一种槲皮素酯及其复合物的制作方法

本发明属于医药制药领域，具体涉及一种槲皮素酯-白蛋白复合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：槲皮素（quercetin，que）是一种多羟基黄酮类化合物，具有扩张冠状动脉、降血脂、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降糖降压、免疫调节及心血管保护作用等多种药理作用。近年来体外实验及动物实验研究证明，槲皮素能显著抑制白血病、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、肝癌、肺癌等多种癌细胞的生长。实验证明槲皮素可以通过选择性地抑制血管生成因子vegf表达及活性，间接影响肿瘤的血管生成，从而抑制肿瘤生长。但由于槲皮素的分子结构中含有多个极性羟基基团，亲脂性较弱，并且由于其分子结构中的羟基结构造成的分子间作用，形成氢键，造成晶格能较高，其水溶性也较弱。槲皮素进入体内后，吸收并代谢，以甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化的简单代谢为主，存在强烈的首过效应，生物利用度低，在具体应用中受到限制。ω-3不饱和脂肪酸（highlyunsaturatedfattyacids,hufas）为一组多元不饱和脂肪酸，常见于深海鱼类、海豹油、和某些植物中，对人体健康十分有益。ala是必须氨基酸，人体不能合成，也不能从其他的脂肪酸转化而来，因此必须从食物中摄入。ala主要存在于植物油中，是ω-3不饱和脂肪酸系的前提，可转变生成dha和epa。dha和epa主要存在于鱼、鱼油以及其他海洋生物中。epa具有抑制肌成纤维细胞转分化、减少蛋白尿、抑制细胞外基质堆积、抗氧化应激等作用；可通过降低血小板的凝集和粘附而降低血小板的粘稠度，增加血管的通透性；大量研究表明长期摄入ω-3pufas能够降低血脂、血压、罹患心脑血管疾病、糖尿病等风险，但是目前世界人均ω-3pufas摄入量远不足以满足这些对健康有益的需求。白蛋白是血浆含量最高的蛋白质，占到血浆总蛋白的50%-60%，其在体内主要是由肝脏合成并分泌。白蛋白是由585个氨基酸组成的单链多肽，分子量为66000，富含极性氨基酸，具有较高的溶解度；同时其分子内部富含二硫键，不含糖组分，在偏碱性的体液环境中多带负电荷，且电荷量较多，可作为血浆内多种难溶性较差的物质的载体，如胆红素、长链脂肪酸、胆汁酸盐、类固醇激素、金属离子如na、k、ca等以及其它药物如青霉素、阿司匹林等。有研究报道将具有生物活性的que和牛血清白蛋白（bsa）相互作用，制备bsa-que纳米颗粒，但其结合量低，并不能显著改善que的脂溶性弱、生物利用度低等问题。技术实现要素：针对目前人群ω-3不饱和脂肪酸摄入不足，槲皮素溶解性差、生物利用率低等问题，本发明提供一种槲皮素酯及其与白蛋白的复合物，能够显著提高槲皮素的溶解性。本发明的另目的在于提供一种槲皮素酯及其与白蛋白复合物的制备方法，在槲皮素中引入ω-3不饱和脂肪酸，合成槲皮素酯，以白蛋白为载体，基于槲皮素酯与白蛋白分子之间的作用力形成一种槲皮素酯-白蛋白复合物。本发明的再一目的是提供一种槲皮素酯-白蛋白复合物在食品、保健品、药品制备领域中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。一种槲皮素酯，为槲皮素的ω-3不饱和脂肪酸酯，由ω-3不饱和脂肪酸和槲皮素按照摩尔比为5-15:1制成。优选的，ω-3不饱和脂肪酸和槲皮素的摩尔比为5-10:1。所述ω-3不饱和脂肪酸为α-亚麻酸（ala）、二十碳五烯酸（epa）和二十二碳六烯酸（dha）中的任意一种。一种上述槲皮素酯的制备方法，包括以下步骤：将槲皮素、ω-3不饱和脂肪酸用有机溶剂混匀，加入脂肪酶充分反应，滤膜过滤，滤液除去溶剂得粗产物，纯化后得槲皮素酯。所述有机溶剂为乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、正己烷中的一种或多种。所述脂肪酶优选为novozyme435。优选的，所述脂肪酶与槲皮素质量比为1:5-15。反应温度为40-60℃，反应时间为36-48h。所述纯化步骤为：（1）将乙醇加入到粗产物中，加入碳酸钠，40-50℃回流反应20-30min，得反应液；（2）反应液用正己烷萃取1-3次，萃取所得正己烷层除水后，旋转蒸发除去正己烷。通过碳酸钠去除未反应的ω-3不饱和脂肪酸，通过萃取使其与槲皮素酯分离。所述乙醇的浓度为90%-100%w/w。所述碳酸钠与粗产物的质量比为0.8-1.2:1。所述碳酸钠可以为固体或溶液。一种槲皮素酯-白蛋白复合物，其中，槲皮素酯与白蛋白的质量比为75-150:1；所述槲皮素酯为槲皮素的ω-3不饱和脂肪酸酯。所述复合物的平均粒径为20-500nm；为了获得更好的稳定性，平均粒径优选为20-50nm。所述白蛋白优选为人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、猪血清白蛋白或羊血清白蛋白中的任意一种。一种上述槲皮素酯-白蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：将槲皮素酯溶于有机溶剂制成有机相，将白蛋白溶于水制成水相，取有机相和水相按照比例混合，分散均匀，除去有机溶剂后制得槲皮素酯-白蛋白复合物的分散液。所述的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、正己烷中的一种或多种。所述分散的方法选自超声波破碎、高压匀质或高速剪切。优选的，所述的制备方法还包括将分散液冷冻干燥成冻干粉的步骤。上述槲皮素酯-白蛋白复合物在制备食品或保健品中的应用。所述应用中，槲皮素酯-白蛋白复合物在食品或保健品中作为抗氧化、降血脂、降糖降压、免疫调节及心血管保护成分。上述槲皮素酯-白蛋白复合物在制备药品中的应用。所述药品用于降低血脂、血压和血糖，扩张冠状动脉，抗炎，抗菌，抗病毒，免疫调节和抗癌。本发明具有以下优点：本发明提供的槲皮素酯-白蛋白复合物，利用具有生物活性的槲皮素与ω-3不饱和脂肪酸在治疗学方面的相加互补特性，合成槲皮素酯，脂溶性增加，抗炎、抗氧化等生物活性增强。本发明提供的槲皮素酯-白蛋白复合物，以白蛋白为载体，其具有亲和性较高的脂肪酸结合位点。所制得的复合物载药量高，稳定性好，可以解决槲皮素化合物亲脂性弱、水溶性差、生物化学性质不稳定、生物利用度低等问题。本发明提供的槲皮素酯-白蛋白复合物制备方法操作简单，条件温和，产率高，涉及的白蛋白、有机溶剂等来源广泛，价格便宜。本发明制备的槲皮素酯-白蛋白复合物应用范围广泛，在食品、保健品、药品制备领域中有良好的应用效果，具有广阔的市场前景。附图说明图1为槲皮素的紫外-可见光吸收谱图；图2为槲皮素-二十碳五烯酸酯的紫外-可见光吸收谱图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。实施例1槲皮素-二十碳五烯酸酯的制备将槲皮素（2g）加入到干燥的反应容器中，缓慢加入100ml无水丙酮，充分混匀，然后加入二十碳五烯酸（10g），充分混匀。取200mg脂肪酶(novozyme435,≧5000u/g,ec3.1.1.3,来自南极假丝酵母）加入上述混合溶液中；将反应容器至于40℃恒温水浴振荡器中反应48h，反应完成后，取出置冰水浴中冷却，终止酶解；有机滤膜过滤除去脂肪酶，旋转蒸发除去有机溶剂，得到粗产物。将95%w/w乙醇50ml加入到粗产物中，加入15g碳酸钠和50ml水，40-50℃回流反应30min，得反应液，用正己烷萃取3次，萃取所得正己烷层用无水硫酸钠除水后，旋转蒸发除去正己烷，得到槲皮素-二十碳五烯酸酯。将槲皮素溶于二甲基亚砜配制成0.3%的槲皮素溶液，于250-500nm波长下进行紫外-可见光扫描，结果如图1所示，其在可见光波段的吸收峰为370nm。将制备的槲皮素-二十碳五烯酸酯溶于二甲基亚砜配制成0.5%的槲皮素酯溶液，于250-500nm波长下进行紫外-可见光扫描，结果如图2所示，其在可见光波段的吸收峰为390nm，说明槲皮素与二十碳五烯酸发生了酯化反应，生成了槲皮素-二十碳五烯酸酯。实施例2槲皮素酯-牛血清白蛋白复合物的制备取20mg牛血清白蛋白溶于50ml去离子水中获得水相，同时取实施例1中的槲皮素酯(2g)溶于100ml正己烷中获得有机相，将水相和有机相置于微射流高压匀质机中，于1200bar压力下循环10次至混合均匀，随后旋转蒸发除去有机溶剂，得到槲皮素酯-牛血清白蛋白复合物溶液，激光粒度仪测定复合物的平均粒径为43.28nm。对比例1槲皮素-牛血清白蛋白复合物的制备取20mg牛血清白蛋白溶于50ml去离子水中获得水相，同时取1.2g槲皮素溶于100ml正己烷中获得有机相，将水相和有机相置于微射流高压匀质机中，于1200bar压力下循环10次至混合均匀，随后旋转蒸发除去有机溶剂，得到槲皮素-牛血清白蛋白复合物溶液，参照实施例2中的方法从测定的复合物的平均粒径为59.10nm。实施例3载药量的研究以实施例2和对比例1制备的不同复合物为例，比较牛血清白蛋白与槲皮素及槲皮素酯相互作用的结合量。以二甲基亚砜为溶剂配制系列浓度的槲皮素或槲皮素酯，分别测定a370（槲皮素）或a390（槲皮素酯），制备槲皮素/槲皮素酯(x)-吸光度(y)的标准曲线，标准曲线分别为y=0.5871x+1.6533，r²=0.9993；y=0.55x+0.9944，r²=0.9997。分别取实施例2和对比例1制备的复合物溶液10ml，缓慢加入过量的硫酸铵粉末，搅拌均匀，直至体系中有未溶解的硫酸铵，再搅拌10min，仍有未溶解的硫酸铵，静置20min后，取出上清液，放入离心管中，4℃条件下离心30min。取上清，用uv-vis分光光度计检测上清液中的槲皮素或槲皮素酯的含量，即游离槲皮素及槲皮素酯的含量（[lf]），而结合的槲皮素或槲皮素酯的量（[lb]）即：[lb]=[l]-[lf]式中[l]即体系中加入的槲皮素或槲皮素酯的总量（mol）。用uv-vis分光光度计检测上清液的吸光值，即游离未结合的槲皮素或槲皮素酯的吸光值，然后根据槲皮素或槲皮素酯的标准曲线来计算[lf]，并根据公式计算[lb]。每个样品重复三次，结果如表1所示。表1牛血清白蛋白结合槲皮素或槲皮素酯的量（mean±sd）样品上清液平均吸光度值平均结合量（mol）槲皮素酯-牛血清白蛋白2.1±0.112.1±0.2槲皮素-牛血清白蛋白4.6±0.37.1±0.2结果显示，每摩尔牛血清白蛋白分子上结合的槲皮素量为7.1mol；每摩尔牛血清白蛋白分子上结合的槲皮素酯量为12.1mol。这表明，牛血清白蛋白对槲皮素和槲皮素酯的结合量有明显的区别，槲皮素酯-白蛋白复合物载药量显著增加。实施例4稳定性研究以实施例2和对比例1制备的不同复合物为例，考察复合物的粒径和自由基清除率。分别将实施例2和对比例1制备的复合物于0、4、8、12、24、48、72h测定其粒径变化情况，测定方法同实施例1。以槲皮素为对照，采用试剂盒（森贝伽sbj-0186s48t）测定两种复合物的总抗氧化能力(abts法)，以考察两种复合物的稳定性和对自由基的清除能力。表2粒径时间(h)04812244872槲皮素-白蛋白(nm)59.1062.0057.2359.5060.9161.3466.74槲皮素酯-白蛋白(nm)43.2844.4542.9343.7444.3243.7543.17表3自由基清除率时间(h)04812244872游离槲皮素(%)75.4553.2448.6245.7340.4631.7625.89槲皮素-白蛋白(%)81.8483.4679.4778.6480.7876.3571.58槲皮素酯-白蛋白(%)89.8891.1788.9787.7490.6389.5690.95两种复合物的粒径变化如表2所示。结果显示，在72h内两种复合物的粒径没有明显变化。两者粒径大小不一是由于牛血清白蛋白和槲皮素及槲皮素酯的相互作用力大小不同，牛血清白蛋白和槲皮素的相互作用力大于和槲皮素酯的相互作用力，所以槲皮素酯-白蛋白粒径较小，表明槲皮素酯-白蛋白复合物稳定性较好。两种复合物对abts自由基的清除能力如表3所示。结果显示，与槲皮素-白蛋白复合物及游离槲皮素相比，槲皮素酯-白蛋白复合物在72h内对abts自由基清除能力明显增强。72h时游离槲皮素的清除率为25%左右，槲皮素-白蛋白复合物的清除率为71%左右，而槲皮素酯-白蛋白复合物的清除率为90%左右，表明以白蛋白为载体制备的槲皮素酯-白蛋白复合物能够显著提高槲皮素对abts自由基的清除能力。实施例5槲皮素-α-亚麻酸酯的制备将槲皮素（2g）加入到干燥的反应容器中，缓慢加入100ml无水丙酮，充分混匀，然后加入α-亚麻酸（18.4g），充分混匀。取180mg脂肪酶(novozyme435,≧5000u/g,ec3.1.1.3,来自南极假丝酵母）加入上述混合溶液中；将反应容器至于60℃恒温水浴振荡器中反应40h，反应完成后，取出置冰水浴中冷却，终止酶解；有机滤膜过滤除去脂肪酶，旋转蒸发除去有机溶剂，得到粗产物。将无水乙醇50ml加入到粗产物中，加入20%碳酸钠溶液100ml，40-50℃回流反应30min，得反应液，用正己烷萃取3次，萃取所得正己烷层用无水硫酸钠除水后，旋转蒸发除去正己烷，得到槲皮素-α-亚麻酸酯。实施例6槲皮素-二十二碳六烯酸酯的制备将槲皮素（2g）加入到干燥的反应容器中，缓慢加入100ml无水丙酮，充分混匀，然后加入二十二碳六烯酸（17.4g），充分混匀。取150mg脂肪酶(novozyme435,≧5000u/g,ec3.1.1.3,来自南极假丝酵母）加入上述混合溶液中；将反应容器至于50℃恒温水浴振荡器中反应48h，反应完成后，取出置冰水浴中冷却，终止酶解；有机滤膜过滤除去脂肪酶，旋转蒸发除去有机溶剂，得到粗产物。将95%w/w乙醇50ml加入到粗产物中，加入16g碳酸钠和100ml水，40-50℃回流反应20min，得反应液，用正己烷萃取3次，萃取所得正己烷层用无水硫酸钠除水后，旋转蒸发除去正己烷，得到槲皮素-二十二碳六烯酸酯。实施例7槲皮素酯-白蛋白复合物的制备取20mg牛血清白蛋白溶于50ml去离子水中获得水相，同时取实施例5中的槲皮素酯(1.5g)溶于100ml正己烷中获得有机相，将水相与有机相置于微射流高压匀质机中，于1200bar压力下循环8次至混合均匀，随后旋转蒸发除去有机溶剂，得到槲皮素酯-牛血清白蛋白复合物溶液，激光粒度仪测定复合物的平均粒径为44.96nm。实施例8槲皮素酯-白蛋白复合物的制备取20mg牛血清白蛋白溶于50ml去离子水中获得水相，同时取实施例6中的槲皮素酯(1.6g)溶于100ml正己烷中获得有机相，将水相和有机相置于微射流高压匀质机中，于1200bar压力下循环6次至混合均匀，随后旋转蒸发除去有机溶剂，得到槲皮素酯-牛血清白蛋白复合物溶液，激光粒度仪测定复合物的平均粒径为42.80nm。实施例9不同粒径的槲皮素酯-白蛋白复合物的制备取20mg牛血清白蛋白溶于50ml去离子水中获得水相，同时分别取三份实施例1中的槲皮素酯(2g)溶于100ml正己烷中获得有机相，将水相和有机相置于微射流高压匀质机中，分别于1200bar压力下循环15、7、3次至混合均匀，随后旋转蒸发除去有机溶剂，得到槲皮素酯-牛血清白蛋白复合物溶液s1-s3，激光粒度仪测定复合物的平均粒径分别为23.59nm、107.44nm和489.70nm。制备后，采用实施例4的方法进行稳定性测定，测试至168h（7d）后，复合物s1的粒径基本无变化；复合物s2和s3的粒径在96h后有变大的趋势，且s3的更为明显。当前第1页12