本发明细胞诱导
技术领域：
，具体涉及一种小鼠子宫原代基质细胞体外诱导蜕膜化的方法。
背景技术：
：随着工业化的发展和人类生活方式的巨大改变，近年来全世界不孕不育症患者的比例逐年上升。目前，尽管人工助孕技术得到了较大的发展，但即使在高质量胚胎的情况下，依旧存在着胚胎移植的植入率低以及后续的妊娠成功率低的不足，这主要是由于子宫内膜的生长发育障碍所致。胚胎植入的成功与否，一方面取决于早期胚胎发育形成具有着床能力的囊胚，另一方面取决于子宫内膜协同性的进入接受状态，即胚胎植入的“窗口期”。在小鼠，囊胚与子宫上皮发生黏附反应以后，在甾体激素的影响下，围绕囊胚的子宫基质细胞开始广泛地增殖和分化(即子宫内膜的蜕膜化)。蜕膜化的作用主要是在有功能的胎盘形成之前，为胚泡的发育提供营养，且对发育初期的胚胎起到免疫性保护作用。目前，有关子宫内膜蜕膜化的机制及调节等仍不清楚。因此，研究子宫内膜蜕膜化的过程及相关的机制将具有重要的社会和理论意义。现有技术中，研究人员经常采用小鼠的子宫原代基质细胞作为实验对象，来研究子宫内膜蜕膜化的机制，但是存在着小鼠子宫原代基质细胞在诱导蜕膜化之前，死亡率较高的不足，并且存在着子宫原代基质细胞蜕膜化启动困难、成功率低的缺陷。技术实现要素：本发明的目的是提供一种小鼠子宫原代基质细胞体外诱导蜕膜化的方法，以解决现有技术中存在的小鼠子宫原代基质细胞的死亡率高，蜕膜化启动困难、成功率低的缺陷。本发明是通过以下技术方案实现的。一种小鼠子宫原代基质细胞体外诱导蜕膜化的方法，包括以下操作步骤：(1)取正常妊娠第4天小鼠的子宫组织，采用胰酶溶液消化处理后，去除上皮细胞，得到组织块；(2)将组织块采用质量分数为0.2％的胶原酶ii再次进行消化处理后，向其中加入组织块质量10-15％的离心助剂，然后将混合物进行离心处理，弃去上清液后，加入质量分数为10％的pbs溶液调整细胞浓度，得到小鼠子宫原代基质细胞的单细胞悬液，其中离心助剂由以下重量份的组分制成：干酪素钠17-22份、透明质酸钠25-30份、α-酮戊二酸13-16份；(3)将步骤(2)得到的单细胞悬液培养至细胞密度达到75-85％汇合后，换液，去除杂细胞后，向其中加入诱导培养基，诱导小鼠子宫原代基质细胞发生蜕膜化，其中诱导培养基为含有10-15nm17β-雌二醇、1-3μm孕酮、8-12μm盐酸异丙肾上腺素和2％质量分数木炭处理胎牛血清的dmem-f12培养基。具体地，上述步骤(1)中，胰酶溶液为胰酶和edta溶于无钙镁平衡盐溶液中，经过滤除菌制成，其中胰酶的终质量分数为0.25％，edta的终质量分数为0.02％。具体地，上述步骤(1)中和步骤(2)中，消化处理的操作为：放在4℃冰箱和37℃细胞培养箱中各消化40min后，采用质量分数为10％的pbs溶液终止消化反应反应。具体地，上述步骤(2)中，离心处理时，离心机的转速为3000rpm，离心时间为15min。由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：本发明提供的一种小鼠子宫原代基质细胞体外诱导蜕膜化的方法，操作简单，可使得分离出的小鼠子宫原代基质细胞具有较高的存活率，同时启动蜕膜化的成功率较高，为研究人员对蜕膜化机制的研究奠定了基础。其中，组织块经过胶原酶ii处理后，经胶原酶ii分离出的组织细胞与小鼠子宫原代基质细胞混合在一起，难于分离，需要进行离心处理，才能得到小鼠子宫原代基质细胞，离心处理的过程中，小鼠子宫原代基质细胞容易发生死亡，进而导致得到的小鼠子宫原代基质细胞存活率较低，本发明提供的离心助剂，可有效的提升小鼠子宫原代基质细胞在离心过程中的活性，降低离心作用对细胞造成的伤害，进而有效的保证了小鼠子宫原代基质细胞的存活率；2％质量分数木炭处理胎牛血清可有效的刺激小鼠子宫原代基质细胞完成蜕膜化，其中，盐酸异丙肾上腺素的添加，可有效的促进小鼠子宫原代基质细胞蜕膜化的启动。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验条件。实施例1一种小鼠子宫原代基质细胞体外诱导蜕膜化的方法，包括以下操作步骤：(1)取正常妊娠第4天的小鼠处死后，在75％的酒精里消毒2min，无菌条件下打开腹腔，收集子宫前用生理盐水冲洗一侧子宫，确定是否有胚胎的存在，在子宫颈处剪一小口，用剪刀纵向剖开两侧子宫腔并收集子宫，尽量把子宫一侧的系膜和脂肪全部去除并放在盛有pbs缓冲液的15ml离心管里，剧烈震荡以去除血液和其他组织，得到小鼠的子宫组织，向其中加入胰酶溶液后，放在4℃冰箱和37℃细胞培养箱中各消化40min后，采用质量分数为10％的pbs溶液终止消化反应反应，去除上皮细胞，得到组织块，其中，胰酶溶液为胰酶和edta溶于无钙镁平衡盐溶液中，经过滤除菌制成，胰酶的终质量分数为0.25％，edta的终质量分数为0.02％；(2)向组织块中质量分数为0.2％的胶原酶ii，放在4℃冰箱和37℃细胞培养箱中各消化40min后，采用质量分数为10％的pbs溶液终止消化反应反应，向其中加入组织块质量10-15％的离心助剂，然后将混合物进行离心处理，离心机的转速为3000rpm，离心时间为15min，弃去上清液后，加入质量分数为10％的pbs溶液调整细胞浓度，得到小鼠子宫原代基质细胞的单细胞悬液，其中离心助剂由以下重量份的组分制成：干酪素钠17份、透明质酸钠25份、α-酮戊二酸13份；(3)将步骤(2)得到的单细胞悬液培养至细胞密度达到75％汇合后，换液，去除杂细胞后，向其中加入诱导培养基，诱导小鼠子宫原代基质细胞发生蜕膜化，其中诱导培养基为含有10nm17β-雌二醇、1μm孕酮、8μm盐酸异丙肾上腺素和2％质量分数木炭处理胎牛血清的dmem-f12培养基。实施例2一种小鼠子宫原代基质细胞体外诱导蜕膜化的方法，包括以下操作步骤：(1)取正常妊娠第4天的小鼠处死后，在75％的酒精里消毒2min，无菌条件下打开腹腔，收集子宫前用生理盐水冲洗一侧子宫，确定是否有胚胎的存在。在子宫颈处剪一小口，用剪刀纵向剖开两侧子宫腔并收集子宫，尽量把子宫一侧的系膜和脂肪全部去除并放在盛有pbs缓冲液的15ml离心管里，剧烈震荡以去除血液和其他组织，得到小鼠的子宫组织，向其中加入胰酶溶液后，放在4℃冰箱和37℃细胞培养箱中各消化40min后，采用质量分数为10％的pbs溶液终止消化反应反应，去除上皮细胞，得到组织块，其中，胰酶溶液为胰酶和edta溶于无钙镁平衡盐溶液中，经过滤除菌制成，胰酶的终质量分数为0.25％，edta的终质量分数为0.02％；(2)向组织块中质量分数为0.2％的胶原酶ii，放在4℃冰箱和37℃细胞培养箱中各消化40min后，采用质量分数为10％的pbs溶液终止消化反应反应，向其中加入组织块质量15％的离心助剂，然后将混合物进行离心处理，离心机的转速为3000rpm，离心时间为15min，弃去上清液后，加入质量分数为10％的pbs溶液调整细胞浓度，得到小鼠子宫原代基质细胞的单细胞悬液，其中离心助剂由以下重量份的组分制成：干酪素钠22份、透明质酸钠30份、α-酮戊二酸16份；(3)将步骤(2)得到的单细胞悬液培养至细胞密度达到85％汇合后，换液，去除杂细胞后，向其中加入诱导培养基，诱导小鼠子宫原代基质细胞发生蜕膜化，其中诱导培养基为含有15nm17β-雌二醇、3μm孕酮、12μm盐酸异丙肾上腺素和2％质量分数木炭处理胎牛血清的dmem-f12培养基。对比例1步骤(2)中不添加离心助剂，其余操作步骤与实施例1完全相同。对比例2步骤(3)中，诱导培养基中不添加盐酸异丙肾上腺素，其余操作步骤与实施例2完全相同。实施例1和对比例1中，步骤(2)制得的小鼠子宫原代基质细胞的单细胞悬液采用0.2％台盼蓝排斥试验测试其存活率，试验结果如表1所示：表1小鼠子宫原代基质细胞的单细胞悬液中基质细胞存活率项目基质细胞存活率，％实施例194对比例183由表1可知，离心助剂可有效的降低离心过程中基质细胞的死亡率。小鼠子宫原代基质细胞蜕膜化的启动与否通过蜕膜化有关的标记分子cyclind3的表达水平来测定，cyclind3的表达水平通过免疫印迹法和定量pcr分析测定，cyclind3的表达水平随着时间增加，则小鼠子宫原代基质细胞蜕膜化成功启动，小鼠子宫原代基质细胞蜕膜化启动的成功率如表2所示：表2小鼠子宫原代基质细胞蜕膜化启动的成功率项目成功率，％实施例188实施例291对比例269由表2可知，盐酸异丙肾上腺素可显著的提升小鼠子宫原代基质细胞蜕膜化启动成功率。当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本
技术领域：
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