自然铜浸出液制备促进骨髓间充质干细胞分化药物的应用的制作方法

本发明涉及一种自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液在制备促进骨髓间充质干细胞成骨化分化药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术：

骨质疏松症是一种全身性和系统性的骨骼疾病，由于骨骼代谢动态平衡受到破坏，骨形成小于骨吸收而引起。骨骼代谢过程需要许多功能细胞的维持，以保持骨骼的动态平衡，其中破骨细胞和成骨细胞是这个过程中主要的功能细胞。成骨细胞在骨骼形成过程中分泌钙盐和骨基质，以形成新的骨骼，破骨细胞则在骨骼形成过程中分泌酸性物质，扮演骨骼吸收的角色。

大鼠骨髓间充质干细胞(ratsbonemarrowstromalstemcells，rbmscs)，是存在于骨髓中具有分化为成骨细胞、骨细胞等多种潜能的干细胞，在骨骼形成过程中扮演者极其重要的作用，具有持续的更新的成骨细胞，为骨骼的形成奠定基础。在长期临床应用过程中发现，中医骨科用药自然铜促进骨折愈合功效显著，然而目前使用的用经典方法炮制的自然铜在水中溶解度小，生物利用度低，给临床药用带来了很大问题。本发明通过自然铜生物浸出的方法制得的自然铜生物浸出液，增加了自然铜中有效元素的浸出，溶出度好，生物利用度高，能够促进骨髓间充质干细胞的成骨化分化。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种自然铜浸出液在制备促进骨髓间充质干细胞成骨化分化药物中的应用，所述自然铜浸出液是自然铜thiobacillusferrooxidansby3的生物浸出液，其浸出方法包括以下步骤：

(1)称取自然铜，置于容器中，向容器中加入200倍的0k液体培养基，并用硫酸调ph至1.60；

(2)接种体积分数为10％的thiobacillusferrooxidansby3，在25℃、130r/min浸出15天；

(3)浸出结束后，静置，收集上清液，调节溶液ph至中性，除菌后得自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液。

本发明采用了thiobacillusferrooxidansby3对自然铜进行了浸出，增加了自然铜中有效元素的浸出。实验结果显示，自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液能提高体外培养骨髓间充质干细胞的alp(碱性磷酸酶)的活性，促进骨髓间充质干细胞的钙盐沉积，进而促进骨髓间充质干细胞的成骨化分化。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。

图1为自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液对rbmscsalp活性的影响结果图。其中图1a为alp组织化学染色图，图1b为alp活性检测结果图，图1c和图1d为alp组织化学染色面积经ipp.6.0软件分析后的结果图。

图2为自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液对rbmscs矿化的影响结果图。其中图2a为钙化结节染色图；图2b为用ipp.6.0扫描分析得到的钙化结节面积量化图；图2c为钙化结节染色显微镜下鉴定结果图。

生物材料

氧化亚铁硫杆菌by3(thiobacillusferrooxidansby3)于2003年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m203071，保藏名称：氧化亚铁硫杆菌by3(thiobacillusferrooxidansby3)。

具体实施方式

以下提供具体实施例以实现本发明所述的自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液在制备促进骨髓间充质干细胞成骨化分化药物中的应用，但不限于以下实施例。

实施例1自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液制备

称取0.5g自然铜，磨碎过200目筛，得粉末。于干净的250ml锥形瓶中，加入灭菌后的0k液体培养基100ml，5m硫酸调ph至1.60，待ph稳定后，接种体积分数为10％thiobacillusferrooxidansby3，在25℃、130r/min浸出15天。实验过程中采用5m硫酸调节ph值，用蒸馏水补充所蒸发的水分。摇瓶浸出15天后停止，静置过夜，收集上清液，调节溶液ph至中性，过0.22m滤膜除菌后，备用。

实施例2骨髓间充质干细胞的培养

取120-150g左右的sd大鼠(购自甘肃中医药大学动物实验中心)，脱颈处死后用75％的酒精消毒10min，剥离股骨组织，然后用吸有dmem/f12培养液(含肝素钠500u/ml)的注射器抽出骨髓腔中的骨髓，并反复吹打使细胞尽可能被吹打散，细胞悬液150目过筛，调节细胞浓度为1.0×10⁷cells/ml，接种于90mm细胞培养皿中，用含10％胎牛血清dmem/f12培养液培养细胞。培养条件为37℃、5％co2饱和湿度的条件下培养，每隔3d更换一次培养液，更换培养液前用无菌pbs(磷酸盐缓冲液)漂洗2次，在细胞达到70～80％融合时进行传代，传至3代时进行接种。

实施例3alp活性测定

alp作为成骨细胞成熟与矿化的标志指标，是普遍存在于细胞膜上的一种糖蛋白，能水解磷脂，是骨骼细胞矿化形成骨骼提供物质基础。本实施例以alp活性作为指标，评价自然铜生物浸出液对骨髓间充质干细胞成骨化分化的影响。

3.1分组

设立自然铜0k+a.f+n-pyrite(1：100)组、0k+a.f+a-pyrite(1：10000)组，阳性对照组和阴性对照组。

0k+a.f+n-pyrite(1：100)组是以天然自然铜为原药，采用实施例1中的浸出方法制备的自然铜浸出液，并用体积比为1：100的α-mem培养基进行稀释。

0k+a.f+a-pyrite(1：10000)组是以煅烧自然铜为原药，采用实施例1中的浸出方法制备的自然铜浸出液，并用体积比为1：10000的α-mem培养基进行稀释。

阳性对照组(estradiol)：用α-mem培养基配置的10^-8mol/l的雌二醇。

阴性对照组(control)：α-mem培养基。

3.2alp活性检测

将传至3代的骨髓间充质干细胞接种到96孔板中，细胞浓度为4000cell/ml，待骨髓间充质干细胞生长达到70-80％融合时，用上述分组供试样品分别对骨髓间充质干细胞进行成骨化诱导培养(培养液中还含有50mg/l磷酸化抗坏血酸、10mmol/lβ-甘油磷酸钠和1×10^-8的地塞米松)，培养至第3、6、9、12d时用alp活性测定试剂盒(购买于南京建成生物工程公司)测定alp的活性。

3.3alp组织化学染色

将传至3代的骨髓间充质干细胞接种于60mm细胞培养皿中，用上述分组供试样品分别对骨髓间充质干细胞进行成成骨化诱导培养。培养至12d时弃去培养液，用福尔马林固定30s后，弃掉固定液，pbs轻轻冲洗3次后，加入alp组织化学染色液，室温静止30min左右，开始出现紫色斑点，显微镜下观察紫色斑点不再增多时，停止染色，弃掉染液，轻轻冲洗。显微镜下照相记录结果，同时使用相机全皿拍照。数据结果分析：照相后采用ipp(image-proplus6.0)灰度分析软件扫描alp染色区域面积，应用公式：培养皿面积×(alp染色区域扫描面积/照片中皿的扫描面积)换算alp染色面积。

3.4结果

自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液处理骨髓间充质干细胞至第12d时进行alp活性分析及alp组织化学染色，结果见图1：0k+a.f+a-pyrite和0k+a.f+n-pyrite组能够显著提高骨髓间充质干细胞的alp活性，增加alp组织化学染色数量和面积(p<0.05或p<0.01)，与阳性对照组雌二醇的效果相同。其中图1a为alp组织化学染色图，图1b为alp活性检测结果图，图1c和图1d为alp组织化学染色面积经过ipp.6.0软件分析后结果图。

实施例4钙化结节染色

钙化结节染色作为体外培养骨骼细胞矿化鉴定的一种方法，本实施例通过钙化结节染色的方法，评价自然铜生物浸出液对骨髓间充质干细胞成骨化分化的影响。

4.1方法

将第3代骨髓间充质干细胞接种到60mm的培养皿中继续培养至70％～80％融合时随机分组，组别同实施例3，用不同分组中的供试样品分别对骨髓间充质干细胞进行成骨化诱导培养。培养至12～14d左右时显微镜下观察细胞，此时细胞分泌大量钙盐并沉积在细胞外，用茜素红钙化结节染色，弃培养液，pbs漂洗3次，10％甲醛固定10min，pbs漂洗3次，加入茜素红染液，37℃水浴30min，流水轻轻冲洗去掉浮色，显微镜下观察鉴定，同时相机拍照记录结果，面积统计采用ipp6.0，扫描面积计算得到钙化结节面积。

4.2结果

本实验钙化结节矿化染色结果见图2：0k+a.f+a-pyrite和0k+a.f+n-pyrite组能够显著提高钙化结节的面积(p<0.05或p<0.01)，与阳性对照组雌二醇的效果相同。其中图2a为钙化结节染色图；图2b为用ipp.6.0扫描分析得到的钙化结节面积量化图；图2c为阴性对照组和0k+a.f+a-pyrite组骨髓间充质干细胞钙化结节染色显微镜下鉴定结果图。

本发明以雌二醇作为阳性对照药物，研究了自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液在促进骨髓间充质干细胞成骨化分化过程中的作用，结果表明自然铜thiobacillusferrooxidansby3浸出液能够提高体外培养骨髓间充质干细胞的alp的活性，促进骨髓间充质干细胞的钙盐沉积，进而促进骨髓间充质干细胞的成骨化分化。