一组检测水稻非转基因抗除草剂基因OsALS的CAPS标记引物组及其应用的制作方法

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组及其应用。

背景技术：

水稻是全球半数以上人口赖以生存的主要粮食作物，对人类生活和粮食安全具有重要意义。我国种植水稻历史悠久，地域广阔，是世界稻米主产国之一。每年种植面积约3500万hm²，约占粮食作物播种面积的29％。在我国所有稻作区的稻田，历来都有大量杂草发生。据统计，全国稻田杂草有200余种，其中发生普遍、为害严重、最常见的杂草约有40种(分布于各稻区为10～20种)。据调查，全国稻田草害在中等以上(2～5级)的面积达1546.7万hm²，其中严重为害(4～5级)面积为380万hm²，分别占水稻种植面积的46.8％和11.5％，损失粮食200多亿kg。农田杂草与作物争夺养料、水分、阳光和空间，妨碍田间通风透光，增加局部气候温度，有些则是病虫中间寄主，促进病虫害发生；寄生性杂草直接从作物体内吸收养分，从而降低作物的产量和品质。此外，有的杂草的种子或花粉含有毒素，能使人畜中毒。近十几年来，杂草稻成为水稻生产中一种新型草害，是杂交水稻的后代或者亲缘关系较远的水稻杂交后代经过自然和人工选择所形成，具有早发芽、早分蘖、早抽穗、早成熟、易落粒、米质差、休眠期弹性大、繁衍速度快以及难以拔除等特点。

目前，杂草稻已经成为全球性草害，在一些国家，杂草稻造成水稻减产10～15％。在我国，水稻播种面积中杂草稻实际发生面积约占20％，产量平均损失在10％左右，年损失超过100亿元，被称为水稻杀手。因此，防除杂草稻成为目前水稻生产中亟待解决的问题，对于提高水稻的产量和品质有重要的意义。对稻田杂草和杂草稻的防除主要有手工拔草、农具除草及化学除草等手段。手工拔草和农具除草耗力多、工效低，不能大面积及时防除。因此，利用除草剂防除田间杂草和杂草稻是一条最有效途径。乙酰乳酸合成酶(als)是支链氨基酸合成途径中的首要关键酶，以其作为靶标的除草剂分为：磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类和磺酰胺类。这类除草剂具有高活性、杀草广谱和选择性强等特点，是目前防治稻田杂草、再生稻、杂草稻较理想的除草剂。近年来，科学家们通过多种途径获得了一批非转基因抗除草剂水稻突变体，其中一些抗性表现较好的种质材料，已被成功应用于水稻育种。

系谱选育法是当前最为普遍的水稻育种方法，其通过不同亲本配组杂交，获得f1代杂交种，从f2分离世代开始在各世代进行单株选择，直至选出性状符合要求且稳定一致的品系，按系混合收获，经鉴定比较而育成水稻新品种。该育种方法具有操作简单、目标性强的优点，但由于主要依靠看、嗅、摸等方法模糊把握表型性状的优劣，把握准确性较差，一些重要基因在选育过程中容易丢失。目前，运用传统的系谱法选育抗除草剂水稻品种，只能通过喷施除草剂的办法进行抗性鉴定，抗性表型出现需要15～30天时间。在实践过程中受制于喷施时期、喷施浓度、除草剂药效及环境温度、水体等各种因素影响，其抗性稳定性较差、鉴定风险大，且抗性育种年限长、工作量大、生产成本较高。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组及其在水稻育种中的应用，可以快速、准确选育出不同背景的抗除草剂水稻新品种(系)，且还具有工作量小、生产成本低等优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组，所述引物组包括正向引物osals-f和反向引物r，所述正向引物osals-f的核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示，所述反向引物r的核苷酸序列如seqidno.3或seqidno.4所示。

优选的，所述水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记酶切位点位于水稻第2号染色体第18237999bp处，多态性表现为g/a碱基差异。

本发明还提供了上述caps标记引物组在水稻育种中的应用。

本发明还提供了上述caps标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种中的应用。

本发明还提供了上述caps标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。

优选的，所述caps标记引物组通过pcr的方式进行应用。

优选的，所述pcr的方法包括以下步骤：

(1)以水稻基因组dna为模板dna进行pcr反应，得pcr扩增产物；

(2)将所述部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分进行酶切反应；

(3)酶切所述pcr产物后琼脂糖凝胶电泳；根据所述酶切产物的带型判断osals的等位基因型，所述pcr扩增产物大小、内切酶种类及酶切片段大小判断方法如下表所示：

优选的，步骤(1)所述pcr的反应体系以20μl计，包括10μl2×taqpcrmastermix，1μl模板dna，正、反向引物各1μl和7μlddh2o。

优选的，步骤(1)所述pcr的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

优选的，步骤(3)所述酶切的反应体系以10μl计，包括0.3μl限制酶、1μlbuffer、5.7μlddh2o和3μlpcr产物。

本发明提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组，利用snp分子标记进行基因型检测，可以快速、准确地鉴定水稻对咪唑啉酮类除草剂的抗性水平，减少了播种、喷施除草剂、抗性调查等辛苦操作，显著提高非转基因抗除草剂水稻品种的培育效率，同时避免了由于田间操作失误及水体污染等导致其他育种材料致死的风险。本发明所述引物组能够准确地鉴定水稻咪唑啉酮类除草剂抗性。利用本发明所述引物组进行水稻育种时，检测方法准确可靠，操作简便，能够更简单预测水稻除草剂抗性，从而更好的服务非转基因水稻品种的选育或是改良，在分子辅助育种领域，为抗除草剂水稻品种选育或改良提供了科学依据。本发明减少了农事操作，缩短了鉴定时间，提高检测准确性。

附图说明

图1为4组引物pcr扩增产物电泳图；

图2为xsp1酶切产物电泳图；

图3为spe1酶切产物电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组，所述引物组包括正向引物osals-f和反向引物r，所述正向引物osals-f的核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示，所述反向引物r的核苷酸序列如seqidno.3或seqidno.4所示。

本发明所述caps标记引物组的pcr扩增产物大小、内切酶种类及酶切片段大小判断方法如表1所示。

表1caps标记引物组信息

在本发明中，所述水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记位点位于水稻第2号染色体第18237999bp处，多态性表现为g/a碱基差异。

本发明还提供了上述caps标记引物组在水稻育种中的应用。

本发明所述应用优选包括通过化学诱变和抗性筛选，获得抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体，将其与主栽水稻品种杂交，借助分子标记跟踪检测，可以快速、准确选育出不同背景的抗除草剂水稻新品种(系)。水稻osals基因分子标记的设计和应用在实验室完成，避免了各种因素影响，3～4天即可准确鉴定出基因型。本发明所述鉴定优选通过pcr的方式进行，所述pcr的方法优选包括以下步骤：

(1)以水稻基因组dna为模板dna进行pcr反应，得pcr扩增产物；

(2)将所述部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分进行酶切反应；

(3)酶切所述pcr产物后琼脂糖凝胶电泳；根据所述酶切产物的带型判断osals的等位基因型，所述pcr扩增产物大小、内切酶种类及酶切片段大小判断方法如表2所示。

本发明利用pcr进行基因型鉴定时，以水稻基因组dna为模板dna进行pcr，得pcr产物。本发明对所述水稻基因组dna的来源并没有特殊限定，优选利用ctab法提取水稻基因组dna。本发明以所述水稻基因组dna为模板dna进行pcr，所述pcr的反应体系以20μl计，优选包括10μl2×taqpcrmastermix，1μl模板dna，正、反向引物各1μl和7μlddh2o。本发明所述pcr的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

得扩增产物后，本发明将所述部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分扩增产物进行酶切反应。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳的方法并没有特殊限定，优选将所述扩增产物与loadingbuffer按照3:1的体积比混合后，在3％琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统中拍照。在本发明实施例中，利用4组引物pcr扩增产物电泳图如图1所示。

本发明酶切所述pcr产物后琼脂糖凝胶电泳。本发明所述酶切用酶优选与进行所述pcr时所用引物具有相同的酶切位点。本发明所述酶切的体系以10μl计，优选包括0.3μl限制酶、1μlbuffer、5.7μlddh2o和3μlpcr产物，酶切过夜得酶切产物。本发明将所述酶切产物与1μlloadingbuffer混合后，在3％琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统中拍照。本发明根据所述不同引物组合对应的内切酶酶切产物带型判断osals的等位基因型，在本发明实施例中酶解结果的条带如图2和图3所示，其中图2为xsp1酶切产物电泳图；图3为spe1酶切产物电泳图。对所述pcr扩增产物大小、内切酶种类及酶切片段大小判断方法如表2所示：

表2酶切产物判断标准

当带型为一条带时，分子量较大的样品为阳性(+)，即携带有osals基因；分子量较小的样品为阴性(-)，即不携带osals基因；当带型为两条带时，表明该样品为杂合状态(+/-)。

本发明还提供了上述caps标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种中的应用。本发明所述鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种优选利用与上述相同的pcr方法进行。

本发明还提供了上述caps标记引物组在鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型中的应用。本发明所述鉴定抗咪唑啉酮类除草剂水稻基因型优选利用与上述相同的pcr方法进行。

下面结合实施例对本发明提供的一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

鉴别水稻抗除草剂基因osals的caps标记的开发

将水稻osals基因定位在第2染色体上物理位置:18236025-18238371区间内，以其中18237999处snp位点为中心向两侧各扩大了50bp，利用batchprimer3对其进行引物设计。针对该标记，以snp位点具有差异的水稻种质材料津粳818、津粳372、津稻565及其他17个常规粳稻品种进行标记检测验证。具体操作步骤如下：

1、提取待测样品的基因组dna；

2、扩增含snp位点的核苷酸片段。pcr反应体系总体积20μl，包括10μl2×taqpcrmastermix，1μl模板dna，正、反向引物各1μl，7μlddh2o。pcr反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸8min，4℃保存。

3、扩增产物质量检测。取5μl扩增产物与1μlloadingbuffer混合后，在3％琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统中拍照。

4、酶切反应。酶切反应参照takara的内切酶操作指南，用限制性核酸内切酶酶切pcr产物，10μl酶切体系包括0.3μl限制酶、1μlbuffer、5.7μlddh2o、3μlpcr产物，酶切过夜。

5、酶切产物电泳及其判断。3％的琼脂糖凝胶电泳检测，点样后，在250v直流电压电泳20min左右，在凝胶成像系统中拍照，读取各样品的pcr带型；根据不同引物组合对应的内切酶酶切产物带型从而判断出osals的等位基因型，分子量较大的样品为携带osals基因的抗除草剂类型，而分子量较小的样品则不携带als基因；当带型为两条带时，表明该样品为杂合状态。

利用上述方法对20个待测水稻品种的分型结果如表3所示，水稻品种津粳818、津粳372、津稻565携带有抗除草剂基因als(+)，其余17个推广水稻品种均不携带抗除草剂基因(-)。

表3试验材料与分型结果

实施例2

水稻抗除草剂基因osals的caps标记的应用

1、选择包含抗、感除草剂对照品种津粳818和淮119，以及143个回交群体植株和40个f2代分离群体植株为待测样品，提取待测水稻品种的基因组dna。

2、针对实施例1中的snp位点，以待测样品基因组dna为模板，扩增出snp所在的核苷酸片段。

3、pcr扩增反应条件及酶切方法均同实施例1。根据不同引物组合对应的内切酶酶切产物电泳结果，若分子量较大为阳性(携带抗除草剂基因osals)，则待测材料为抗除草剂类型；若分子量较小为阴性(不携带抗除草剂基因osals)，则判定待测材料为不抗除草剂类型；若呈现出双条带，则待测材料为杂合类型，自交后代会出现抗/感分离。

4、分型结果

对139个回交群体植株的检测结果显示，73个株系snp碱基类型为杂合类型(+/-)，56个株系为阳性(+)，14个株系为阴性(-)。

对40个f2代分离群体植株的检测结果显示，21个株系为杂合类型(+/-)，14个株系为阳性(+)，5个株系为阴性(-)。

本发明提供了一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组及其应用，利用分子标记进行基因型检测，可以快速、准确地鉴定水稻对咪唑啉酮类除草剂的抗性水平，减少了播种、喷施除草剂、抗性调查等辛苦操作，显著提高非转基因抗除草剂水稻品种的培育效率，同时避免了由于田间操作失误及水体污染等导致其他育种材料致死的风险。本发明选择的特异性标记位点，能够准确地鉴定水稻咪唑啉酮类除草剂抗性。本发明的检测方法准确可靠，操作简便，水稻osals基因的snp位点的检出，能够预测水稻除草剂抗性，从而更好的服务非转基因水稻品种的选育或是改良，在分子辅助育种领域，为抗除草剂水稻品种选育或改良提供了科学依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所

<120>一组检测水稻非转基因抗除草剂基因osals的caps标记引物组及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgtgctgcctatgatcttaa21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgtgctgcctatgatcacta21

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggtgctttgccaacatacagat22

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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