能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒的制作方法

本发明提供了一种用于检测禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的多重连接探针扩增鉴别检测试剂盒及引物和探针，可实现同时检测7种引起禽呼吸道疾病病原，属于检验检疫领域。

背景技术：

禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒是引起禽呼吸道疾病的常见病原。

由于引起禽呼吸道症状的疾病不止一种，临床表现较为相似，且常见不同病原混合感染，使得通过临床症状和病理变化很难对致病原因进行确诊。目前尚没有一种方法可以一次性对引起禽呼吸道症状的多种疾病进行鉴别。因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于鉴别诊断禽呼吸道病原至关重要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒。

为解决技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒，该试剂盒中包括：

(1)预扩增引物混合液；

该混合液中包括预扩增引物，其序列如seqidno：1～14所示；

(2)探针混合液；

该混合液中包括左侧探针和右侧探针，其序列如seqidno：15～28所示；

(3)mlpa缓冲液；

(4)连接缓冲液a；

(5)连接缓冲液b；

(6)连接酶ligase-65；

(7)pcr反应混合液，其包括如序列seqidno：29和30所示的通用引物；

(8)salsa聚合酶；

(9)阴性对照；

(10)阳性对照。

本发明中，在所述预扩增引物混合液的预扩增引物中：序列seqidno：1和序列seqidno：2分别是禽流感病毒h9预扩增的正向和反向引物；序列seqidno：3和序列seqidno：4分别是禽流感病毒h5预扩增的正向和反向引物；序列seqidno：5和序列seqidno：6分别是禽流感病毒h7预扩增的正向和反向引物；序列seqidno：7和seqidno：8分别是新城疫病毒预扩增的正向和反向引物；序列seqidno：9和seqidno：10分别是禽偏肺病毒预扩增的正向和反向引物；序列seqidno：11和seqidno：12分别是禽传染性支气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；序列seqidno：13和seqidno：14分别是禽传染性喉气管炎病毒预扩增的正向和反向引物；

在所述探针混合液的探针中：序列seqidno：15和seqidno：16分别为检测禽流感病毒h9的左侧探针和右侧探针；序列seqidno：17和seqidno：18分别为检测禽流感病毒h5的左侧探针和右侧探针；序列seqidno：19和seqidno：20分别为检测禽流感病毒h7的左侧探针和右侧探针；序列seqidno：21和seqidno：22分别为检测新城疫病毒的左侧探针和右侧探针；序列seqidno：23和seqidno：24分别为检测禽偏肺病毒的左侧探针和右侧探针；序列seqidno：25和seqidno：26分别为检测禽传染性支气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；序列seqidno：27和seqidno：28分别为检测禽传染性喉气管炎病毒的左侧探针和右侧探针；

在所述pcr反应混合液的引物中，序列seqidno：29和seqidno：30分别是通用正向和反向引物；

其中，序列seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26和seqidno：28的5’端进行磷酸化处理。

本发明中，所述阳性对照是基因体外转录rna与阳性重组质粒dna的混合物；其中基因体外转录rna是指禽流感病毒h9的ha基因、禽流感病毒h5的ha基因、禽流感病毒h7的ha基因、新城疫病毒的m基因、禽偏肺病毒的n基因、禽传染性支气管炎病毒的m基因的体外转录rna，阳性重组质粒dna是指禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白c基因的阳性重组质粒dna。

本发明进一步提供了利用前述试剂盒同时检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增检测方法，包括以下步骤：

(1)磁珠法提取样品dna/rna；

使用磁珠dna/rna共提取试剂盒和全自动核酸提取仪，同时提取样品中的dna和rna，得到100μl样品；

(2)rna反转录成cdna及预扩增

进行一步法反转录rt-pcr反应；

配制25μl反应体系：10μlonestepaheadrt-pcrmastermix，1μlonestepaheadrt-mix，5μldna或rna，5μlq-solution，终浓度为每条引物0.25μm的预扩增引物混合液共1μl，3μlh2o补足；反应条件：50℃10min，95℃5min；95℃15s，55℃20s，72℃20s，30个循环；72℃2min；

(3)mlpa检测

a、dna变性

取0.2mlpcr反应管，每管加入0.5μldna溶液和4.5μlte，98℃变性5min，降至室温25℃；

b、探针与样本dna的杂交

配制3μl混匀的探针混合液：1.5μlmlpa缓冲液+1.5μl探针混合液；将探针混合物加入上述pcr管中，95℃温育1min，60℃杂交1-16h，54℃温育；

c、杂交探针的连接

配制32μl连接酶混合物：25μldh2o+3μl连接缓冲液a+3μl连接缓冲液b+1μl连接酶ligase-65；pcr仪温度降至54℃，打开管盖，加入32μl连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育；

d、连接探针的pcr扩增

配制10μlpcr混合液：7.5μldh2o+2μlpcr反应混合液+0.5μlsalsa聚合酶；取出pcr管，室温下加入10μlpcr混合物；开始pcr反应，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，降至15℃；

e、全自动核酸分析仪分析：

取pcr扩增产物，用全自动核酸分析仪进行分析；

(4)结果描述及判定

a、质控标准：

阳性对照在92bp、97bp、102bp、120bp、127bp、134bp、142bp处有特异性扩增条带；

阴性对照无特异性扩增条带；

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效；

b、结果判断：

阳性：在92bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h9；在97bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h5；在102bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h7；在120bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在新城疫病毒；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽偏肺病毒；在134bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性支气管炎病毒；在142bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性喉气管炎病毒；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒。

本发明中，在进行结果判断时，对mlpa扩增产物进行测序，进一步确认结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.高通量。同时检测7种病原，利用全自动核酸分析仪，每次可同时检测96个样品，为病原体的鉴别诊断和应急诊断提供高通量检测技术。

2.特异性好。通过探针设计、序列比对和blast分析，确保探针只与目标基因相结合。并对临床上常见的病原进行检测，本方法只能从其对应的模板中扩增出相应大小的目的片段，对其他病原并无扩增。

3.灵敏度高。普通的mlpa方法至少需要6000个拷贝的目标dna。我们通过增加rt-pcr这一步骤对目标基因进行富集，最低可检出1拷贝的目标基因。

附图说明

图1为禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的多重连接探针扩增毛细管电泳峰图。

图中示出了：禽流感病毒h9在92bp处的特异性扩增峰；禽流感病毒h5在97bp处的特异性扩增峰；禽流感病毒h7在102bp处的特异性扩增峰；新城疫病毒在120bp处的特异性扩增峰；禽偏肺病毒在127bp处的特异性扩增峰；禽传染性支气管炎病毒在134bp处的特异性扩增峰；禽传染性喉气管炎病毒在142bp处的特异性扩增峰。

图2为禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒多重连接探针扩增毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，nc：无模板对照，lane1、2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用混合探针进行mlpa检测。

图3为分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用禽流感病毒h9探针进行mlpa检测的毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，lane1：以禽流感病毒h9体外转录的rna为模板，lane2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，nc：无模板对照。

图4为分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用禽流感病毒h7探针进行mlpa检测的毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，lane1：以禽流感病毒h7体外转录的rna为模板，lane2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，nc：无模板对照。

图5为分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用禽流感病毒h5探针进行mlpa检测的毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，lane1：以禽流感病毒h5体外转录的rna为模板，lane2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，nc：无模板对照。

图6为分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用ndv探针进行mlpa检测的毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，lane1：以ndv体外转录的rna为模板，lane2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，nc：无模板对照。

图7为分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用ampv探针进行mlpa检测的毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，lane1：以ampv体外转录的rna为模板，lane2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒，nc：无模板对照。

图8为分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用ibv探针进行mlpa检测的毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，lane1：以ibv体外转录的rna为模板，lane2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，nc：无模板对照。

图9为分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna和iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，用iltv探针进行mlpa检测的毛细管电泳胶图。

m：1000bpdnamarker，lane1：以iltvglycoproteinc基因的重组质粒为模板，lane2、3、4、5、6、7分别以禽流感病毒h9、禽流感病毒h7、禽流感病毒h5、ndv、ampv、ibv体外转录的rna为模板，nc：无模板对照。

具体实施方式

多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification,mlpa)是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术。该技术将核酸的杂交检测和pcr链式扩增相结合，从而实现靶分子的高效特异性分析，在同一反应管中对45个不同的靶基因进行检测和定量分析。mlpa的基本原理包括探针和靶序列dna进行杂交，之后通过连接、pcr扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，dna分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个mlpa探针包括两个寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由m13噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在mlpa反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每对探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在130～480bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，软件分析，得出结论。

本发明建立了同时检测引起禽呼吸道疾病7种病原体的特异性强、敏感度高和可重复性好的mlpa鉴别检测方法，为病原体的鉴别诊断和应急诊断提供高通量检测技术。

一个标准的mlpa反应至少需要6000个拷贝的目标dna。为提高检出病原的敏感度，本发明对其进行改良，引入了预扩增的步骤。通过将rna反转录成cdna，并用pcr预扩增目标dna，以提高检测下限。针对病毒最保守的基因设计引物和探针，序列从genbank上获得，并用musclealignment(geneious8.1.4)进行序列比对以确定每个基因中最为保守的区域。引物用primer3进行设计(序列见表1)，用于特异性反转录和预扩增，这些引物扩增的片段包含mlpa探针结合的区域。探针设计参照mrc-holland公开的流程(designingsyntheticmlpaprobes,version15)。探针分别结合禽流感病毒h9的ha基因、禽流感病毒h5的ha基因、禽流感病毒h7的ha基因、新城疫病毒的m基因、禽偏肺病毒的n基因、禽传染性支气管炎病毒的m基因和禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白c基因中最保守的区域(序列见表2)，最后设计一对pcr扩增的通用引物(序列见表3)。左侧探针由两段核苷酸组成，一段是pcr扩增的通用引物，一段是病毒特异性序列(lhs)；右侧探针由两段核苷酸组成，一段是病毒特异性序列(rhs)，一段是pcr扩增的通用引物，且右侧探针的5′端进行磷酸化处理。通过设计不同长度的探针区分不同病原。所有的引物和探针都在ncbi数据库中进行blast分析，以确保引物和探针的特异性。通过模板变性、探针杂交、连接及通用引物的pcr扩增得到不同大小的pcr产物，通过全自动核酸分析仪分析实现对7种病原的同时检测。

表1禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的预扩增名称和序列

表2禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒左侧探针和右侧探针名称和序列

其中，上述seqidno：16，seqidno：18，seqidno：20，seqidno：22，

seqidno：24，seqidno：26和seqidno：28的5’端进行磷酸化处理；

表3通用引物序列

本发明采用多重连接探针扩增技术建立了同时检测禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的检测方法并组装了试剂盒。

检测禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒多重连接探针扩增检测试剂盒，由以下组分组成：

(1)预扩增引物混合液，包括禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的反转录和预扩增引物，所述引物序列见表1，混合液中每条引物的浓度为0.25μm；

(2)探针混合液，其包括检测禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的左侧和右侧探针，所述探针的序列见表2，其中，所述seqidno：16，seqidno：18，seqidno：20，seqidno：22，seqidno：24，seqidno：26和seqidno：28的5’端进行磷酸化处理；混合液中每种探针的浓度为1.33nm；

(3)mlpa缓冲液；

(4)连接缓冲液a；

(5)连接缓冲液b；

(6)连接酶ligase-65；

(7)pcr反应混合液，其包括序列表seqidno:29和seqidno：30所示的通用引物；

(8)salsa聚合酶；

(9)阴性对照：te；

(10)阳性对照：为禽流感病毒h9的ha基因、禽流感病毒h5的ha基因、禽流感病毒h7的ha基因、新城疫病毒的m基因、禽偏肺病毒的n基因、禽传染性支气管炎病毒的m基因的体外转录rna，与禽传染性喉气管炎病毒的糖蛋白c基因的阳性重组质粒dna的混合物。

禽流感病毒h9亚型ha基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽流感病毒h9亚型ha基因中相对保守的304bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-h9。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽流感病毒h9亚型ha基因体外转录的rna命名为h9-rna。禽流感病毒h9亚型ha基因如序列表中seqidno：31所示。

禽流感病毒h5亚型ha基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽流感病毒h5亚型ha基因中相对保守的350bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-h5。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽流感病毒h5亚型ha基因体外转录的rna命名为h5-rna。禽流感病毒h5亚型ha基因如序列表中seqidno：32所示。

禽流感病毒h7亚型ha基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽流感病毒h7亚型ha基因中相对保守的338bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-h7。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽流感病毒h7亚型ha基因体外转录的rna命名为h7-rna。禽流感病毒h7亚型ha基因如序列表中seqidno：33所示。

新城疫病毒m基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取新城疫病毒m基因中相对保守的499bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-ndv-m。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将新城疫病毒m基因体外转录的rna命名为ndv-m-rna。新城疫病毒m基因如序列表中seqidno：34所示。

禽偏肺病毒n基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽禽偏肺病毒n基因中相对保守的296bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-ampv-n。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽偏肺病毒n基因体外转录的rna命名为ampv-n-rna。禽偏肺病毒n基因如序列表中seqidno：35所示。

禽传染性支气管炎病毒m基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽传染性支气管炎病毒m基因中相对保守的741bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-ibv-m。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽传染性支气管炎病毒m基因体外转录的rna命名为ibv-m-rna。禽传染性支气管炎病毒m基因如序列表中seqidno：36所示。

禽传染性喉气管炎病毒glycoproteinc基因阳性重组质粒的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽传染性喉气管炎病毒glycoproteinc基因中相对保守的200bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-iltv-c。禽传染性喉气管炎病毒glycoproteinc基因序列如序列表中seqidno：37所示。

本发明提供了同时检测禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒的多重连接探针扩增检测方法，具体操作流程如下：

1.磁珠法提取样品dna/rna；

用tiangen公司的磁珠dna/rna共提取试剂盒，使用天隆np968全自动核酸提取仪同时提取样品中的dna和rna，得到100μl样品。

2.rna反转录成cdna及预扩增

按照qiagenonestepaheadrt-pcrkit说明书进行一步法反转录rt-pcr反应。配制25μl反应体系：10μlonestepaheadrt-pcrmastermix，1μlonestepaheadrt-mix，5μldna或rna，5μlq-solution，1μl预扩增引物混合液(终浓度为每条引物0.25μm)，3μlh2o补足。反应条件：50℃10min，95℃5min；95℃15s，55℃20s，72℃20s，30个循环；72℃2min。

3.mlpa检测

1)dna变性

取0.2mlpcr反应管，每管加入0.5μldna溶液和4.5μlte，98℃变性5min，降至室温25℃。

2)探针与样本dna的杂交

配制3μl混匀的探针混合液：1.5μlmlpa缓冲液+1.5μl探针混合液。将探针混合物加入上述pcr管中，95℃温育1min，60℃杂交1-16h，54℃温育。

3)杂交探针的连接

配制32μl连接酶混合物：25μldh2o+3μl连接缓冲液a+3μl连接缓冲液b+1μl连接酶ligase-65。pcr仪温度降至54℃，打开管盖，加入32μl连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育。

4)连接探针的pcr扩增

配制10μlpcr混合液：7.5μldh2o+2μlpcr反应混合液+0.5μlsalsa聚合酶。取出pcr管，室温下加入10μlpcr混合物。开始pcr反应，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，降至15℃。

5)全自动核酸分析仪分析：

pcr扩增产物用全自动核酸分析仪(qsep100dnaanalyzer)进行分析。

4.结果描述及判定

1)质控标准：

阳性对照在92bp、97bp、102bp、120bp、127bp、134bp、142bp处有特异性扩增条带。

阴性对照无特异性扩增条带。

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效。

2)结果判断：

阳性：在92bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h9；在97bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h5；在102bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h7；在120bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在新城疫病毒；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽偏肺病毒；在134bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性支气管炎病毒；在142bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性喉气管炎病毒；可对mlpa扩增产物进行测序，进一步确认；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒。

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

一、试剂盒的使用

1试剂盒的组成

其中，mlpa缓冲液、连接缓冲液a、连接缓冲液b、连接酶ligase-65和salsa聚合酶购自mrc-holland公司。

储存条件：

1)除阳性对照以外，其他组分保存在-15℃到-25℃。阳性对照保存于-80℃。

2)为了保证实验效果，试剂盒产品在一年之内使用完毕。

2使用方法

2.1磁珠法提取样品的dna/rna；

用tiangen公司的磁珠dna/rna共提取试剂盒，使用天隆np968全自动核酸提取仪同时提取样品中的dna和rna，得到100μl样品。

2.2rna反转录成cdna及预扩增

按照qiagenonestepaheadrt-pcrkit说明书进行一步法反转录rt-pcr反应。配制25μl反应体系：10μlonestepaheadrt-pcrmastermix，1μlonestepaheadrt-mix，5μldna或rna，5μlq-solution，1μl预扩增引物混合液(终浓度为每条引物0.25μm)，3μlh2o补足。反应条件：50℃10min，95℃5min；95℃15s，55℃20s，72℃20s，30个循环；72℃2min。

2.3mlpa检测

2.3.1dna变性

取0.2mlpcr反应管，每管加入0.5μldna溶液和4.5μlte，98℃变性5min，降至室温25℃。

2.3.2探针与样本dna的杂交

配制3μl混匀的探针混合液：1.5μlmlpa缓冲液+1.5μl探针混合物。将探针混合物加入上述pcr管中，95℃温育1min，60℃杂交1-16h，54℃温育。

2.3.3杂交探针的连接

配制32μl连接酶混合物：25μldh2o+3μl连接缓冲液a+3μl连接缓冲液b+1μl连接酶ligase-65。pcr仪温度降至54℃，打开管盖，加入32μl连接酶混合物，54℃温育15min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育。

2.3.4连接探针的pcr扩增

配制10μlpcr混合液：7.5μldh2o+2μlpcr反应混合液+0.5μlsalsa聚合酶。取出pcr管，室温下加入10μlpcr混合物。开始pcr反应，反应条件为：95℃30s，60℃30s，72℃60s，35个循环；72℃孵育20min，降至15℃。

2.3.5全自动核酸分析仪分析：

pcr扩增产物用全自动核酸分析仪(qsep100dnaanalyzer)进行分析。

2.4.结果描述及判定

1)质控标准：

阳性对照在92bp、97bp、102bp、120bp、127bp、134bp、142bp处有特异性扩增条带。

阴性对照无特异性扩增条带。

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效。

2)结果判断：

阳性：在92bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h9；在97bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h5；在102bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽流感病毒h7；在120bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在新城疫病毒；在127bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽偏肺病毒；在134bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性支气管炎病毒；在142bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在禽传染性喉气管炎病毒；可对mlpa扩增产物进行测序，进一步确认；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无禽流感病毒h9、禽流感病毒h5、禽流感病毒h7、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒。

注意事项：

1)dna样品：

a.尽可能减少dna溶液中盐离子、醇类等的含量。

b.用te而不是水溶解或稀释dna，避免dna高温时脱嘌呤。

c.实验前将所有dna样本浓度稀释到大致相等(建议20-40ng/ul)。

2)探针、连接酶ligase-65、连接缓冲液a、连接缓冲液b在使用前应分装，避免反复冻融；

3)缓冲液和试剂使用前应震荡混匀离心，混合时用枪头轻轻吹打混匀，注意避免产生气泡或将打到管壁上，所有含酶步骤均不可离心；

4)加连接酶反应时，pcr管要放置在pcr仪中，切勿取出；

5)蒸发质控：8μlte/水空白连接，连接完成管底至少剩余5μl。

6)全自动核酸分析仪设置：优化注射电压和时间，pcr产物可用稀释液稀释后上样，使得信号处在最佳分析范围。

二、试剂盒的特异性

1材料

禽流感病毒h9的rna提取物、禽流感病毒h5的rna提取物、禽流感病毒h7的rna提取物、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒。

2方法

2.1用单一病原的探针分别禽流感病毒h9的rna提取物、禽流感病毒h5的rna提取物、禽流感病毒h7的rna提取物、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒进行mlpa检测，验证探针的特异性。

2.2用七种病原混合的探针分别对禽流感病毒h9的rna提取物、禽流感病毒h5的rna提取物、禽流感病毒h7的rna提取物、新城疫病毒、禽偏肺病毒、禽传染性支气管炎病毒和禽传染性喉气管炎病毒进行mlpa检测，验证探针的特异性。

3结果

3.1用设计的任意一组探针进行检测，只能从相应的病毒模板中扩增出相应大小的条带，说明探针特异性良好。

3.2用七种病原混合的探针分别对病毒模板进行mlpa检测，只能从相应的病毒模板中扩增出相应大小的条带，表明所建立的方法特异性良好。

三、试剂盒的灵敏度

1材料

含有禽流感病毒h9亚型ha基因、禽流感病毒h5亚型ha基因、禽流感病毒h7亚型ha基因、新城疫病毒m基因、禽偏肺病毒n基因、禽传染性支气管炎病毒m基因、禽传染性喉气管炎病毒glycoproteinc基因的阳性重组质粒。

2方法

2.1质粒的构建和体外转录rna

禽流感病毒h9亚型ha基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽流感病毒h9亚型ha基因中相对保守的304bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-h9。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽流感病毒h9亚型ha基因体外转录的rna命名为h9-rna。禽流感病毒h9亚型ha基因如序列表中seqidno：31所示。

禽流感病毒h5亚型ha基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽流感病毒h5亚型ha基因中相对保守的350bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-h5。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽流感病毒h5亚型ha基因体外转录的rna命名为h5-rna。禽流感病毒h5亚型ha基因如序列表中seqidno：32所示。

禽流感病毒h7亚型ha基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽流感病毒h7亚型ha基因中相对保守的338bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-h7。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽流感病毒h7亚型ha基因体外转录的rna命名为h7-rna。禽流感病毒h7亚型ha基因如序列表中seqidno：33所示。

新城疫病毒m基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取新城疫病毒m基因中相对保守的499bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-ndv-m。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将新城疫病毒m基因体外转录的rna命名为ndv-m-rna。新城疫病毒m基因如序列表中seqidno：34所示。

禽偏肺病毒n基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽禽偏肺病毒n基因中相对保守的296bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-ampv-n。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽偏肺病毒n基因体外转录的rna命名为ampv-n-rna。禽偏肺病毒n基因如序列表中seqidno：35所示。

禽传染性支气管炎病毒m基因体外转录rna的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽传染性支气管炎病毒m基因中相对保守的741bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-ibv-m。以纯化的质粒为模板，将质粒用mlui酶线性化之后，用ambion公司的megascriptt7试剂盒进行体外转录，将体外转录产物用licl沉淀，70％乙醇洗涤后溶于无rnase的ddh2o中，核酸电泳检测rna合成的完整性和正确性，并测定rna浓度。将禽传染性支气管炎病毒m基因体外转录的rna命名为ibv-m-rna。禽传染性支气管炎病毒m基因如序列表中seqidno：36所示。

禽传染性喉气管炎病毒glycoproteinc基因阳性重组质粒的制备：通过数据库中的序列比对，选取禽传染性喉气管炎病毒glycoproteinc基因中相对保守的200bp的序列进行体外基因合成，克隆至pgem-5zf载体(购自promega公司)，命名为pgem-iltv-c。禽传染性喉气管炎病毒glycoproteinc基因序列如序列表中seqidno：37所示。

seqidno：31

h9

tggaagatggaaagggctgtttcgagctataccataaatgtgatgaccaatgcatggaaacaattcggaacgggacctataataggagaaagtacaaagaggaatcaagactagaaaggcagaaaatagaaggggtcaagctggaatctgaggggacttacaaaatccttaccatttattcgactgtcgcctcatctcttgtacttgcaatggggtttgctgccttcttattctgggccatgtccaatggatcatgcaggtgcaacatttgtatataattagcaaaaacacccttgtttctact

seqidno：32

h5

ctctagactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaatggttgtttcgagttctatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaggtgtaaaaaacgggacgtatgactacccgcggtattcagaagaagcaagactaaacagagaggaaataagtggagtaaaattggaatcaatgggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaatcatggtagctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcatttaa

seqidno：33

h7

tggctgattcagaaatggacaaactgtacgaacgagtgaaaagacagctgagagagaatgctgaagaagatggcactggttgctttgaaatatttcacaagtgtgatgatgactgtatggccagtattagaaataacacctatgatcacagaaaatacagggaagaggcaatgcaaaatagaatacagattgacccagtcaaactaagcagcggctacaaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttctagccattgtaatgggccttgtcttcatatgtgtaaagaatggaaacatgcggtgcactatttttatataa

seqidno：34

ndv-m

atggactcatctaggacaattgggttatactttgattctgcccttccttctagcaacctgttagcattcccgattgtcctacgagatgtaggagatggaaagaagcaaattgctccgcaatataggatccggcggcttgactcgtggacagacagtaaagaagactcggtattcatcactacctacggattcatcttccaggttgggaatgaagaagtcactgtcggcatgatcaatgataatcccaagcgagagttactctccgctgcgatgctctgcctaggaagcgtcccgaatgttggagatcctgttgagctggcaagggcctgcctcactatggtggtaacatgcaagaagagtgcaactaatactgagagaatggtcttctcagtagtgcaggcaccccgggtgctgcaaagctgtagggtcgtggcagacaaatactcgtcagtgaatgcagttaagcacgtgaaagcaccagagaagatccctgggagtg

seqidno：35

ampv-n

aggattgacattcccaaaattgcaaggtccttctatgatctgtttgaacagaaagtttactacaggagcttgtttatagagtatggcaaggcccttgggtcttcttccacaggaagcaaggcagagagtctgtttgtgaacattttcatgcaagcttatggtgcaggccaaacaatgctaaggtggggagtgatcgccagatcttccaacaatataatgttaggccatgtctctgtacaagcggaactcaaacaggtcacggaggtatatgatctagttagagagatgggccccga

seqidno：36

ibv-m

cctaagaacggttggaataataaaaatccagcaaattttcaagatgcccaacgagacaaattgtactcttgactttgaacagtcagttcagctttttaaagagtataatttatttataactgcattcttgttgttcttaaccataatacttcagtatggctatgcaacaagaagtaaggttatttatacactgaaaatgatagtgttatggtgcttttggccccttaacattgcagtaggtgtaatttcatgtacatacccaccaaacacaggaggtcttgtcgcagcgataatacttacagtgtttgcgtgtctgtcttttgtaggttattggatccagagtattagactctttaagcggtgtaggtcatggtggtcatttaatccagaatctaatgccgtaggttcaatactcctaactaatggtcaacaatgtaattttgctatagagagtgtgccaatggtgctttctccaattataaagaatggtgttctttattgtgagggtcagtggcttgctaagtgtgaaccagaccacttgcctaaagatatatttgtttgtacaccggatagacgtaatatctaccgtatggtgcagaaatatactggtgaccaaagcggaaataagaaaaggtttgctacgtttgtctatgcaaagcagtcagtagatactggcgagctagaaagtgtagcaacaggaggaagtagtctttacacataaatgtgtgtgtgtagagagta

seqidno：37

iltv-c

atgcagcatcagagtactgcgctagtttcgagtatacttttgctcttgagcctgcaaagccttgcgtttgaatttttctgtgatccgccacacgtttttcgagggcagctcggtgaccccattctattgcaatgcttcagcgacagacctctaacccacgaagaatctgtaaaagtagaagtaattcgacacccagccag

2.2灵敏度验证

用te缓冲液将体外转录的rna或重组质粒dna从10^-1至10^-11进行倍比稀释，然后进行mlpa反应。

3结果

该方法最低可检测到1.40×10²拷贝的禽流感病毒h9rna、1.40×10²拷贝的禽流感病毒h5rna、1.40×10²拷贝的禽流感病毒h7rna、1.33×10¹拷贝的新城疫病毒rna、1.42×10¹拷贝的禽偏肺病毒rna、1.25×10²拷贝的禽传染性支气管炎病毒rna、5.3拷贝禽传染性喉气管炎病毒dna。

序列表

<110>浙江农林大学

<120>能检测多种禽呼吸道病原的多重连接探针扩增鉴别试剂盒

<160>37

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

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<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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<210>10

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

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<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

cctaagaacggttggaat18

<210>12

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

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<211>20

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>14

<211>20

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

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<211>24

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

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<210>16

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

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<210>17

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

tgtcaatttattcaacagtggcgagttcc29

<210>18

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

ctagcactggcaatcatggtagctgg26

<210>19

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

tttggtttagcttcggggcatcatgttt28

<210>20

<211>32

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<213>人工序列(artificialsequence)

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catacttctagccattgtaatgggccttgtct32

<210>21

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

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<210>22

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

caagaagagtgcaactaatactgagagaatggtctt36

<210>23

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

ctgtttgtgaacattttcatgcaagcttatggtgcaggccaaa43

<210>24

<211>42

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

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<210>25

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

cgtatggtgcagaaatatactggtgaccaaagcggaaataagaaaagg48

<210>26

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

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<211>50

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

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<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

ccacacgtttttcgagggcagctcggtgaccccattctattgcaatgctt50

<210>29

<211>21

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

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<210>30

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>30

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>31

tggaagatggaaagggctgtttcgagctataccataaatgtgatgaccaatgcatggaaa60

caattcggaacgggacctataataggagaaagtacaaagaggaatcaagactagaaaggc120

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tgtccaatggatcatgcaggtgcaacatttgtatataattagcaaaaacacccttgtttc300

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<210>32

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>32

ctctagactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacgacaaggtccgactacagctta60

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<210>33

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>33

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<210>34

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>34

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>35

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