用于检测黄瓜果肉颜色的SNP标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别涉及一种用于检测黄瓜果肉颜色的snp标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。

背景技术：

黄瓜是我国第一大设施蔬菜，果肉颜色是重要的品质性状，其中绿色果肉的黄瓜因其颜色漂亮，食用营养价值更高而更加受到消费者欢迎。黄瓜果肉颜色多呈白色、白绿、浅绿、黄绿和橙色，实际生产中，栽培黄瓜果肉颜色主要呈现为白色和绿色，主要由于叶绿素含量不同而导致颜色差异。绿色果肉的黄瓜叶绿素含量更高，营养价值较白色果肉的黄瓜更高，且色泽鲜艳，因此选育绿色果肉的黄瓜品种对丰富蔬菜市场、提高黄瓜的商品性及农民增收具有重要意义。

目前，国内外学者对黄瓜果肉颜色遗传规律研究较多，但由于所用试验材料不同而得出不同的实验结果。1971年，kooistra等研究发现黄瓜果肉颜色由v和w两对基因控制，若两对基因均是隐性基因，则果肉颜色为橙黄色；若均为显性，则果肉颜色为白色。1983年，戚春章等认为西双版纳黄瓜的橙黄果肉对普通栽培黄瓜的白色果肉是显性性状。1992年，peterson等认为控制版纳黄瓜果肉颜色的基因为wf和yf，其中wf表现为白色，yf表现为黄色，wfwf和yfyf杂交后代为白色：黄色：橙色＝12:3:1。李博等(2010)以绿色果肉和白色果肉作为双亲配制f2代进行遗传分析，发现果肉颜色属于数量性状，以显性效应为主，有一定加性效应。沈镝等(2011)以橙黄果肉的版纳黄瓜和浅肉色栽培黄瓜杂交，发现果肉颜色的遗传规律为两对主基因+多基因模型。迄今为止，关于黄瓜果肉颜色qtl研究很少，仅沈镝(2009)对黄瓜果肉颜色进行了定位，共检测到8个与果肉颜色相关的qtl位点，位于黄瓜第4，5，6和7号染色体上。其中主效qtlβcc4a位于ssr03952和ssr05899两个标记之间，峰值位置为5.0cm，lod值为7.26，贡献率达52.8％；李博(2010)检测到1个与果肉颜色相关的qtl位点，位于标记cswct29-cswgca01之间，距离cswct29较近，距离为6.01cm，lod值为3.36，贡献率为11.86％。由此可见，目前报道的与黄瓜果肉颜色连锁的标记只有ssr标记，并未见其他类型标记(如indel、snp等)的研究，关于利用全基因组关联分析(gwas)进行果肉颜色定位的研究尚未见报道。

技术实现要素：

基于上述领域存在的不足，本发明提供一种与黄瓜果肉颜色基因紧密连锁的snp标记，并提供了该标记在筛选黄瓜绿色果肉或白色果肉的黄瓜种质资源中的应用。

本发明的技术方案如下：

用于检测黄瓜果肉颜色的snp标记的引物，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如下：

snpffc-10-f：5’-ttgggacgtttatggactt-3’；

snpffc-10-r：5’-gtcacaagaatagtgtcagt-3’；

所述引物扩增的与黄瓜绿色果肉基因连锁的特征条带的核苷酸序列如seqidno.1所示，序列的第73位碱基为a；

所述引物扩增的与黄瓜白色果肉基因连锁的特征条带的核苷酸序列如seqidno.2所示，序列的第73位碱基为g。

一种筛选具有绿色果肉特征的黄瓜种质资源的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组dna；

(2)以所述基因组dna为模板，以所述引物进行pcr扩增；

(3)对pcr扩增产物进行测序或taqⅰ酶切；

如果测序结果如seqidno.1所示，则待测样品为黄瓜绿色果肉材料，如果测序结果如seqidno.2所示，则待测样品为黄瓜白色果肉材料；

如果酶切产物包含一条232bp主带和一条72bp主带，则待测样品为黄瓜绿色果肉材料；如果酶切产物包含一条302bp主带，则待测样品为黄瓜白色果肉材料。

优选地，所述pcr扩增的反应体系为:1.5ng/μl基因组dna，引物snpffc-10-f/snpffc-10-r各5ng/μl，0.5μl/μlgogreenmastermix，其余为双蒸水。

优选地，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

优选地，所述taqⅰ酶切的体系为：8μlpcr扩增产物，2μl10×cutsmartbuffer，0.4μltaqⅰ限制性内切酶，9.6μl双蒸水；酶切条件为：65℃酶切2h后，80℃热失活20min。

用于筛选具有绿色果肉特征的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于：包括粉状或液态的所述引物。

优选地，所述试剂盒还包括taqⅰ酶。

优选地，所述试剂盒还包括pcr反应和/或电泳所需的试剂。

任一所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括合成所述引物并包装为试剂盒的一部分的步骤。

优选地，所述制备方法还包括组装pcr反应和/或电泳所需的试剂。

本发明以中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组的74份核心种质为试验材料，利用其基因型数据及鉴定所得表型数据，进行全基因组关联分析(gwas)，获得了与黄瓜果肉颜色紧密相关的snp位点snpffc-10，发现在绿色果肉黄瓜‘9110gt’的基因组中，该位点的碱基为a；在白色果肉黄瓜pi183967的基因组中，该位点的碱基为g。以‘9110gt’和pi183967两亲本构建的含78个株系的f2代群体为材料进行验证，结果表明snpffc-10验证的正确率为91.0％。本发明不仅为黄瓜绿色果肉基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育绿色果肉的新品种提供了高效的途径。

本发明基于开发的snp标记引物提供一种用于辅助筛选具有特定绿色果肉黄瓜新品种的方法，采用所述snpffc-10标记的特异性引物扩增待测材料的基因组dna，然后对扩增产物进行酶切电泳检测，若酶切产物包含一条232bp主带和一条72bp主带，则待测样品为绿色果肉黄瓜材料；若酶切产物包含一条302bp主带，则待测样品为白色果肉黄瓜材料。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行果肉颜色鉴定和筛选，具有效率高、限制少、准确性高的优点。

附图说明

图1.采用本发明的snpffc-10标记的特异性引物验证黄瓜材料所获得的基因片段对比图；其中，fc代表绿色果肉材料，fc代表白色果肉材料，第73个碱基a处为酶切位点。

图2.采用本发明的snpffc-10标记的特异性引物对不同黄瓜材料的基因组dna进行pcr扩增，所得pcr产物经酶切反应后的电泳检测结果；其中，‘a’代表绿色果肉材料，‘b’代表白色果肉材料，‘h’代表中间型材料。72bp的主带因片段过小，已从电泳道跑出，故仅能看到一条232bp主带。用下划线标记的字母对应的泳道为田间表型与标记条带验证不一致的单株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。

生物材料的来源和记载出处

用于snp标记开发的试验材料为中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组的74份核心种质，其中包括华北类型，欧洲温室类型，以及华北类型和欧洲温室类型的杂交种。74份核心种质为现有已知品种，在刘盼娜等人于2015年3月在《植物遗传资源学报》发表的文章《黄瓜核心种质遗传多样性的苗期和初花期形态标记分析》中有记载。本实验室亦有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

74份核心种质

本研究所用的验证材料是黄瓜绿色果肉品种‘9110gt’，黄瓜白色果肉品种pi183967，以‘9110gt’为母本、以pi183967为父本杂交获得的f1代以及自交获得的含78个株系的f2代群体。本实验室亦有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

9110gt(p1)：具有欧洲温室型遗传背景的华北密刺型黄瓜高的自交系，生长势强，叶片较大，果皮绿色，果肉绿色，果实多刺，白色果刺，无果瘤。为现有已知品种，在hanmiao等人于2011年4月在《euphytica》发表的文章《alinkagemapofcultivatedcucumberwith248microsatellitemarkerlociandsevengenesforhorticulturallyimportanttraits》中也有记载。

pi183967(p2)：野生型黄瓜，生长势强，分枝发达，果实小而苦，果肉白色，黑色果刺，刺稀疏，无瘤。为现有已知品种，在shengpingzhang等人于2017年在《molbreeding》的37期发表的文章《inheritanceandqtlmappingofresistancetogummystemblightincucumberstem》中也有记载。

主要试剂

pcr实验使用shanghaipromega公司的gotaqgreenmastermix；酶切反应使用neb(北京)有限公司的cutsmartbuffer和taqⅰ限制性内切酶；测序在北京诺赛基因组研究有限公司进行。

snp标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用primer6.0软件设计，并在上海生工公司合成。

下述实施例中，未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或参考制造厂商说明书记载的方法。

实施例1.与黄瓜fc基因连锁的snp标记snpffc-10的获得

步骤1.黄瓜果肉颜色鉴定

以中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组的74份黄瓜核心种质为试验材料，对其商品瓜进行表型鉴定，按白、白绿、浅绿、绿及深绿五个等级进行划分。采用叶绿素含量测定、目测测定及提取液测定三种方法进行表型测定，每份材料测定三个重复。

以白色果肉黄瓜pi183967和绿色果肉黄瓜‘9110gt’为亲本构建的含78个株系的f2代群体为验证材料，同样对其商品瓜进行表型鉴定，按白、白绿、浅绿、绿及深绿五个等级进行划分。经数据分析发现黄瓜果肉颜色叶绿素含量呈连续分布，且接近正态分布，表明在f2代群体中该性状是受数量性状控制的。

步骤2.全基因组关联分析(gwas)

利用74份黄瓜试验材料的基因型数据及表型数据进行gwas分析，使用emmax软件进行分析，采用混合线性模型(mlm)，经过主成分分析(pca)，并绘制曼哈顿图。

步骤3.snp标记的开发及引物设计

分析-logpvalue在4以上的位点，得到5号染色体735949bp处的snpffc-10为候选snp位点。根据snp的位置，用primer6.0软件设计正向引物和反向引物，其核苷酸序列如下：

snpffc-10-f：5’-ttgggacgtttatggactt-3’；

snpffc-10-r：5’-gtcacaagaatagtgtcagt-3’。

实施例2.与黄瓜fc基因连锁的snpffc-10标记的验证

使用以白色果肉黄瓜pi183967和绿色果肉黄瓜‘9110gt’为亲本构建的78份f2代群体材料对实施例1获得的snp标记snpffc-10进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。

步骤1.dna提取

取黄瓜植株的嫩叶，用改良的ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本‘9110gt’和pi183967、f1代、f2代群体各单株的基因组dna。

步骤2.pcr扩增

pcr反应体系为：总反应体系10μl，3μl基因组dna(5.0ng·μl^-1)，正向引物和反向引物snpffc-10-f/snpffc-10-r(50ng·μl^-1)各1μl，5μlgogreenmastermix(promega公司产品)。

pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃保存。

步骤3.黄瓜果肉颜色判断

方法一：通过pcr产物直接测序来判断黄瓜果肉颜色

直接对pcr产物进行测序，若扩增产物第73个碱基为a，则待测样品为绿色果肉材料；若扩增产物第73个碱基为g，则待测样品为白色果肉材料。

方法二：通过pcr产物的酶切结果来判断黄瓜果肉颜色

酶切反应体系20μl：2μl10×cutsmartbuffer，0.4μltaqⅰ限制性内切酶，8μlpcr产物，9.6μlh2o。

酶切反应程序：65℃酶切2h后，80℃变性20min，4℃保存。

酶切产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×tbe，150v恒功率电泳分离1h5min，电泳后银染显色，统计带型。

酶切产物中，若出现一条232bp主带和一条72bp主带(72bp的主带因片段过小，已从电泳道跑出，故仅能看到一条232bp主带)，则为绿色果肉材料，条带带型记为a；若出现一条302bp主带，则为白色果肉材料，条带带型记为b；若同时检测到232bp，72bp和302bp三个条带，则为中间型，条带带型记为h。

结果如图2所示，在78份f2代群体材料中，有4份材料的电泳结果为空带，余下的74份材料中共有67份材料的带型反映的数据与田间表型调查结果一致，准确率为91.0％。

sequencelisting

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>用于检测黄瓜果肉颜色的snp标记及其应用

<130>p190029/sch

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

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<213>artificialsequence

<220>

<223>与黄瓜（cucumissativusl.）绿色果肉基因fc连锁的片段

<400>1

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actatattttttaaatagtaaaataaattaaaatatttagattgtatacctaaactatta120

ttactatctatatccatactactgtaaaaatatatcagtgtttatgatggatagaatcta180

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tttattttataatttgtagctattaagtttcatactactattacgtcactgacactattc300

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<223>与黄瓜（cucumissativusl.）白色果肉基因fc连锁的片段

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