一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法与流程

本发明属于分子生物学实验
技术领域：
，具体地，涉及一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法。
背景技术：
：镰刀菌(fusariumspp.)在无性时期属于半知菌亚门，有性时期属于子囊菌亚门。目前，已发现的镰刀菌不少于44种。镰刀菌属于兼寄生或腐生生活，在全世界分布广泛，可动植物有机体上生长，会引起植物的根、茎和花等组织的腐烂，严重影响了粮食、经济作物以及药用植物的产量和品质，具有较高的危害性。镰刀菌属是真菌中较大的一个属，为丝状真菌，广泛分布于自然界中。镰刀菌可以侵染多种植物，如粮食作物、油料作物、经济作物等，造成严重的产量损失。镰刀菌及其引起的病害防控一直是国内外的研究热点。随着全球气候的变化及耕作制度的改变，频繁的国际贸易活动、适宜的温湿度、广泛的传播途径和有利的寄主等使得镰刀菌迅速地跨地区传播，镰刀菌的种群结构在全球范围内发生了显著变化。镰刀菌种类鉴定是开展其生物多样性研究、病害防控及植物检验检疫等工作的基础，开发镰刀菌鉴定新方法是目前的迫切需求。由于镰刀菌种类多，分布广，传统的形态学分类方法很难准确对其进行鉴定，利用分子生物学的技术，从分子层面对镰刀菌进行鉴定，不仅速度快，而且鉴定结果准确，为镰刀菌的分类研究提供有效方法。不同种类镰刀菌翻译延伸因子基因(translationelongationfactor1α，tef)具有高度的保守性，tef基因测序比对分析能准确鉴定镰刀菌，目前已建立了专门的镰刀菌tef基因序列数据库。以前有研究者基于里氏木霉(trichodermareesei)和荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)的tef基因序列(genbank检索号分别为z23012和u14100)设计了用于扩增丝状真菌tef基因的简并引物对：ef-1(5'-atgggtaagga(a/g)gacaagac-3')和ef-2(5'-gga(g/a)gtaccagt(g/c)atcatgtt-3')(o'donnellk.,kistlerh.c.,cigelnike.,ploetzr.multipleevolutionaryoriginsofthefunguscausingpanamadiseaseofbanana:concordantevidencefromnuclearandmitochondrialgenegenealogies.pnas,1998,95:2044-2049，在此全文引入作为参考)，该引物对在大多数丝状真菌鉴定中起到很好的作用。但是，利用引物对ef-1/2进行镰刀菌基因组扩增时经常出现扩增失败或有杂带的情况，说明该引物对的使用具有一定的局限性，可能对某些菌种不适用。值得注意的是，引物对ef-1/2是根据里氏木霉(trichodermareesei)和荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)的基因序列设计开发的，引物设计的位置可能在镰刀菌基因组中是不保守的。技术实现要素：为了解决上述技术问题，发明人对10种镰刀菌的tef基因序列进行比对分析，结果发现，意外地发现，引物ef-1第15位碱基c在多数镰刀菌基因组中为g，这说明引物ef-1并不适用于多数镰刀菌。因此，本发明通过对不同种镰刀菌tef基因序列比对分析，找到保守序列，设计了高特异性扩增镰刀菌tef基因的引物对，通过对扩增片段进行测序，然后进行数据库比对分析，从而完成本发明对镰刀菌准确鉴定的目的。为此，本发明一方面提供了一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合，包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种，其中，第一引物组包括具有seqidno.1所示核苷酸序列的上游引物tef-1f和具有seqidno.2所示核苷酸序列的下游引物tef-2r；第二引物组包括具有seqidno.1所示核苷酸序列的上游引物tef-1f和具有seqidno.3所示核苷酸序列的下游引物tef-3r；第三引物组包括具有seqidno.4所示核苷酸序列的上游引物ef-lf1和具有seqidno.5所示核苷酸序列的下游引物ef-lr1；第四引物组包括具有seqidno.4所示核苷酸序列的上游引物ef-lf1和具有seqidno.6所示核苷酸序列的下游引物ef-lr2。在本发明一些实施方案中，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组。在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组。在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第二引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组和第四引物组。在本发明的一些实施方案中，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第三引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第四引物组。在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组和第三引物组，在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组和第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第二引物组和第三引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第二引物组和第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第三引物组和第四引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组包括第二引物组、第三引物组和第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和第四引物组。在本发明的实施方案中，如果引物组合中同时包括第一引物组和第二引物组，或同时包括第三引物组和第四引物组，则其中共有上游引物的含量或浓度是下游引物的至少2倍。本发明的第二方面提供一种快速鉴定镰刀菌菌种的方法，包括以下步骤：获取待鉴定镰刀菌的基因组dna；以所述dna为模板，利用本发明第一方面的引物组合进行pcr扩增；将扩增产物进行凝胶电泳检测，并将目标pcr产物进行测序；将测序结果通过blast比对，如果测序结果的序列与参考镰刀菌的相似性不低于98％，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。其中，相似性不低于98％例如98％、99％、100％。在本发明一些实施方案中，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组。在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组。在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第二引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组和第四引物组。在本发明的一些实施方案中，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第三引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第四引物组。在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组和第三引物组，在本发明的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组和第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第二引物组和第三引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第二引物组和第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第三引物组和第四引物组。在本发明的另一些具体实施方案中，所述引物组包括第二引物组、第三引物组和第四引物组。在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和第四引物组。在本发明的实施方案中，如果引物组合中同时包括第一引物组和第二引物组，或同时包括第三引物组和第四引物组，则pcr反应体系中共有上游引物的含量或浓度是下游引物的2倍。在本发明的实施方案中，如果引物组合中包括的引物组不止一个，则相应的扩增片段也不止一个。那么，如果测序结果中的至少一个序列与参考镰刀菌的相似性不低于98％，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。在本发明的实施方案中，如果引物组合中包括的引物组不止一个，则相应的扩增片段也不止一个。那么，如果测序结果中的至少一个序列与参考镰刀菌的相似不低于98％，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。在本发明的实施方案中，如果引物组合中包括的引物组不止一个，则相应的扩增片段也不止一个。那么，如果测序结果中的所有序列均与参考镰刀菌的相似性超过98％，则待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。在本发明中，所述参考镰刀菌为已知的被鉴定到种的镰刀属镰刀菌。在发明的一些具体实话方案中，其中pcr扩增的体系为：总体积50μl：含mg2+的5×pcrbuffer10μl，10mmol/ldntps4μl，10μmol/l上游引物1μl，10μmol/l下游引物1μl，5u/μlkd酶1μl，dna模板50ng，ddh2o补至50μl。在发明的一些具体实话方案中，其中pcr扩增的程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃复性40s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸5min。本发明的有益效果本发明的引物组合重复性好，特异性高。本发明的方法准确性高，操作简单，适用于镰刀菌菌种的快速鉴定。使用本发明可快速、准确地对镰刀菌菌株进行鉴定，因而对其实施田间针对性防治、开展生物多样性研究及植物检验检疫等具有重要意义。附图说明图1示出了引物tef-1f和tef-2r对14份镰刀菌dna的扩增产物电泳图；图2示出了引物tef-1f和tef-3r对14份镰刀菌dna的扩增产物电泳图；图3示出了引物ef-lf1和ef-lr1对14份镰刀菌dna的扩增产物电泳图；图4示出了引物ef-lf1和ef-lr2对14份镰刀菌dna的扩增产物电泳图。具体实施方式为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。实施例以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。实施例11材料与仪器实验材料为14份镰刀菌待鉴定样品(具体信息见表1)，其中菌株ph-1是已经完成基因组测序(基因组登录号aacm02000000)(cuomoetal.,thefusariumgraminearumgenomerevealsalinkbetweenlocalizedpolymorphismandpathogenspecialization.science,2007,317:1400-1402)的阳性对照，属于fusariumgraminearum。实验材料均由上海市农业科学院提供。实验仪器主要有水浴锅、高速离心机、nanodrop2000、pcr仪、琼脂糖凝胶电泳仪、紫外凝胶成像仪。pcr产物核酸序列测序由上海生工生物公司完成。表1镰刀菌的种类及来源编号形态鉴定所属种分子鉴定结果分离来源1fusariumgraminearum(ph-1)fusariumgraminearum美国2fusariumavenaceumfusariumavenaceum上海3fusariumlateritiumfusariumlateritium上海4fusariumoxysporumfusariumoxysporum山东5fusariumproliferatumfusariumproliferatum山东6fusariumsaccharifusariumsacchari山东7fusariumsolanifusariumsolani上海8fusariumequisetifusariumequiseti上海9fusariumasiaticumfusariumasiaticum湖北10fusariumkyushuensefusariumkyushuense安徽11fusariumacuminatumfusariumacuminatum陕西12fusariumfujikuroifusariumfujikuroi河南13fusariumverticillioidesfusariumverticillioides湖北14fusariumconcentricumfusariumconcentricum湖北2镰刀菌培养将14份镰刀菌菌株(表1)接种到pda培养基上，26℃培养三天，观察镰刀菌菌丝量，当菌丝量满足基因组dna提取量后即可进行后续实验。3镰刀菌基因组dna的快速提取利用发明人发明的基因组dna快速提取方法提取镰刀菌基因组dna，详细步骤如下：溶液a：50mmtris-hcl，50mmedta，10％sds，2mnacl，n-月桂酰肌氨酸钠3g/100ml；溶液b：3mnaac，ph5.2；溶液c：异丙醇；溶液d：75％的乙醇；溶液e：含有50μg/mlrna酶的ddh2o。(1)分取20～50mg镰刀菌的菌丝，加入至1.5ml离心管中，(2)加入400μl的溶液a；(3)在94℃下水浴加热10min，每隔3min颠倒混匀一次；(4)冷却至室温后，12000rpm离心1min，取上清液350μl至新的离心管中；(5)加入35μl的溶液b，颠倒混匀，加入350μl溶液c，颠倒混匀，室温放置2min；(6)将750μl混合液全部转移至吸附柱中，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；(7)在吸附柱中加入650μl溶液d，9000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，9000rpm再次离心30s，将吸附柱转移至新的离心管中，打开吸附柱盖子，室温放置2min；(8)向吸附柱中加入30μl50℃预热的溶液e，静置3min后，12000rpm离心1min，获得真菌基因组dna，-20℃保存。4特异性引物的pcr扩增反应将上述方法提取的14份镰刀菌基因组dna稀释至100ng/μl作为模板，用tef-1f和tef-2r、tef-1f和tef-3r、ef-lf1和ef-lr1、ef-lf1和ef-lr2四对引物分别对14份镰刀菌dna进行pcr扩增。其中，各引物的序列(5'-3')如下：tef-1f：cttaacgtcgtcgtcatcg(seqidno.1)tef-2r：cacttggtggtgtccatctt(seqidno.2)tef-3r：ttgtagccgaccttcttgat(seqidno.3)ef-lf1：ccttaacgtcgtcgtcatcg(seqidno.4)ef-lr1：acggacttgacttcagtggt(seqidno.5)ef-lr2：gagctgctcgtggtgcatct(seqidno.6)用tef-1f，tef-2r和tef-1f，tef-3r两对引物对镰刀菌基因组dna进行pcr，可获得大约860bp扩增片段；用ef-lf1，ef-lr1和ef-lf1，ef-lr2两对引物进行扩增，可获得大约1300bp扩增片段。pcr体系和反应程序如下：pcr扩增体系(总体积50μl)：5×pcrbuffer(含mg2+)10μl，10mmol/ldntps4μl，10μmol/l上游引物1μl，10μmol/l下游引物1μl，5u/μlkd酶1μl，dna模板(50ng/μl)1μl，ddh2o32μl。pcr扩增时以水代替dna模板为阴性对照。pcr反应程序为：94℃预变性2min；35个循环(94℃变性30s，60℃复性40s，72℃延伸90s)；最后72℃延伸5min。5pcr产物的琼脂糖凝胶检测准确称取1.2g琼脂糖于锥形瓶中，加入100mltae缓冲液摇匀，置于微波炉中加热至琼脂糖全部融化，加入gelstain核酸染液，摇匀后，倒入凝胶板中，室温放置20min至凝固。取3μlpcr扩增产物上样，150v恒压电泳30min，在凝胶成像仪下观察是否为单一明亮条带。6目的片段的测序将条带单一且明亮的pcr产物送至测序公司测序，获得碱基序列后，在ncbigenbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、fusarium-id(http://www.fusariumdb.org/index.php)和fusariummlstdatabase(http://www.westerdijkinstitute.nl/fusarium/)网站进行blast碱基序列比对，以三个数据库比对结果相似性最高的为准，从而确定该镰刀菌的菌种。经过测序，菌株1(fusariumgraminearumph-1)利用引物tef-1f和tef-2r扩增后的测序结果如下(seqidno.7)：cttaacgtcgtcgtcatcggccacgtcgactctggcaagtcgaccactgtgagtaccaccgcatcccaaccccgccgacacttggcggggtagtttcaaatttccaatgtgctgacatactttgatagaccggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttggtctcattttcctcgatcgcgcgccctttccctttcgaaatatcattcgaatcgccctcacacgacgactcgatacgcgcctgttaccccgctcgaggtcaaaaattttgcggctttgtcgtaatttttttcccggtggggctcataccccgccactcgagcgacaggcgtctgccctcttcccacaaaccattccctgggcgctcatcatcacgtgtcaaccagtcactaaccacctgtcaataggaagccgccgagctcggtaagggttccttcaagtacgcctgggttcttgacaagctcaaagccgagcgtgagcgtggtatcaccattgatatcgccctctggaagttcgagactcctcgctactatgtcaccgtcattggtatgttgtcaccactgctgtcatcacattctcatactaacatggctatcagacgctcccggtcaccgtgatttcatcaagaacatgatcactggtacttcccaggccgattgcgccattctcatcattgccgccggtactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctccttgcctacacccttggtgtcaagaacctcattgttgccatcaacaagatggacaccaccaagtg菌株2利用引物ef-lf1和ef-lr2扩增后的测序结果如下(seqidno.8)：ggggagtcacggggcagtcgaccactgtaagtacaaccatctgcgagtcgcttatctgcactcggaacccgtcagatttggcggggtatcaccgcaacatcttgctaactcttgacagaccggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaacccatcgaggaagttcgaggaaggttagtcaatatccctttcgattacgcgcgctcccatcgattcccacgactcgctccctcattcgaaacgcatccattaccccgctcgagcccgaaaattttgcggtgcgaccgtgatttttttggtggggtatcttaccccgccactcgagtgacggatgcgcttgccctgttcccacaaaaccctaccacactgttgcgcactatgtcttgcagtcactaaccactggacaataggaagccgccgagctcggaaagggttccttcaagtacgcctgggttcttgacaagctcaaagccgagcgtgagcgtggtatcaccattgatatcgctctctggaagttcgagactcctcgctactatgtcaccgtcattggtatgttgtcaccgtctcacaccaccatgtcttcatcatgctaacatccctctcagatgcccccggtcatcgtgatttcatcaagaacatgattactggtacttcccaggctgattgtgccattctcatcattgccgccggtactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctcttcttgcctacacccttggtgtcaagaacctcatcgtcgccatcaacaagatggacaccaccaagtggtctgaggcccgttaccaggagatcatcaaggagacctcctctttcatcaagaaggtcggctacaaccccaaggctgtcgctttcgtccccatctccggtttcaacggtgacaacatgcttgctgcctccaccaactgcccctggtacaagggatgggagcgtgagatcaagtccggcaagctctccggaaagaccctccttgaggccatcgactccatcgagccccccaagcgccccaacgacaagcccctccgacttcccctccaggatgtctacaagattggtggtattggaacggttcctgtcggccgtatcgagactggtatcatcaagcccggtatggtcgtcaccttcgcccctgctggcgtaccacgagactctac菌株3利用引物tef-1f和tef-3r扩增后的测序结果如下(seqidno.9)：actgtgagtactaccctctcgacaatgtgcttatctgcatacgtcaaaacccgccagagaccggcgaggtatttcacagtcacatcgtgctgacagctttggatagaccggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttggtccatttctcccccgatcgcgcgccctttgcccatcgatttgtccttcgaatcgctacctcacgactcgcatgcgcccattaccccgctcgagctcaaaattttgcggtgcaaccgtaattttttttttcggtggggcatcacaccccgccactcgagcgatgggcgcttgccctggtcccagcacacaaaactcaatacccattccaggcgcgcgtcatcatgtgatcgaaagttgctaaccaccatcgacaataggaagccgccgagctcggaaagggttctttcaagtacgcctgggttcttgacaagctcaaagccgagcgtgagcgtggtatcaccatcgacattgccctgtggaagttcgagactccccgctactatgtcaccgtcattggtatgttgtcactactgttctcattcacacgcgtcatctaacacatcacacagacgctcccggccaccgtgacttcatcaagaacatgatcactggtacttcccaggccgactgcgctattctcatcattgctgccggtactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctccttgcctacacccttggtgtcaagaacctcattgtcgccatcaacaagatggacaccaccaagtggtctgaggcccgttaccaggagatcatcaaggagacctcctctttcatcaagaaggtcggctacaa菌株9利用引物ef-lf1和ef-lr1扩增后的测序结果如下(seqidno.10)：cccccttggcagtcgacactgtgagtaccaccgcatcccaaccccgccgacacttggcggggtagtttcaaatttccaatgtgctgacatactttgatagaccggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttggtctcattttcctcgatcgcgcgcccttttcctttcgaaatatcattcgaatcgcactcacacgacgactcgatacgcgcctgttaccccgctcgaggtcaaaaattttgcggctttgtcgtaattttttttcctagtggggctcataccccgccactcgagcgacaggcgtttgccctcttcacacaaaccattccctgggcgctcatcatcacgtgtcaaccagtcactaaccacctgtcaataggaagccgccgagctcggtaagggttccttcaagtacgcctgggttcttgacaagctcaaagccgagcgtgagcgtggtatcaccattgatatcgccctctggaagttcgagactcctcgctactatgtcaccgtcattggtatgttgtcaccactgctgtcatcacattctcatactaacatggctatcagacgctcccggtcaccgtgatttcatcaagaacatgatcactggtacttcccaggccgattgcgccattctcatcattgccgccggtactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctccttgcctacacccttggtgtcaagaacctcattgttgccatcaacaagatggacaccaccaagtggtctgaggcccgttaccaggagatcatcaaggagacctcttctttcatcaagaaggtcggctacaaccctaaggctgtcgctttcgtccccatctccggtttcaacggtgacaacatgcttactgcctccaccaactgcccctggtacaagggttgggagcgtgagatcaagtctggcaagctctccggaaagaccctccttgaggccattgactccatcgagccccccaagcgtcccaacgacaagcccctccgacttcccctccaggatgtctacaagattggcggtattggaacggttcctgtcggccgtatcgagactggtgtcatcaagcccggtatggtcgttaccttcgctcctccaactcaccacgattacctcccg上述序列通过在fusariummlstdatabase或ncbigenbank进行blast后，比对结果如表2所示。表2镰刀菌的分子鉴定结果在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海市农业科学院<120>一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法<130>xy-2019-1-w-002<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cttaacgtcgtcgtcatcg19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cacttggtggtgtccatctt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ttgtagccgaccttcttgat20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccttaacgtcgtcgtcatcg20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5acggacttgacttcagtggt20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gagctgctcgtggtgcatct20<210>7<211>799<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gccacgtcgactctggcaagtcgaccactgtgagtaccaccgcatcccaaccccgccgac60acttggcggggtagtttcaaatttccaatgtgctgacatactttgatagaccggtcactt120gatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttggtct180cattttcctcgatcgcgcgccctttccctttcgaaatatcattcgaatcgccctcacacg240acgactcgatacgcgcctgttaccccgctcgaggtcaaaaattttgcggctttgtcgtaa300tttttttcccggtggggctcataccccgccactcgagcgacaggcgtctgccctcttccc360acaaaccattccctgggcgctcatcatcacgtgtcaaccagtcactaaccacctgtcaat420aggaagccgccgagctcggtaagggttccttcaagtacgcctgggttcttgacaagctca480aagccgagcgtgagcgtggtatcaccattgatatcgccctctggaagttcgagactcctc540gctactatgtcaccgtcattggtatgttgtcaccactgctgtcatcacattctcatacta600acatggctatcagacgctcccggtcaccgtgatttcatcaagaacatgatcactggtact660tcccaggccgattgcgccattctcatcattgccgccggtactggtgagttcgaggctggt720atctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctccttgcctacacccttggtgtcaag780aacctcattgttgccatca799<210>8<211>1208<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggggagtcacggggcagtcgaccactgtaagtacaaccatctgcgagtcgcttatctgca60ctcggaacccgtcagatttggcggggtatcaccgcaacatcttgctaactcttgacagac120cggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaacccatcgaggaagttcgag180gaaggttagtcaatatccctttcgattacgcgcgctcccatcgattcccacgactcgctc240cctcattcgaaacgcatccattaccccgctcgagcccgaaaattttgcggtgcgaccgtg300atttttttggtggggtatcttaccccgccactcgagtgacggatgcgcttgccctgttcc360cacaaaaccctaccacactgttgcgcactatgtcttgcagtcactaaccactggacaata420ggaagccgccgagctcggaaagggttccttcaagtacgcctgggttcttgacaagctcaa480agccgagcgtgagcgtggtatcaccattgatatcgctctctggaagttcgagactcctcg540ctactatgtcaccgtcattggtatgttgtcaccgtctcacaccaccatgtcttcatcatg600ctaacatccctctcagatgcccccggtcatcgtgatttcatcaagaacatgattactggt660acttcccaggctgattgtgccattctcatcattgccgccggtactggtgagttcgaggct720ggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctcttcttgcctacacccttggtgtc780aagaacctcatcgtcgccatcaacaagatggacaccaccaagtggtctgaggcccgttac840caggagatcatcaaggagacctcctctttcatcaagaaggtcggctacaaccccaaggct900gtcgctttcgtccccatctccggtttcaacggtgacaacatgcttgctgcctccaccaac960tgcccctggtacaagggatgggagcgtgagatcaagtccggcaagctctccggaaagacc1020ctccttgaggccatcgactccatcgagccccccaagcgccccaacgacaagcccctccga1080cttcccctccaggatgtctacaagattggtggtattggaacggttcctgtcggccgtatc1140gagactggtatcatcaagcccggtatggtcgtcaccttcgcccctgctggcgtaccacga1200gactctac1208<210>9<211>645<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gacaatgtgcttatctgcatacgtcaaaacccgccagagaccggcgaggtatttcacagt60cacatcgtgctgacagctttggatagaccggtcacttgatctaccagtgcggtggtatcg120acaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttggtccatttctcccccgatcgcgcgccc180tttgcccatcgatttgtccttcgaatcgctacctcacgactcgcatgcgcccattacccc240gctcgagctcaaaattttgcggtgcaaccgtaattttttttttcggtggggcatcacacc300ccgccactcgagcgatgggcgcttgccctggtcccagcacacaaaactcaatacccattc360caggcgcgcgtcatcatgtgatcgaaagttgctaaccaccatcgacaataggaagccgcc420gagctcggaaagggttctttcaagtacgcctgggttcttgacaagctcaaagccgagcgt480gagcgtggtatcaccatcgacattgccctgtggaagttcgagactccccgctactatgtc540accgtcattggtatgttgtcactactgttctcattcacacgcgtcatctaacacatcaca600cagacgctcccggccaccgtgacttcatcaagaacatgatcactg645<210>10<211>800<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gccacgtcgactctggcaagtcgaccactgtgagtaccaccgcatcccaaccccgccgac60acttggcggggtagtttcaaatttccaatgtgctgacatactttgatagaccggtcactt120gatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttggtct180cattttcctcgatcgcgcgcccttttcctttcgaaatatcattcgaatcgcactcacacg240acgactcgatacgcgcctgttaccccgctcgaggtcaaaaattttgcggctttgtcgtaa300tttttttccctggtggggctcataccccgccactcgagcgacaggcgtttgccctcttcc360cacaaaccgttccctgggcgctcatcatcacgtgtcaaccagtcactaaccacctgtcaa420taggaagccgccgagctcggtaagggttccttcaagtacgcctgggttcttgacaagctc480aaagccgagcgtgagcgtggtatcaccattgatatcgccctctggaagttcgagactcct540cgctactatgtcaccgtcattggtatgttgtcaccactgctgtcatcacattctcatact600aacatggctatcagacgctcccggtcaccgtgatttcatcaagaacatgatcactggtac660ttcccaggccgattgcgccattctcatcattgccgccggtactggtgagttcgaggctgg720tatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctccttgcctacacccttggtgtcaa780gaacctcattgttgccatca800当前第1页12