一种可诱导表达的Sympk支架蛋白促进干细胞增殖的方法及应用与流程

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种可诱导表达的sympk支架蛋白，促进干细胞的增殖并保持自我更新和多能性的方法及应用。

背景技术：

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。胚胎干细胞具有广泛的自我更新能力并具有分化为所有三种胚层细胞的多能性潜能，可用于治疗目的，并且可为组织移植治疗、药物筛选、功能基因组学和蛋白质组学提供无限的细胞来源。

干细胞移植治疗是一门先进的医学技术，为一些疑难杂症的治疗带来了希望。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的的医疗手段。干细胞移植治疗范围很广，对很多传统医疗手段无法治愈的神经系统性疾病例如神经退行型疾病，脑瘫和免疫系统性疾病如急性白血病、血管病变以及其它疾病都具有很好的治疗效果的潜能。

干细胞移植治疗的优点在于其低毒性、安全、无免疫排斥反应且来源充足；但是来源于病人的干细胞如何在体外高产量和高质量的扩增以及缩短高花费的培养周期是临床医生所面临的难点。

传统用于提高体外培养干细胞产量的方法有添加细胞生长因子，人工合成的小分子化合物，多聚赖氨酸包被培养皿等。然而有些干细胞，例如间充质干细胞对外源添加物的刺激很敏感，极其容易在培养的过程中产生复制性的凋亡，同时一些使用外源性添加物促进干细胞增殖的方法可能存在缺陷，即在刺激干细胞增殖的同时影响了干细胞多能性的维持。

因此，有必要提供一种降低外源性添加物依赖、提高体外培养干细胞产量而又不影响干细胞自我更新和多能性维持的方法。

sympk蛋白即偶对蛋白，1996年在人的肠上皮细胞和睾丸支持细胞中发现，被认为是一个与细胞连接相关的蛋白。随后的研究发现sympk蛋白在体细胞质多聚腺苷酸化中也具有重要作用。在多聚腺苷酸化过程中，需要多种蛋白复合体，包括切割-多聚腺苷酸化特异因子cpsf、切割活公因子cstf、切割因子i和ii，多聚腺苷酸聚合酶pap等。而sympk作为一种脚手架蛋白介导并协调cpsf和cstf两者间的相互作用。目前暂未发现sympk蛋白作为促进细胞增殖方面的相关报道。

技术实现要素：

本发明公开了sympk蛋白的新用途，发现sympk支架蛋白具有促进体外培养的干细胞增殖的作用，使其能保持自我更新和多能性维持的能力，诱导sympk支架蛋白的表达可以作为一个促进干细胞体外扩增的技术手段。

本发明第一方面提供一种干细胞的培养方法，包括：

1)将sympk的基因编码序列克隆到表达载体，获得重组表达载体；

2)将重组表达载体转染细胞，获得可诱导性表达sympk支架蛋白的细胞；

3)诱导sympk支架蛋白表达，所述的sympk支架蛋白的诱导表达采用强力霉素诱导表达，其中，所述的强力霉素的诱导浓度为100-1000ng/ml；

4)传代培养获得干细胞，其中，传代培养过程中重复步骤3)的诱导条件。

在本发明一实施方式中，所述步骤1)中，所述sympk基因序列为sympk全长基因编码序列，所述sympk基因全长编码序列是由cd1小鼠睾丸的cdna作为模板，通过特异性引物进行pcr获得。

在本发明一实施方式中，所述cd1小鼠睾丸的cdna在genebank上的登录号为：geneid:68188。

在本发明一实施方式中，所述特异性引物的上、下游序列分别为seqidno.1或seqidno.2所示。

在本发明一实施方式中，所述传代培养传代1-12代。优选地培养至第10代。

在本发明一实施方式中，所述传代培养传代第10代，传代培养的第11代和第12代细胞采用去除强力霉素诱导的培养基。

需要说明的是，本领域技术人员可以根据具体实际需求，决定传代的次数，比如30代或50代或更多，且获得本发明实施例传代培养传代1-12代的等同的技术效果，应纳入本发明保护范围。

在本发明一实施方式中，所述步骤2)中，所述重组表达载体包括g418抗生素筛选标记，获得可诱导性表达sympk支架蛋白的细胞的步骤还包括：采用g418抗生素抗性筛选sympk支架蛋白表达的细胞。

本领域技术人员可以理解的是，本发明所述的强力霉素的诱导浓度为细胞培养基中强力霉素的终浓度。

可以理解的是，本领域技术人员选择其他常规使用的强力霉素衍生物或类似物诱导表达试剂，比如四环霉素，来替换本发明实施例采用的强力霉素，应纳入本发明保护范围。

在本发明一实施方式中，所述步骤3)中，所述的诱导sympk支架蛋白表达过程中，细胞培养基中强力霉素的终浓度为500-1000ng/ml。

在本发明一实施方式中，所述4)中，所述的传代培养过程中，细胞培养基中强力霉素的终浓度为100-1000ng/m。优选为500-1000ng/m。

在本发明一实施方式中，所述方法促进干细胞增殖，且不影响干细胞多能性。

在本发明一实施方式中，所述方法不影响胚层标记物的表达。

进一步的，所述方法不影响胚层标记物的表达中，所述的胚层标记物包括foxa2、gata6、sox17、gata4、mash1、nestin、goosecoid、branchyury、hand1、eomes中的一种或多种。

更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述胚层标记物的mrna水平变化为0％-10％，优选为0-5％、进一步优选为0-3％、更进一步优选为0-1％。

更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述内胚层标记物foxa2和sox17的mrna水平变化为0％-2％。

更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述内胚层标记物foxa2和sox17的mrna水平变化为0％-2％。

更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述中胚层标志物goosecoid和brachyury的mrna水平变化为0％-3％。

更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述中胚层标志物外胚层标志物nestin1和mash1的mrna水平变化为0％-1％

更进一步地，相较于不加强力霉素诱导表达的对照组，所述滋养外胚层标志物hand1和eomes相对于对照组mrna水平的变化为0-7％。

在本发明一实施方式中，所述步骤3)中，所述强力霉素诱导表达还包括采用辅助载体与重组表达载体共转染细胞，所述的表达载体为3×flag-p2loxp载体或egfp-p2loxp载体，所述的辅助载体为psolk-cre载体。

优选地，所述步骤1)中，将sympk基因序列克隆到表达载体3×flag-p2loxp载体的ecorv/noti酶切位点之间。

本领域技术人员可以根据具体需求，比如不同于flag、egfp的载体筛选标记，选择其他表达载体替换本发明实施例所采用的3×flag-p2loxp载体或egfp-p2loxp载体，且获得合理预期技术效果，本领域技术人员采用其他表达载体或辅助载体应纳入本发明保护范围。

在本发明一实施方式中，所述干细胞为胚胎干细胞。更进一步地，所述细胞为小鼠胚胎干细胞。

在本发明一实施方式中，在表达sympk支架蛋白的细胞的克隆形成实验中，相较于未使用强力霉素诱导添加表达sympk支架蛋白的干细胞，本发明第一方面所述的方法不改变干细胞克隆形成的数目。

本发明第二方面提供由第一方面所述的干细胞培养方法制备得到的细胞。

本发明第三方面提供了一种干细胞的培养试剂盒，包括由第一方面步骤2)所述的可诱导性表达sympk支架蛋白的细胞，还包括强力霉素、细胞培养基；其中，所述的sympk支架蛋白的诱导表达采用强力霉素诱导表达，其中，所述的强力霉素的诱导浓度为100-1000ng/ml。

本发明第四方面提供了一种sympk支架蛋白的诱导表达方法，包括以下步骤：

将sympk基因编码序列克隆到表达载体的酶切位点之间，获得重组表达载体；

将重组表达载体转染细胞，诱导sympk支架蛋白表达，所述的sympk支架蛋白的诱导表达采用强力霉素诱导表达，其中，所述的强力霉素的诱导浓度为100-1000ng/ml。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述步骤1)中，所述sympk基因序列为sympk全长基因编码序列，所述sympk基因全长编码序列是由cd1小鼠睾丸的cdna作为模板，通过特异性引物进行pcr获得。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述cd1小鼠睾丸的cdna在genebank上的登录号为：geneid:68188。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述特异性引物的上、下游序列分别为seqidno.1或seqidno.2所示。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述重组表达载体包括g418抗生素筛选标记，获得可诱导性表达sympk支架蛋白的细胞的步骤还包括：采用g418抗生素抗性筛选sympk支架蛋白表达的细胞。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述强力霉素的浓度为500-1000ng/ml。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述方法促进干细胞增殖，且不影响干细胞多能性。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述方法不影响胚层标记物的表达。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述强力霉素诱导表达还包括采用辅助载体与重组表达载体共转染细胞，所述的表达载体为3×flag-p2loxp载体或egfp-p2loxp载体，所述的辅助载体为psolk-cre载体。

优选地，将sympk基因序列克隆到表达载体3×flag-p2loxp载体的ecorv/noti酶切位点之间。

在本发明一实施方式中，第四方面中，所述干细胞为胚胎干细胞。更进一步地，所述细胞为小鼠胚胎干细胞。

在本发明一实施方式中，本发明第四方面所述的方法在表达sympk支架蛋白的细胞的克隆形成实验中不改变干细胞克隆形成的数目。

本发明第二方面提供一种表达sympk支架蛋白的细胞的制备方法，包括：筛选出如本发明第一方面所述的方法步骤2)中有sympk支架蛋白表达的单克隆，获得表达sympk支架蛋白的细胞。

在本发明一实施方式中，在第一方面或第四方面中，所述干细胞的培养基包括基础培养基。

本领域技术人员可以理解的是，所述干细胞的培养基中的基础培养基可使用公知的，只要不抑制干细胞的增殖就不特别限定，包括但不限于dmem、emem、imdm(iscove'smodifieddulbecco's培养基)、gmem(glasgow'smem)、rpmi-1640、α-mem、ham's培养基f-12、ham's培养基f-10、ham's培养基f12k、培养基199、atcc-crcm30、dm-160、dm-201、bme、fischer、mccoy's5a、leibovitz'sl-15、ritc80-7、mcdb105、mcdb107、mcdb131、mcdb153、mcdb201、nctc109、nctc135、waymouth'smb752/1、cmrl-1066、williams'培养基e、brinster'sbmoc-3培养基、e8培养基(naturemethods、2011、8、424-429)、reproff2培养基(reprocell公司)中的一种或多种。

在本发明一实施方式中，在第一方面或第四方面中，所采用的基础培养基还含有一种或多种添加物。

本领域技术人员可以理解的是，所述干细胞的培养基的添加物可使用公知的，只要不抑制干细胞的增殖就不特别限定，包括但不限于生长因子(例如胰岛素等)、铁源(例如转铁蛋白等)、聚胺类(例如腐胺等)、矿物(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白质(例如白蛋白等)、氨基酸(例如l-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、类固醇(例如β-雌二醇、黄体酮等)、抗生物质(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如hepes等)中的一种或多种。另外，也可适宜含一直以来在干细胞的培养中使用的添加物。添加物优选为各自以公知的浓度范围内包含。

可以理解的是，在第一方面或第四方面中，本发明实施例在不添加其他外源性的促进干细胞增殖的化合物的前提下，即可实现干细胞的增殖，并获得很好的效果；但本发明实施例不排除采用本领域技术人员常规的促进干细胞增殖的添加物。

本发明第五方面提供了一种sympk支架蛋白、如第一方面所述的干细胞的培养方法、如第二方面所述的细胞、如第三方面所述的干细胞的培养试剂盒或第四方面所述sympk支架蛋白的诱导表达方法在促进干细胞增殖中的应用。

本发明第六方面提供了一种sympk支架蛋白、如第一方面所述的干细胞的培养方法、如第二方面所述的细胞、如第三方面所述的干细胞的培养试剂盒或第四方面所述sympk支架蛋白的诱导表达方法在增大拟胚体的尺寸的应用中，不影响胚层标记物的表达。

在本发明一实施方式中，所述胚层标记物为foxa2、gata6、sox17、gata4、mash1、nestin、goosecoid、branchyury、hand1、eomes中的一种或多种。

本发明提供的技术方案的有益效果：本发明公开的sympk支架蛋白是一种生物体内存在的保守蛋白，本发明提供的技术方案通过在体外培养细胞过程中通过诱导sympk支架蛋白的表达可促进干细胞的增殖，不影响其分化潜能，不形成胚癌细胞。因此，诱导sympk支架蛋白的表达可以作为一个促进干细胞扩增的技术手段。

附图说明

图1为本发明实施例提供的sympk表达量与强力霉素浓度的关系图；图1显示sympk的表达是剂量依赖强力霉素的；

图2为本发明实施例提供的sympk对干细胞增殖的影响结果；其中，图2a显示表达sympk支架蛋白的细胞克隆的碱性磷酸酶试剂盒染色图，图2b显示sympk过表达增加胚胎干细胞形成克隆的尺寸，图2c显示sympk过表达不影响克隆数目，图2d显示sympk过表达显著促进干细胞增殖；

图3为本发明实施例提供的拟胚体形成实验的分化早期sympk过表达对拟胚体的影响结果；其中，图3a、图3b显示在拟胚体形成实验的分化早期sympk过表达增大拟胚体的尺寸，图3c显示在分化早期sympk过表达不影响不同胚层标志物的表达；

图4为本发明实施例提供的sympk长期诱导表达对胚胎干细胞的影响结果；其中，图4a显示sympk长期诱导表达能持续促进胚胎干细胞增殖，图4b显示p10代细胞多能性标志物免疫荧光结果，图4c显示p10代细胞多能性标志物的westernblot结果，图4d显示p12代细胞多能性标志物免疫荧光结果，图4e显示p12代细胞多能性标志物的westernblot结果；

图5为本发明实施例提供的经sympk长期诱导表达的胚胎干细胞能形成畸胎瘤；其中，图5a显示撤掉强力霉素培养2代后westernblot检测不到外源sympk的表达，图5b显示畸胎瘤实验的流程示意图，图5c显示产生的畸胎瘤分离并进行he染色鉴定出由不同胚层发育而来的组织；

图6为本发明实施例提供的经sympk长期诱导表达的胚胎干细胞能形成嵌合体；其中，图6a显示按照嵌合体形成的技术流程示意图，图6b显示产生嵌合毛色为灰色的嵌合体小鼠，图6d显示嵌合体个数统计，图6c显示分离嵌合体小鼠各个组织提取基因组dna后用微卫星实验检测嵌合组织的分布。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。以下将参照附图，对本发明的实验方法进行详细的描述。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实。

实施例1

一、构建表达sympk支架蛋白的细胞

1)以cd1小鼠睾丸cdna作为模板，通过特异性引物进行pcr扩增，获得全长sympk序列，其中特异性引物序列如下：

fp:catgcgatatcatggcaagcagcagcggggacagt(seqidno.1)，

rp:tgctcgaagcggccgctcagctgttccccttgctctcgggtt(seqidno.2)；

2)将sympk全长序列通过酶切位点ecorv/noti连进3×flag-p2lox；

3)通过转染试剂7.8μllipo2000将质粒1.3μg3×flag-p2loxp-sympk和1.3μgpsolk-cre转到a17细胞；

4)g418筛选10天，挑选克隆，检测sympk外源表达，最后确定表达量较高的克隆(本发明实施例中标记为no.1和no.2)no.1和no.2进行后续的研究。

往上述表达量较高的克隆no.1和no.2分别添加浓度为0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的强力霉素，结果，sympk的表达量高低是依赖强力霉素浓度剂量的，当强力霉素的浓度为0ng/ml，几乎检测不到sympk表达，当强力霉素的浓度为100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml时，sympk表达量与强力霉素浓度呈正比例相关，如图1所示。

二、表达sympk支架蛋白的细胞的克隆形成实验

将两组数目分别为300、600、900的干细胞悬浮液铺在没有明胶包被的六孔板。一组干细胞用添加浓度为1000ng/ml强力霉素干细胞培养基培养至七天，每天都更换新鲜添加浓度为1000ng/ml强力霉素干细胞培养基；另外一组，用不加强力霉素的干细胞培养基同等条件下培养的干细胞作为对照组。培养七天之后，干细胞克隆用碱性磷酸酶试剂盒染色。克隆形成实验包括以下步骤：

1)将两组细胞数目分别为300、600和900的干细胞铺在没有明胶包被的六孔板；

2)一组干细胞用强力霉素浓度为1000ng/ml的干细胞培养基培养至七天；

3)另一组不加强力霉素的干细胞培养基培养至七天；

4)吸走六孔板培养基，用1×pbs洗3遍；

5)按照碱性磷酸酶试剂盒厂家说明进行克隆染色20分钟；

6)吸走染色液，用1×pbs洗1遍，晾干；

7)用扫描仪扫描成像。

结果，与对照组相比，添加强力霉素诱导sympk蛋白过表达，使胚胎干细胞形成克隆的尺寸变大，如图2a、图2b所示，而不影响克隆数目，如图2c所示，并且能显著促进干细胞增殖，如图2d所示。

即，sympk过表达对干细胞的克隆形成能力影响不大，单个克隆的细胞数目增多；说明sympk促进细胞的增殖，且维持干细胞的多能性。

三、拟胚体形成实验

在拟胚体形成实验模拟早期胚胎发育过程中，通过加入强力霉素，使细胞表达sympk支架蛋白，观察并记录拟胚体的尺寸，通过q-pcr检测拟胚体不同胚层标志物的表达。包括以下实验步骤：

1)将培养在60mm培养皿3天的对照组a17wt细胞、表达量较高的a17sympk-3×flagno.1和no.2细胞用t25胰酶消化形成单细胞悬浮液；

2)将2×10⁵个a17wt、a17sympk-3×flagno.1和no.2细胞分别加入到不添加或添加1000ng/ml强力霉素的去除2i/lif干细胞培养基制成20个/μl的细胞悬浮液；

3)以23μl/drop滴在150mm培养皿的皿盖上，将滴好悬浮液的培养皿盖倒扣在有10ml1×pbs的培养皿上，悬浮培养三天形成拟胚体；

4)用1×pbs收集拟胚体至60mm培养皿中，在光学显微镜下随机拍照数张，进行后续的统计分析；

5)将拟胚体转移至ep管，用1mltrizol裂解，提rna，反转，进行后续的qpcr检测。

检测上述步骤4)拍摄所得的照片中的拟胚体尺寸：

a)将光学显微镜下拍摄的照片tiff格式导入到应用软件adobephotoshopcc中，不改变图片本身的尺寸

b)使用标尺工具，长按shift键，测量每个拟胚体的最大的尺寸，测量单位为像素

c)测量a17wt、a17sympk-3×flagno.1和no.2细胞系不同个数的拟胚体，记录不同的拟胚体尺寸

d)将拟胚体尺寸进行统计作图。

结果发现，在分化早期，sympk过表达，可增大拟胚体的尺寸，如图3a所示，横坐标是用adobephotoshopcc标尺工具测量出来的尺寸大小，单位为像素；纵坐标为在特定的尺寸范围内拟胚体数目占拟胚体总数的百分比。如图3b所示，a17wt拟胚体在不加强力霉素的平均尺寸为0.822像素，统计个数为223，加强力霉素的情况下则为0.889像素,统计个数为130，平均尺寸相差甚微；a17sympk-3×flagno.1细胞系形成的拟胚体在不加或加强力霉素的情况下分别为0.554像素和1.051像素，统计个数分别为140和203，平均尺寸相差非常大；a17sympk-3×flagno.2细胞系形成的拟胚体在不加或加强力霉素的情况下分别为0.528像素和0.725像素，统计个数分别为113和227，平均尺寸相差比较大。

通过qpcr检测拟胚体分化形成不同胚层的标志物mrna水平的变化，结果发现内胚层标志物foxa2和sox17的mrna水平相对于对照组不加强力霉素形成的拟胚体分别为1.528和1.20；中胚层标志物goosecoid和brachyury相对于对照组mrna水平的变化为2.53和0.62；外胚层标志物nestin1和mash1相对于对照组mrna水平的变化为0.62和0.92；滋养外胚层标志物hand1和eomes相对于对照组mrna水平的变化为6.76和1.77，结果如图3c所示。

本实施例进一步说明了，本发明提供的方法可以有效促进干细胞增殖，且不影响胚层标记物的表达，不影响干细胞多能性。

插入各个胚层marker的简单说明：

foxa2为肝组织特异性基因的转录激活子；

sox17作为sox家族的一员，参与调控胚胎发育；

goosecoid在小鼠发育中参与调控颅面和胸腔发育；

brachyury在原肠作用中形成转录激活中胚层形成和细胞分化相关的基因；

nestin为神经外胚层干细胞标志物；

mash1bhlh为转录激活家族的一员，与dnae-box结合转录激活，在神经元的形成和分化中扮演重要的角色，也参与形式嗅觉和听觉神经元；

hand1bhlh为转录激活家族的一员，特异性的在滋养层表达，在滋养层肥大细胞的分化中扮演重要角色；

eomes在发育神经元的中间祖细胞中表达量很高，早期发育中调控心脏中胚层的分化。

四、sympk长期诱导表达对胚胎干细胞的影响

将可诱导性表达sympk蛋白的不同细胞系a17sympk-3×flagno.1、no.2和作为阴性对照的可诱导性表达egfp蛋白的细胞系从第5代长期培养至第12代共21天。

1)可诱导性表达sympk蛋白的细胞系a17sympk-3×flagno.1、no.2和对照细胞系a17egfp-3×flag从第5代加强力霉素1000ng/ml一直到第10代共21天，在第11代、第12代撤掉强力霉素继续体外培养干细胞，直至干细胞代谢完全强力霉素。

2)每3天消化可诱导性表达sympk蛋白的不同细胞系a17sympk-3×flagno.1、no.2和对照组可诱导性表达egfp蛋白的细胞系细胞制成细胞悬浮液，用血球计数板对每个样品进行计数3次，作出干细胞生长曲线。

结果如图4a所示，纵坐标为加强力霉素条件下细胞数目与不加强力霉素条件下细胞数目的比值，横坐标为培养的代次。对照组可诱导性表达egfp蛋白的细胞系在加强力霉素的培养条件下呈现比较缓慢的增长趋势，且比值在p10代以前都是在基础值为1以下；而可诱导性表达sympk蛋白的不同细胞系a17sympk-3×flagno.1、no.2的比值在p6代比值就在基础值1以上，随着sympk蛋白持续诱导表达，比值在基础值1以上且能维持稳定的增殖的趋势。在p11代到p12代所有的细胞都在不加强力霉素的条件下培养，对照组可诱导性表达egfp蛋白的细胞系a17egfp-3×flag在p11、p12的比值分别为1.04、1.07；a17sympk-3×flagno.1细胞系在p11、p12的比值分别为1.51、1.50；a17sympk-3×flagno.2细胞系在p11、p12的比值分别为1.25、1.25。基于上述结果分析，a17sympk-3×flagno.1和no.2两个不同的细胞系都能证明持续诱导sympk的表达可以促进干细胞呈一定趋势增殖。

为了检测长时间持续诱导sympk过表达是否会影响干细胞多能性的维持，同时对培养的第10代、第12代的胚胎干细胞进行免疫荧光和westernblot检测。结果表明，多能性标志物nanog、oct4蛋白表达量在细胞水平上几乎没有差异，如图4b所示；p10代的细胞的免疫荧光典型图，是检测细胞长期诱导sympk蛋白的表达对多能性标志物nanog、oct4的影响；进一步，利用westernblot技术手段证明多能性标志物nanog、oct4蛋白表达量在分子水平上几乎没有差异，而外源sympk是可以正常诱导表达的，westernblot结果如图4c所示。

用于临床治疗的干细胞最好能保持最初始的状态，是不能添加强力霉素以及其它的一些化学分子等。因此，将长期诱导sympk过表达的干细胞系a17sympk-3×flagno.1、no.2在不加强力霉素的干细胞培养基中培养2代，使干细胞状态尽可能的恢复的初始正常的水平。最后，我们检测不加强力霉素培养条件下p12代的干细胞系a17sympk-3×flagno.1、no.2在细胞水平上多能性标志物nanog、oct4表现的几乎没有差异，结果如图4d所示；进一步利用westernblot技术从分子水平上检测多能性标志物nanog、oct4蛋白水平没有差异，而外源表达的sympk蛋白用标签抗体flag检测，发现外源表达的sympk蛋白已经被降解，westernblot结果如图4e所示。

综上所述，从细胞水平和分子水平上证明长期持续性诱导sympk表达可以促进干细胞呈一定趋势增殖且不影响干细胞多能性的维持。

五、畸胎瘤实验

对上述步骤四培养所得的p10代、p11代、p12代的a17sympk-3×flagno.1细胞利用westernblot技术手段检测外源sympk的表达量。

结果，撤掉强力霉素的a17sympk-3×flagno.1在p11代、p12代用外源标签蛋白flag抗体检测不到外源sympk的表达，而没撤掉强力霉素的a17sympk-3×flagno.1细胞p10代能用外源标签蛋白flag抗体检测到外源sympk的表达，如图5a所示。

按照畸胎瘤实验的流程示意图，如图5b所示，将恢复初始状态的p12代细胞数目为2×10⁶个a17sympk-3×flagno.1、no.2干细胞和对照组a17wt、a17ctrl干细胞分别注射到5周龄雌性裸鼠肩胛骨两侧，6周之后，检测畸胎瘤的形成能力以及分化特性，并对形成的畸胎瘤分离并进行he染色鉴定。

结果表明：不加强力霉素条件下培养的a17sympk-3×flagno.1、no.2p12代干细胞形成的畸胎瘤和对照组a17wt、a17ctrl干细胞一样能正常分化形成来源3个不同胚层的组织。3个不同的胚层包括外胚层(ectoderm)、中胚层(mesoderm)和内胚层(endoderm)，如图5c所示。

即，sympk表达的干细胞经过快速增殖12代次以后，干细胞的潜能跟正常不表达sympk的细胞的潜能差异不大；撤掉dox培养两代，发现增殖后的细胞与正常细胞基本没用明显的差异，提高了临床应用的安全性。

六、嵌合体实验

1)按照如图6a所示的嵌合体形成的技术流程示意图，准备性成熟的cd1小鼠40只，注射孕马血清促性腺激素(pmsg)以及采用子宫输卵管造影术(hsg)促进其排卵，然后与性成熟的cd1公鼠交配受精，3.5天之后冲胚，获得一定数量e3.5的囊胚；每个囊胚注射数量为12-14个的干细胞，之后，移植到与cd1结扎公鼠交配的之后的假孕鼠；21天之后，假孕鼠产出幼崽；14天左右观察幼仔毛色嵌合的区域：cd1小鼠是黑色的皮毛，a17干细胞是来源于129品系小鼠囊胚内细胞团，129品系小鼠是棕色的，因此产生的嵌合老鼠毛色为灰色，如图6b所示；

将一直在添加强力霉素的干细胞培养基条件下培养至p10代并且撤掉强力霉素培养至p12代的可诱导性表达sympk蛋白的a17sympk-3×flagno.1、no.2细胞系和同种处理的对照组细胞系a17wt中取每种细胞系的12个细胞注射到来源于cd1的e3.5的每个囊胚，并且将注射有干细胞的胚胎移植到与结扎cd1公鼠交配得到的cd1假孕鼠，21天之后产出幼崽，幼崽成长14天观察毛色嵌合情况，如图5b所示，并统计嵌合体个数。统计结果如图6d所示：a17wt、a17sympk-3×flagno.1、no.2细胞系分别注射到97个、93个、94个e3.5囊胚，每个细胞系的囊胚分别移植到12只假孕鼠左侧的单侧子宫内，3个细胞系能正常产出幼仔的母鼠分别只有8只、5只、5只，产出的幼仔总数分别为24只、21只和11只；3个细胞系能形成正常的嵌合体小鼠的数目分别为5只、4只、3只。

观察毛色有嵌合的小鼠，分离嵌合体小鼠各个组织1mg，并用omegatissuednakit(catno.d3396-02)提取基因组dna，设计特异性引物d15mit14进行pcr即微卫星实验，用3％琼脂糖胶检测pcr产物的条带，实验步骤包括：

1)设计特异性引物，其序列如下：

d15mit14fp:gagaggaaaaccatgtcaatcact(seqidno.3)，

d15mit14rp:tcctcttaaaccaagatctctgct(seqidno.4)；

2)将合成的d15mit14引物稀释成100μm；

3)将嵌合体小鼠不同组织的基因组dna稀释成100ng/μl；

4)配制pcr反应体系：

5)pcr反应条件如下：

6)取pcr产物1μl、1μl6×loadinddnabuffer和4μlddh2o混合上样，跑胶电压为120v，50min；

7)取胶，紫外照射仪下拍照。

由于微卫星序列是小片段重复序列，在不同品系的小鼠，d15mit14等位基因的重复序列重复次数不同，嵌合体嵌合组织的基因组dna作为模板得到pcr产物会形成大小不同的2条带。d15mit14等位基因在正常的cd1小鼠组织和来源129品系es细胞中提取基因组dna进行pcr得到的产物条带大小分别为189bp和219bp。在嵌合体嵌合的组织中，既有来源于cd1小鼠的基因组，又有来源129品系es细胞中基因组，因此可以通过观察条带是2条，判断该组织是嵌合的组织。

通过对心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、皮肤、肌肉、脑、卵巢、骨骼、胰腺、肠、子宫、脂肪等基因组dna进行pcr，检测其产物条带是否单一。干细胞来源于a17wt的嵌合体小鼠发生嵌合的组织为心脏、肝脏、肌肉、骨骼和子宫；干细胞来源于a17sympk-3×flagno.1的嵌合体小鼠发生嵌合的组织除了脾脏，其它都有嵌合；细胞来源于a17sympk-3×flagno.2的嵌合体小鼠发生嵌合的组织为心脏、脾脏、肾脏、皮肤和子宫，如图6c所示。

综上结果，干细胞来源于a17wt、a17sympk-3×flagno.1和no.2都能形成部分毛色嵌合和部分组织嵌合的嵌合体小鼠。

本发明实施例的畸胎瘤实验以及嵌合体形成的实验，验证了快速增殖后干细胞体内分化的潜能与对比组正常细胞无差异；即提供了快速增殖后的干细胞应用的全能性和安全性验证数据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中山大学

<120>一种可诱导表达的sympk支架蛋白促进干细胞增殖的方法及应用

<130>2017

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catgcgatatcatggcaagcagcagcggggacagt35

<210>2

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgctcgaagcggccgctcagctgttccccttgctctcgggtt42

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gagaggaaaaccatgtcaatcact24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcctcttaaaccaagatctctgct24