用于检测鱼类病毒性神经坏死病荧光定量RT-PCR方法及相应的试剂盒与流程

本发明涉及海水鱼类疾病检测，属于分子生物学技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对鱼类病毒性神经性坏死病进行荧光定量rt-pcr检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术：

神经性坏死病毒(viralnervousvirus,vnnv)属于诺达病毒科，病毒粒子无囊膜，呈20面体状，病毒粒子直径一般为25-34nm，其基因组有两条单链rna组成，一条rna编码非结构蛋白，另一条编码主要结构蛋白。患病鱼其病理检查可见脊髓、中枢神经系统及视网膜组织大量形成空泡，出现神经性降解。神经性坏死病流行于除南美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，广东、福建、海南及台湾地区是我国鱼类神经坏死病的主要高发区，主要感染石斑鱼、红鳍东方鲍及石鲷等鱼的仔鱼和幼鱼，其死亡率一般在40％～100％。重者在一周死亡率可达100％。患有病毒性神经坏死病的鱼，其鱼体发黑，眼球突出，食欲降低，变得消瘦，出现神经机能障碍，病鱼漂游于水面，在水中打圈或者螺旋状游泳等。病理检查可见，病鱼鳔肿大，神经组织坏死，出现空泡。

感染鱼类神经性坏死病早期可以通过疫苗控制，但是对于鱼类神经性坏死病毒的流行病学研究有限，所以对其疾病防治效果较差。而在我国，集约化水产养殖盛行，其品种单一、养殖密度高，一旦感染上，疾病传播速度非常快，所以对该病害的检测预防显得格外重要。

目前对鱼类神经性坏死病毒检测，主要是基于病理切片法、免疫学、rt-pcr及lamp技术等各种诊断方法。但是现有的方法都存在不足，基于病理切片法和免疫学检测方法操作复杂、耗时长以及灵敏度低；rt-pcr方法灵敏、准确，但是过程复杂，需要专业人员操作，不适合推广应用；lamp技术方法快速、简单，但是扩增产物易交叉污染，导致假阳性高，一般只用做疾病初筛，在检测应用中存在一定的局限性。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量rt-pcr方法，所述方法能够定量、快速、实时检测鱼类神经性坏死病，使vnnv的检测更准确、灵敏、快速和安全。

具体地，上述方法包括如下步骤：

s1、收集样品；

s2、提取基因组dna；

s3、利用荧光定量rt-pcr检测鱼类病毒性神经坏死病特异性基因cp基因；

s4、读取扩增ct值；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因cp基因的ct值小于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阳性；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因cp基因的ct值大于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述步骤s2中还包括设计cp基因的检测引物和taqman探针的步骤。

作为一种优选技术方案，所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因cp基因的检测引物如seqidno:1～2所示；

seqidno:1(5'-ggacctcgtcgggaaaggag-3')；

seqidno:2(5'-gacacagcactgacacgttga-3')。

探针序列如seqidno:3所示；

seqidno:3(5'-fam-cgtcacctggtcggctgatactcctgta-bhq1-3)。

作为一种优选技术方案，所述荧光定量pcr检测的反应体系为25μl，包括2×taqpcrmix12.5μl，total10umprimersmix1μl，taqman探针0.5μl，dnainput2μl，h2o9μl。

作为一种优选技术方案，所述荧光定量pcr检测的反应条件为50℃预变性15min，95℃变性10min，94℃退火15s，58℃退火40s，采集荧光信号，40个循环。

本发明另一目的是提供一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量rt-pcr试剂盒，包含所述的鱼类病毒性神经坏死病特异性基因cp基因的检测引物和taqman引物探针。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过前期对鱼类病毒性神经坏死病和其他种属的菌种和病毒的大量研究数据中，挖掘出能够区分鱼类病毒性神经坏死病和其他种属的菌种和病毒特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出其他菌种或病毒阳性样品和环境样品中是否含有鱼类病毒性神经坏死病，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。

(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于cp基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。

(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的检测策略，能够直观的判断鱼类病毒性神经坏死病的感染和其他病毒或菌种感染，结果更加严谨和准确。

(4)本发明能够实现从10¹倍稀释到10⁵倍稀释的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。

(5)本发明检测方法能够应用于养殖水体样本或石斑鱼样品等多方面来源样品筛查和检测，精准地判断出该养殖水体样品中是否含有鱼类病毒性神经坏死病，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于多种养殖样品的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在养殖水体检测和日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。

附图说明

图1cp基因检测引物标准曲线。

图2是实施例1中cp基因扩增曲线。

图3是实施例2中cp基因扩增曲线。

图4是实施例3中特异性实验cp基因的扩增曲线。

图5是实施例4中不同稀释倍数下样品1的cp基因的扩增曲线。

图6为实施例4中不同稀释倍数下样品2的cp基因的扩增曲线。

图7为实施例4中不同稀释倍数下样品3的cp基因的扩增曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

表1

在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。

在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出鱼类病毒性神经坏死病感染的样本和其他种属菌类以及病毒感染的样本，从而准确检测并判断出鱼类病毒性神经坏死病。

在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个、10000以及10⁵个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出鱼类病毒性神经坏死病和其他种属微生物，从而准确检测并判断出鱼类病毒性神经坏死病。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。

在一些实施方案中，采集包括纯水、健康石斑鱼、珠海某地石斑鱼样品以及石斑鱼养殖水样，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有鱼类病毒性神经坏死病，方便快捷。

本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。

本发明所描述的用于检测鱼类病毒性神经坏死病荧光定量rt-pcr的方法及试剂盒可以广泛应用于石斑鱼样本检测、养殖水体检测等多个检验检疫范畴，能够为石斑鱼养殖、繁殖等提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。

实施例1检测引物扩增标准曲线及质粒灵敏度实验

1.微生物培养

使用lb培养基作为鱼类病毒性神经坏死病质粒的培养基，ph7.0～7.4的平板中生长良好。在平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。

2.基因组dna提取

按照qiagen的qiaampdnaminikit说明书指示进行基因组dna的提取。

3.扩增产物标准品质粒制作

使用源自鱼类病毒性神经坏死病提取的dna，以cp基因的引物进行扩增，扩增产物经过加a处理后，使用t4连接酶连入t载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。cp基因的引物序列和taqman探针序列如seqidno:1～3所示，具体如表2。

表2

4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置

分别涂板扩增cp基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过lb培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照qiagenplasmidmidikit说明书指示进行质粒dna的提取。提取后检测质粒dna的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置7个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1fg/μl，1×10¹fg/μl，1×10²fg/μl，1×10³fg/μl，1×10⁴fg/μl，1×10⁵fg/μl，1×10⁶fg/μl。

5.检测引物标准曲线绘制

按照takarataqrt-pcrmix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qrt-pcr扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到引物的扩增效率。每一个qrt-pcr的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qrt-pcr反应体系和扩增反应条件如表3所示，绘制的标准曲线如图1所示。

表3

6.结果分析

检测引物扩增标准曲线结果显示，cp基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度r²>0.980，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析cp基因的扩增曲线的标准差和变异系数，以及7个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，引物在该反应条件下能够满足检测要求，说明本方法质粒灵敏度高，且通过3个技术重复实验测得的ct值之间的变异系数小于5.0％，证明本方法重复性高。检测结果如表4及图2所示，图2为cp基因不同质粒浓度下的扩增曲线，扩增曲线从左到右的浓度依次为1×10⁶fg/μl，1×10⁵fg/μl，1×10⁴fg/μl，1×10³fg/μl，1×10²fg/μl，1×10¹fg/μl，1×10⁰fg/μl。

表4

实施例2质粒重复性实验

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组dna提取

同实施例1。

3.目标基因的qrt-pcr检测

按照takarataqrt-pcrmix说明书指示进行样品的qrt-pcr扩增，并且得到引物对应的ct值读数。本实验的qrt-pcr的反应设置2个浓度，分别为1×10⁶fg/μl和1×10⁵fg/μl，每个浓度下分别设置4个生物学重复和5个技术重复，qrt-pcr反应体系和扩增反应条件如表5所示。

表5

4.结果分析

本实施例分析了cp基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及2个浓度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，引物在该反应条件下能够满足检测要求。检测结果如表6及如图3所示，每个浓度条件设定4组，每组重复性测定5次，测定结果显示，变异系数均小于5.0％，证明本方法重复性好，稳定性高。

表6

实施例3阳性及阴性样品检测情况

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组dna提取

同实施例1。

3.目标基因的qrt-pcr检测

按照takarataqrt-pcrmix说明书指示进行样品的qrt-pcr扩增，并且得到引物对应的ct值读数。qrt-pcr的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qrt-pcr反应体系和扩增反应条件同实施例2。

4.结果分析

如表7和图4所示，引物的qrt-pcr扩增结果显示，鱼类病毒性神经坏死病呈现cp基因的阳性结果，而其他病毒或菌属均显示阴性结果。因此，对于鱼类病毒性神经坏死病和其他病毒或菌属，进行cp基因的检测，能够较好的区分鱼类病毒性神经坏死病和其他病毒或菌属。综上所述，cp基因的对应引物和探针，能够满足鱼类病毒性神经坏死病的检测判断。

表7

实施例4阳性样品的灵敏度

1.样本收集和处理

分别收集健康石斑鱼样本和病毒性神经性坏死病阳性样品，其中病毒性神经性坏死病阳性样品按照10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍分别进行梯度稀释，按照qiagen的qiaampdnaminikit说明书指示进行基因组dna的提取。

2.基因组dna提取

同实施例1。

3.目标基因的qrt-pcr检测

同实施例2。

4.结果分析

如表8和图5-7所示，3种样品的cp基因引物的qrt-pcr扩增结果显示，从10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍稀释样本的范围内，鱼类病毒性神经坏死病呈现cp基因的阳性结果。因此，通过进行cp基因的检测，能够较好的达到达到从10¹倍至10⁵倍稀释的范围内鱼类病毒性神经坏死病的检出。同时，从样本稀释10¹倍至10⁵倍的范围内，可以通过cp基因的检测，较好的完成鱼类病毒性神经坏死病的检测，检测范围可以跨度至样本稀释10¹倍至10⁵倍，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。

表8

实施例5环境样品的检测

1.环境样品收集和基因组dna的提取

分别收集纯水样本、健康石斑鱼样本、珠海斗门阳性样品、湛江赤坎阳性样品、以及养殖海水样多份，按照qiagen的qiaampdnaminikit说明书指示进行基因组dna的提取。

2.目标基因的qrt-pcr检测

同实施例2。

3.结果分析

如表9所示，引物的qrt-pcr扩增结果显示，除了纯水样本、健康石斑鱼样本和一个珠海斗门阳性样品、一个湛江赤坎阳性样品以及养殖海水样品样本外，其他样品均检出cp基因，证明相应的样品来源中含有鱼类病毒性神经坏死病。最终判断为鱼类病毒性神经坏死病阳性的准则为，cp基因检测得到ct值小于35个循环。如果cp基因均检测得到ct值大于35个循环，则判断为鱼类病毒性神经坏死病阴性未检出。

表9

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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<110>广东美格基因科技有限公司

<120>用于检测鱼类病毒性神经坏死病荧光定量rt-pcr方法及相应的试剂盒

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