本发明涉及生物技术领域，特别是一种用于筛选噬菌体的前处理方法。
背景技术：
噬菌体（bacteriophage）是一类寄生于细菌、霉形体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等病毒，亦称细菌病毒。在自然界分布极广，凡是有上述各类微生物的地方，都有相应种类噬菌体的存在，其数目与寄主的数量成正比。噬菌体是1915年frederickw.twort及1917年felixd’herelle分别发现的，曾被称为twort-d’herelle现象，之后，国外的研究者进行了探索性研究工作。二十世纪四十年代抗生素的迅速发展，有关噬菌体治疗方面的研究基本处于停滞状态。直到二十世纪末，基于抗生素的滥用而产生耐药菌株和药物残留等问题日益加重，噬菌体的治疗技术又重新受到人们的重视。
噬菌体能与宿主发生特异性结合并注入其dna，如能发生增殖并使宿主细菌迅速裂解引起溶菌反应的噬菌体，称为裂解性或毒性噬菌体；与细菌dna同步复制，并随细菌的分裂而传给后代，不会导致细菌裂解，但在外界条件的刺激下，可从宿主dna中剪接出来，利用宿主细胞内的酶系和蛋白进行自我复制，引起溶菌反应而释放出噬菌体，称为溶源性噬菌体。由于溶源性细菌能抵抗相应烈性噬菌体的溶菌作用，不适合用与持续的噬菌体治疗，所以噬菌体治疗必须选用烈性噬菌体。裂解性噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时十分有效，而且其杀死细菌的机制与抗生素不同，已成为目前抗生素替代品中的研究热点。
目前，噬菌体的筛选工作已经成为噬菌体领域发展的瓶颈问题，特别是对于一些稀有的特殊目标菌株如古细菌、极端条件菌株等，噬菌体的筛选工作异常艰难。另外，噬菌体的筛选效率决定了噬菌体制剂的研发效率，是一款噬菌体制剂有效性的决定因素。现在最常用的噬菌体筛选方案是通过将采集的噬菌体分离原液直接与处于对数生长期的菌液进行混合，使样品中的噬菌体颗粒与其目标菌株结合后进入噬菌体繁殖复制周期，从而达到富集噬菌体的目的。然而，应用该方法进行筛选时，常常由于受到噬菌体分离液体积的限制，无法同时进行多株宿主菌的噬菌体筛选工作。同时，如果降低单次富集的噬菌体分离液的体积则会大大降低噬菌体颗粒与宿主菌接触的概率，降低筛出率。因此，为了满足噬菌体制剂研发过程中大规模高效率的噬菌体筛选工作，亟需一种高通量的噬菌体筛选方案，在不降低筛出率的前提下，提高噬菌体分离液的利用效率，从而提高噬菌体的筛选通量。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种可大大提高噬菌体筛选的通量，提高噬菌体分离原液的利用率，缩短研发周期，加快筛选进程的处理方法。
本发明的技术解决方案是：一种用于筛选噬菌体的前处理方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：
首先，向处于生长对数期的目标菌株发酵液中按照质量百分比添加1~1.5%的海藻酸钠、0.1~0.5%的聚二甲基硅氧烷、1~2%的低聚异麦芽糖和1~5%的钠基膨润土，其中钠基膨润土的蒙脱石含量≥85%，搅拌混匀至完全溶解，
然后，利用滴液发生器将上述溶液滴至1~2%（w/w）的氯化钙溶液中形成微球，并保持微球粒径大小在3~5mm，从氯化钙溶液中回收微球并将其置于真空冷冻干燥机中，干燥至含水量低于1%，
将冻干微球置于噬菌体分离原液中，冻干微球与噬菌体分离原液的质量体积比为1:1g/ml，在28~37℃的条件下孵育12小时，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体分离原液的流动性，
回收微球，并将微球置于研钵中，向研钵中加入pbs溶液，研磨至微球溶解在pbs溶液中，将溶解后的溶液过0.22微米孔径滤膜，收集滤过液，滤过液即为为目标菌株的噬菌体富集液。
所述聚二甲基硅氧烷占目标菌株发酵液质量的0.1%，所述低聚异麦芽糖占目标菌株发酵液质量的2%，所述钠基膨润土占目标菌株发酵液质量的5%。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
本种处理方法，针对传统方法中所存在的种种问题，开创了一种全新的思路。它与传统方法相比，具有以下优点：
1.通过微球包被后冻干的方法可延长目标菌株的保存时间，一次处理后可大量储存于-20℃的环境中，每次操作时直接取出后使用即可，大大简化了操作步骤，提高筛选效率；
2.通过微球包被后的目标菌株，被固定于海藻酸钙凝胶网络中，可通过浓缩菌液的方法，提高微球中目标菌株的浓度，从而提高单位空间中的细菌数量，增大细菌与噬菌体颗粒的接触概率，提高筛出率；
3.通过本方法可针对同一批次的噬菌体分离原液，进行多株目标菌株的筛选，提高原液的利用率同时，还可以大大简化操作步骤；
4.经富集处理后的微球后可再次经冷冻干燥处理，增加富集后微球的保存时间，可将多批次富集后微球一起处理，简化操作同时提高效率。
综上所述，可以说本方法具备了多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场前景十分广阔。
具体实施方式
下面将说明本发明的具体实施方式。
一种用于筛选噬菌体的前处理方法，按照以下步骤进行：
首先，向处于生长对数期的目标菌株发酵液中按照质量百分比添加1~1.5%的海藻酸钠、0.1~0.5%的聚二甲基硅氧烷（优选为0.1%）、1~2%的低聚异麦芽糖（优选为2%）和1~5%的钠基膨润土（优选为5%），其中钠基膨润土的蒙脱石含量≥85%，搅拌混匀至完全溶解，
然后，利用滴液发生器将上述溶液滴至1~2%（w/w）的氯化钙溶液中形成微球，并保持微球粒径大小在3~5mm，从氯化钙溶液中回收微球并将其置于真空冷冻干燥机中，干燥至含水量低于1%，
将冻干微球置于噬菌体分离原液中，冻干微球与噬菌体分离原液的质量体积比为1:1g/ml，在28~37℃的条件下孵育12小时，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体分离原液的流动性，
回收微球，并将微球置于研钵中，向研钵中加入pbs溶液，研磨至微球溶解在pbs溶液中，将溶解后的溶液过0.22微米孔径滤膜，收集滤过液，滤过液即为为目标菌株的噬菌体富集液。
具体实施例
（一）噬菌体分离原液的采集及处理
取来自城市排污口废水样品500ml，经8000×g离心处理后，回收上清液，并向其中加入cacl2、mgcl2，使其终浓度为1mol/l；将上述经过预处理的水样，在10000×g的条件下离心5min，收集上清；将上清过0.22μm滤膜，除菌体、杂质等其他成分，即得噬菌体原液；
（二）目标菌株微球的制备
96株不同来源的大肠杆菌宿主菌经37℃过夜培养，挑取单个菌落，接种于lb液体培养基中，37℃振荡培养8h；向菌株培养液中按照质量百分比添加1.5%海藻酸钠、0.1%聚二甲基硅氧烷、2%低聚异麦芽糖和5%钠基膨润土，搅拌混匀至完全溶解；使用滴液发生器将上述溶液滴至2%（w/w）氯化钙溶液中形成微球，保持微球粒径大小在3~5mm，回收微球置于真空冷冻干燥机，干燥至含水量低于1%；
（三）应用微球对噬菌体原液进行筛选前处理
将3g上述冻干微球放置于200目球形网兜（直径3cm）中，制作成96个球形网兜，每个网兜里面为一种大肠杆菌菌株；将所有网兜置于噬菌体分离原液中，保持37℃孵育12个小时，同时使用磁力搅拌器保持噬菌体原液的流动性；回收微球至研钵中加入pbs溶液研磨至溶解，将溶解后的溶液过0.22微米孔径滤膜，收集滤过液为目标菌株的噬菌体富集液，用于后续噬菌体的纯化工作。
（四）噬菌体的筛选
采用双层平板法进行噬菌体的鉴定，下层为1.5%琼脂的lb固体培养基，上层为0.5%琼脂lb培养基，将上层培养基加热溶解，放置于55℃的水浴锅中待用，取上一步骤所述的噬菌体富集液500μl加入至1ml宿主菌中，将二者混合物加入至5ml预热的上层培养基中立刻平铺至下层培养基上，待凝固后，倒置37℃培养24h后观察有无噬菌斑形成。如果在平板上形成空斑则说明在滤液内有针对该宿主菌的裂解性噬菌体存在。