品中的金黄色葡萄球菌等细菌到微孔滤膜上，达到富集目标菌的目的，很好地解决了低水平的病原微生物的检测问题，增大了金黄色葡萄球菌的检出率。使用0.45μm的孔径既能有效的截留目标微生物又不至于堵塞滤膜微孔，材质为聚醚砜(pes)的微孔滤膜较其他材质的微孔滤膜过滤和洗涤操作时更不易破损；
5)本发明采用特制的φ55mm50ml具塞平底玻璃杯，洗脱微孔滤膜中的目标菌。玻璃杯直径φ55mm略大于滤膜直径φ50mm，即方便取放滤膜，又能有效集中洗脱溶液；采用平底玻璃杯能够使微孔滤膜最大面积接触洗脱液，有助于提高目标菌的洗脱率；玻璃杯采用具塞密封，在震荡洗脱目标菌时，有效避免了洗脱液和目标菌的飞溅逸出，既能保证数据的有效性，又能保障实验操作人员的安全；
6)本发明采用的微孔滤膜洗脱液为含10mlhanks平衡盐缓冲液，其成分即可在一定时间内有效的保护细菌细胞不受破坏，又有利于金黄色葡萄球菌被洗脱后一定时间在少量hanks缓冲溶液中保存和生长；
7)经本发明富集处理样品后，液态食品中金黄色葡萄球菌的检出限和灵敏度大大提高。
且本发明上述研究成果目前在国内并无相类似应用研究，具有强大的市场竞争力。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种提高易起泡液态食品中金黄色葡萄球菌检出限的方法，包括以下步骤：
1)取500ml易起泡的液态食品样品加入10ml聚二甲基硅氧烷(pmx)消泡，于20℃无菌条件下8000rmp/min离心6min，收集清液；
2)所得上清液用φ50mm0.45μm聚醚pes微孔滤膜抽滤，将微生物富集于微孔滤膜上；
3)将微孔滤膜置于φ55mm50ml具塞平底玻璃杯中，用10mlhanks洗脱液冲洗浸泡，于微型振荡器震荡2min，使微孔中微生物释放到溶液中得样品浓缩液；此操作要在3min内完成；
4)样品中金黄色葡萄球菌检测
取1ml样品浓缩液与9ml磷酸缓冲液混合得到稀释菌悬液，混合时采用漩涡震荡，震荡时间为2min，10倍梯度稀释，每梯度的菌悬液1ml，涂布于baird-parker琼脂平板；36℃培养24-48h计数金黄色葡萄球菌典型菌落，计算出的菌落数即为样品中金黄色葡萄球菌的数量。
效果实验：
1、消泡方法的选择
针对一些液体样品，如：啤酒、饮料、豆浆等发酵食品易起泡的特点，进行了消泡效果的研究。采用不同的方法处理样品后，观察微孔滤膜抽滤样品时有无起泡外溢的情况，验证消泡效果。试验样品以500ml啤酒为例，结果见表1。
试验结果显示：采用10ml的聚二甲基硅氧烷(pmx)处理样品，能达到较好的消泡效果，不会影响后面的微孔滤膜抽滤操作。
表1.消泡方法的研究
2、离心时间的选择
将消泡处理后的液体样品20℃无菌条件下离心，以去除样品中脂肪、蛋白等大分子物质。试验中以转速8000rmp/min分别离心0min、2min、4min、6min、8min、10min，去除沉淀，收集离心后上清液。上清液0.45μm的微孔滤膜，真空负压抽滤样品，记录抽滤样品所用时间情况，验证离心时间对去除样品中大分子物质的影响，确定最佳离心时间。结果见表2。
由表2试验数据可见，不离心无法完成后续滤膜过滤操作，离心4min以内，无法有效去除大部分的大分子物质，导致后续滤膜抽滤耗时长，离心6分钟即可使抽滤时间缩短至2min以内，离心更长时间与离心6min并无较大差异。因此选择20℃下，8000rmp/min6min效果最佳。
表2.离心时间的选择
3、微孔滤膜材质和孔径的选择
本发明需要对液态食品通过真空抽滤的方式将目标菌富集在微孔滤膜上，真空抽滤时，存在一定的压力，因此对微孔滤膜的材质强度和韧性有一定的要求。试验中选取混合纤维素(cn-ca)滤膜、聚酰胺类滤膜尼龙(pa-66)、聚醚砜(pes)滤膜、聚丙烯(pp)纤维滤膜，经过滤器负压抽滤对比，聚醚砜(pes)滤膜破损率最低。
试验分别选取孔径为0.1μm、0.22μm、0.45μm、0.8μm、1.2μm的微孔滤膜进行富集效果验证。无菌条件下取500ml含菌样品，经离心去除大分子物质后，取上清液通过不同孔径的微孔滤膜，将抽滤后的微孔滤膜洗涤，洗涤后的溶液取1ml于baird-parker平板，36℃分离培养48h，计数阳性菌落数。
表3.微孔滤膜孔径的选择
实验发现，直径0.1μm和0.22μm的微孔滤膜过滤时因孔径太小，过滤速度特别缓慢，10s后已经无法继续过滤。0.45μm、0.8μm、1.2μm的微孔滤膜均可满足过滤速度要求。但是0.8μm和1.2μm的微孔滤膜目标菌的富集率偏低，原因可能是孔径大于目标菌的直径大，导致抽滤时目标菌通过滤膜微孔过滤至抽滤瓶中，未能拦截在滤膜表面，因此仅能够富集少量目标菌，导致检测结果偏低。因此，综合考虑过滤速度、富集效率等因素，采用直径0.45μm的微孔滤膜富集金黄色葡萄球菌效果较好。
4、最大取样量的选择
微生物检测时，取样量的多少直接关系到检出目标菌的数值大小，取样量越大，目标菌的检出率越大，数值越大。因此，尽可能的加大取样量，才能有效避免检测结果较实际污染水平低，假阴性的问题。
实验对取样量进行了实验研究，分别取不同量的样品进行检测，对比实验过程的可行性和检测结果的准确度。
以啤酒为例，分别取25ml、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml含目标菌的液态样品，采用φ50mm0.45μm的微孔滤膜，真空负压抽滤样品，记录抽滤样品所用时间情况，过滤后滤膜洗脱后，取去洗脱液1ml涂布于baird-parker琼脂平板，36℃培养24-48h计数金黄色葡萄球菌典型菌落。结果见表4。
由表4数据可见，滤膜拦截的目标菌数随着取样量增加而增加，但取样量增加导致抽滤时间增加，抽滤时间越长，堵在滤膜孔径中的细菌等介质越多，抽滤550ml液体后所需时间剧增，需要约5min，600ml时已无法完全抽滤样液。因此，选择取样量500ml最佳。
表4.不同取样量的选择
5、微孔滤膜洗脱液的选择
微孔滤膜富集目标菌后，滤膜的洗脱效率直接影响结果的准确性，因此选择合适的洗脱方式和洗脱液尤为重要。试验中选择不同的溶液洗脱抽滤后的微孔滤膜，分别取1ml滤膜洗脱后的菌液于baird-parker平板36℃培养48h，做金黄色葡萄球菌阳性菌计数。
试验中分别对nacl缓冲液、磷酸盐缓冲液pbs、hanks平衡盐溶液、7.5％氯化钠肉汤洗脱效果进行了研究。详细结果见表5。
由表5试验数据可看出，使用nacl缓冲液、磷酸盐缓冲液pbs和7.5％氯化钠肉汤效果并不理想，hanks平衡盐溶液即可以达到洗脱的目的又可以达到保护金黄色葡萄球菌的目的，经试验对比采用10mlhanks平衡盐溶液洗脱的效果最佳。
表5.洗脱液的选择试验
6、微孔滤膜洗脱震荡时间的选择
使用hanks平衡盐溶液洗脱目标菌污染后的微孔滤膜，先取5mlhanks溶液浸泡微孔滤膜，微型振荡器震荡0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，用无菌镊子将滤膜取出，使用5mlhanks平衡盐溶液反复冲洗微孔滤膜，洗脱溶液收集为待测液，涂布于baird-parker琼脂平板，36℃培养24-48h计数金黄色葡萄球菌典型菌落。结果见表6。
表6.震荡时间的选择
由表6数据可见，微孔滤膜不经震荡洗脱的测得的含菌量较低，随震荡时间增加滤膜表面和微孔中的细菌脱离滤膜至溶液中，120s达到最佳效果，120s后测得的活菌量逐渐降低。因此选择震荡120s目标菌溶出效果最佳。
7、本方法与国标方法的对比
无菌条件下，取液态食品样品500ml，加入10ml聚二甲基硅氧烷(pmx)预处理样品，20℃8000rmp/min离心6min，去除样品中脂肪、蛋白等大分子物质，收集离心后上清液，上清液用φ50mm0.45μm聚醚pes微孔滤膜抽滤，将微生物富集于微孔滤膜上，取出抽滤后的滤膜，放置于φ55mm50ml具塞平底玻璃杯中，用10mlhanks洗脱液冲洗浸泡，于微型振荡器震荡2min，使微孔中微生物释放到溶液中，制备成样品浓缩液。取样品浓缩待测液进行10倍梯度稀释，分别取1ml100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度梯度的样品溶液，涂布于baird-parker琼脂平板，36℃培养24-48h计数金黄色葡萄球菌典型菌落。
同时按照gb4789.10-2016第二法取同样的样品25ml，10倍梯度稀释，取1ml100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度梯度的样品溶液，涂布于baird-parker琼脂平板，36℃培养24-48h计数金黄色葡萄球菌典型菌落。
详细结果见表7。
表7.本方法与国标方法的对比结果
由实验结果可见，使用本发明方法检测液态食品中的金黄色葡萄球菌，可计数至10-6，而按照国标方法检验仅可计数至10-3，本发明方法检出限和灵敏度显著高于国标方法。
8、本发明方法的效果验证对比试验
用1×102cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌液污染啤酒样品，样品按照实施例1所述的方法进行检测，同时采用《gb4789.10-2016》第二法进行检测对比，对比检测结果如表8所示。
表8本发明的检测方法与国标方法的对比检测结果
由实验数据分析可见，本发明与国标方法相比提高了检测的灵敏度，提高了液态食品样品中金黄色葡萄球菌的检出率和检出限，降低了液态食品因污染金黄色葡萄球菌而引起的食品安全风险。