一种鸡呼肠孤病毒变异毒株BB18株的制作方法

本发明属于疫苗抗原微生物筛选技术领域，具体涉及一种鸡呼肠孤病毒变异毒株。

背景技术：

鸡呼肠孤病毒(chickenreovirus,reo)又称“鸡病毒性关节炎”，各品种和日龄的鸡均可感染发病，其中以北方白羽肉鸡最为多见，该病不但可以水平传播，还可垂直传播，造成生产性能的极大降低，严重危害养鸡业的发展。禽呼肠孤病毒广泛存在并影响各种禽类，包括鸡、鸭，鹅，造成巨大的经济损失，特别是在肉鸡上造成病毒性关节炎、呼吸系统疾病、肝炎、心肌炎、免疫抑制和发育迟缓综合症等临床症状。呼肠孤病毒是一种分节段双链rna病毒，病毒核酸不稳定，极易发生碱基突变、缺失或基因重组，从而导致新毒株的出现。近年来，我国水禽上不断的有新型变异呼肠孤病毒引起发病的报道，这些病毒都属于水禽源分离株，与鸡源分离株在基因组结构和致病性上有较大差异。而且考虑到已有的流行毒株会发生变异，导致已制备的疫苗保护效率下降。因此需要筛选新变异的病毒株来制备疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种鸡呼肠孤病毒变异毒株，该病毒株相比于已报到的经典株发生了变异，能够用于制备疫苗。

本发明所提供的鸡呼肠孤病毒株，为肉鸡呼肠孤病毒bb18株，已于2019年2月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为保藏编号为cctccno:v201908；

本发明的鸡呼肠孤病毒bb18株可用于制备疫苗；

所述的疫苗为灭活疫苗。

本发明再一个方面提供一种灭活疫苗，是使用鸡呼肠孤病毒bb18株作为抗原制备的。

所述的灭活疫苗，其制备方法如下：

1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用；

2)水相制备：将灭活的鸡呼肠孤病毒bb18株抗原液96份与灭菌后的4份吐温-80混合，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解；

3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟完成制备。

本发明通过对采集的病料进行病原分离获得了一株鸡呼肠孤病毒，经过全基因组序列测定与分析、病毒中和试验以及动物回归试验，确定所筛选的病毒为我国白羽肉鸡上流行的呼肠孤病毒的变异株，该变异株处于一个独立的新进化分支，可用于制备灭活疫苗，为我国养禽场对该病的综合防控提供基础。

附图说明

图1：bb18株接种spf鸡胚后产生的病变，其中a:正常绒毛尿囊膜；b：增厚的绒毛尿囊膜；c：死亡鸡胚肝脏出血、坏死；d：死亡鸡胚典型脚趾出血；e正常胚；

图2：分离株bb18的rt-pcr鉴定图，其中m:dna分子量标准；1：阳性对照；2和3为绒毛尿囊膜f3-bb18；n为阴性对照；

图3：分离株bb18的外源病毒rt-pcr检测图，其中m:dna分子量标准；ibv：鸡传染性支气管炎病毒；ibdv：鸡传染性法氏囊病毒；fav：鸡腺病毒；ciav：鸡传染性贫血病毒；rev：禽网状内皮增殖症病毒；alv：禽白血病病毒；

图4：bb18株与鸡呼肠孤病毒参考毒株σc蛋白在氨基酸水平的遗传进化树分析图；

图5：鸡呼肠孤病毒在spf鸡上的攻毒保护试验临床病变图，其中a图是攻毒对照组鸡腿病变，b图是免疫发病组鸡腿病变，c图是生理盐水组鸡腿病变图；

图6：bb18株与参考毒株部分核苷酸序列比对图；

图7：bb18株与参考毒株部分氨基酸序列比对图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：病原分离及鉴定

一、分离病毒

2018年3月10日安徽蚌埠地区某白羽肉鸡养殖场，从18日龄开始，每天陆续在鸡群中出现瘫痪、瘸腿鸡只，日死淘虽然不高，但影响采食量，发病鸡只后期体重明显低于正常鸡只，后期(尤其是30日龄以后)随着鸡只增重迅速，常因跗关节细菌感染和运动障碍造成被踩踏死亡，生产成绩极差。无菌采集白羽肉鸡病死鸡跗关节跟腱和渗出液等组织，剪碎研磨，按照1:5体积加入生理盐水，匀浆器匀浆后加双抗各1000u，反复冻融三次，5000rpm4℃离心15min，吸取上清液，0.22μm滤器过滤除菌。将上述滤液经绒毛尿囊膜接种spf鸡胚10枚，接种量为0.2ml/枚。接种后置于37℃生化培养箱恒温孵化。弃掉24h以内死亡的鸡胚，连续观察7天，收获24h～168h死亡及未死的鸡胚绒毛尿囊膜，-80℃冻存备用。

经绒毛尿囊膜初次传代的鸡胚基本无明显可见变化，经第二代盲传后，鸡胚在接种后48h～120h陆续死亡，打开鸡胚，可见绒毛尿囊膜增厚明显，尿酸盐沉积严重，胚体发育迟缓，全身水肿、出血，剖检鸡胚见肝脏出血、发绿或白色坏死点(图1)，收集此时的尿囊膜和尿囊液，经检验无细菌污染和病毒无血凝活性，暂命名为bb18株，-80℃保存备用。bb18株于2019年2月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为保藏编号为cctccno:v201908；

二、病毒的分析

1、pcr鉴定

1)病毒rna的提取及反转录

在1.5ml离心管中加入300μl病毒绒毛膜研磨上清液，加入700μltrizolreagentrna提取液，混匀，室温放置15min。加入200μl氯仿，充分震荡混匀，室温静置10min。4℃、12000rpm离心15min，取上清液500μl转移至经depc处理的1.5ml离心管中。加入预冷的异丙醇500μl，-20℃静置30min后，12000rpm离心15min，弃掉上清。加入1ml75％乙醇，8000rpm离心5min，倒掉液体。倒置于纸上干燥，将沉淀悬于30μl的rna-freewater中，-80℃保存备用。按照反转录酶使用说明书对提取的rna进行反转录，将合成的cdna于-20℃保存备用。

2)pcr扩增

采用25μlpcr反应体系：premixtaq(takarataq^tmversion2.0)12.5μl，上游引物p1：5'-ggtaacgtacattgtcaag-3'和下游引物p2：5'-gggcacartcgtaytcaca-3'(均10μm)各1μl，cdna模板2μl，ddh2o补加至25μl。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，53℃30s，72℃40s，循环35次；循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

3)pcr鉴定结果

pcr反应结束后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果并拍照。电泳结果显示特异性目的片段大小为490bp(图2)，与预期片段大小相符。表明试验中分离到了鸡呼肠孤病毒，尿囊液ha试验均为0，表明不含有血凝性外源病毒污染(禽流感病毒、副黏病毒和腺病毒ⅲ群)，rt-pcr对ibv、ibdv、fav、ciav、rev和alv外源病毒检测证明鸡呼肠孤病毒中不含有其它外源病毒污染(图3)。

2、全基因组序列测定及核苷酸-氨基酸同源性分析

从genbank下载已知鸡源呼肠孤病毒分离株的序列，分析比对后，用primer5.0软件设计呼肠孤病毒全基因组序列的引物，采用rt-pcr方法扩增各基因节段序列。根据测定的序列，为bb18株各基因节段的末端分别设计2条特异性下游引物，将接头引物作为上游引物，应用5'race(rapid-amplificationofcdnaends)技术，获得各基因节段的末端序列。通过核酸扩增、序列测定和拼接，获得了bb18株的全基因组序列。采用easypurequickgelextractionkit回收pcr产物，连接于peasy-bluntcloningvector或pmd18-tvector(promega)转化trans-5α感受态细胞，经鉴定后测序。利用dnaman软件，预测各基因节段orf的位置和数量，推导氨基酸序列，分析编码蛋白情况。用blastn分析各基因编码情况。采用clustalw1.8比对不同鸡源毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性，通过mega6.0构建进化树。将测得的肉鸡呼肠孤病毒bb18株10个基因片段分别于与genbank上已发表的鸡呼肠孤病毒病毒序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。

结果表明，鸡呼肠孤病毒编码的10个蛋白中，有7个蛋白(λa、λb、λc、μa、σa、σb、σns)的核苷酸序列相对保守，其翻译的氨基酸序列高度同源，在95％上下浮动；有2个蛋白(μb、μns)在核苷酸序列上同源性较低，但氨基酸序列同源性较高；而决定鸡呼肠孤病毒抗原性的主要抗原基因s1及其编码的σc蛋白在不同分离株之间的同源性更低，在核苷酸和氨基酸水平上变异度均较大，同源性分别在60.6％～78.2％和18.7％～61.0％之间(表1、表2)，其比对图见图6和图7。而抗原基因s1及其编码的σc蛋白是区分不同鸡呼肠孤病毒血清型毒株的重要参考，是区分鸡呼肠孤病毒经典株和变异株的依据。分子生物学分析结果表明新分离的鸡呼肠孤病毒变异毒株bb18株处于一个独立的新进化分支，与鸡呼肠孤病毒经典株有着明显区别，主要表现为各基因片段核苷酸之间的点突变和基因重组。

表1：鸡呼肠孤病毒bb18株与参考毒株核苷酸相似性比较表

表2：鸡呼肠孤病bb18株与参考毒株的氨基酸相似性比较表

3、疫苗的制备及病毒中和试验

3.1疫苗的制备

3.1.1鸡呼肠孤病毒的繁殖将毒种(s1133株、bb18株)用灭菌生理盐水作10000倍稀释，经绒毛尿囊膜接种10日龄spf鸡胚，每胚0.2ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不必翻胚。每日照胚1次，将48h内死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6h照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至168h，将仍健活的鸡胚弃掉，保留48-168h内已死亡的鸡胚备用。气室向上直立，置于2～8℃冷却4～24小时。

其中禽呼肠孤病毒s1133株(购自中国兽医药品监察所)

3.1.2收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊膜和尿囊液。吸取胚液放于1l灭菌瓶内，用剪刀和镊子剥离鸡胚绒毛尿囊膜于研钵内充分研磨(加石英砂)，而后将研磨液转移至盛放胚液的灭菌瓶内，于-80℃冰箱反复冻融三次，4℃离心机内5000rpm离心30min，小心的将上清液转移至无菌瓶内。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验。收获的上清液灭活前在2～8℃保存。

3.1.3灭活在收获的鸡呼肠孤病毒液中加入10％甲醛溶液，使甲醛的最终浓度为0.1％。37℃摇床内，200rpm震荡灭活24小时后取出，放2～8℃保存。

3.1.4半成品检验

(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)病毒含量测定将收获的病毒液(灭活前取样)用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-85个稀释度，分别经绒毛尿囊膜途径接种10日龄spf鸡胚，每胚0.1ml，同时设接种生理盐水对照5枚，每胚0.1ml。置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察168h。观察并记录每枚胚死亡情况，并计算eeld50,起重病毒含量应不低于106.5eeld50/0.1ml。

(3)灭活检验取10日龄spf鸡胚6个,每个尿囊腔内接种灭活的病毒液0.2ml，每日照胚2次，观察7日，同时收取胚液和绒毛尿囊膜再盲传2代，观察7日，观察并记录鸡胚死亡情况。结果灭活彻底，无死胚。

3.1.5灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－805份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

(2)水相制备将灭活的鸡呼肠孤病毒s1133株抗原液、鸡呼肠孤病毒bb18株抗原液各96份分别与灭菌后的吐温-804份混合，在水相制备罐中搅拌至吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

3.1.6疫苗成品检验

3.1.6.1性状

外观:疫苗为乳白色乳剂，无杂质并且外包装合格。

剂型:为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外均不扩散。

稳定性:吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5ml。

黏度:按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

3.1.6.2安全检验:用7日龄spf鸡10只，每只颈部皮下注射二联疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。

结果表明，试验组和对照组鸡只发育正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。说明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

3.1.6.3效力检验:

用21日龄spf鸡10只，每只颈部皮下注射鸡呼肠孤病毒疫苗，0.3ml/只，另取5只同日龄鸡不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定抗体。免疫组的抗体效价不低于5.0log2vn抗体；对照组应均为阴性。

3.2病毒中和试验

将鸡呼肠孤病毒bb18株和s1133株，经继代和纯化按上述方法制成灭活疫苗，分别免疫21日龄spf鸡，免疫剂量0.5ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，三免后2周进行采血分离血清。将bb18株、s1133株病毒液分别稀释至200tcid50/0.1ml，逐一与bb18株和s1133株的阳性血清等体积混合，37℃震荡中和1小时后，每个中和组接种10日龄spf鸡胚5枚，0.2ml/枚，每隔24h照胚一次，弃掉24h以内死亡的鸡胚，连续观察至168小时。结果发现用bb18株阳性血清与bb18株病毒中和后接种的5枚spf鸡胚均无死亡；用s1133株的阳性血清与bb18株病毒中和后鸡胚出现死亡；病毒对照组鸡胚4/4死亡。结果表明本发明筛选的bb18毒株作为抗原制备的阳性血清对本发明筛选的病毒的中和能力明显好于s1133毒株制备的阳性血清，表明本发明筛选的bb18毒株为一株发生变异的新的病毒株。

4、攻毒保护试验

将鸡呼肠孤病毒s1133株和bb18株在spf鸡胚绒毛尿囊膜上进行培养，并进行eeld50的测定，使用传代培养后的f3代毒液制备抗原，毒株抗原滴度为10-6.5eeld50/0.1ml，用终浓度1.5‰的甲醛37℃灭活24h，按照油相：水相＝2:1的比例制备成灭活疫苗，并与市售的新支法关(s1133+1733)商品疫苗进行试验比较。将72只7日龄的spf鸡分为4大组(免疫组)，18只/组，每组鸡分别胸肌注射s1133、bb18、新支法关(s1133+1733)鸡呼肠孤病毒灭活疫苗，0.5ml/只，并设对照组(不做任何处理)，2周后进行第二次免疫0.5ml/只，二免后第3周采血分离血清并用s1133、bb18鸡呼肠孤病毒尿囊膜毒脚垫攻毒，并设正常spf鸡胚尿囊膜研磨液为攻毒对照，剂量为0.1ml/只。每日观察鸡群精神状态、采食及发病情况，尤其是鸡只脚垫在攻毒前后的变化，持续20天，结果如下表3。

表3：攻毒前各组鸡呼肠孤病毒reo抗体s/p值(elisa法)

表4：鸡呼肠孤病毒s1133、bb18、新支法关s1133+1733之间的攻毒保护试验结果表

注：表示保护数/攻毒总数，攻毒对照组鸡脚垫均无肿胀现象。

攻毒保护试验结果表明，鸡只免疫呼肠孤病毒s1133株灭活疫苗能对s1133株本毒提供完全的保护，该组鸡只未表现任何临床症状，也无死亡现象，而对bb18株毒只能够提供部分保护，该组发病鸡只关节肿胀、跛行，跗关节发热，划破后流出血红色液体，其中夹杂着血凝块，与临床发病病例剖检完全一致(图5)。呼肠孤病毒bb18株灭活疫苗只能对bb18株本毒提供完全的保护，对s1133株毒能够提供部分保护，这说明肉鸡呼肠孤病毒s1133株和bb18株之间的交叉保护性较差，也说明本研究所分离到的鸡呼肠孤病毒毒株为经典毒株s1133的变异株，与经典毒株在攻毒保护上有着显著的差异，因此对于现阶段我国鸡呼肠孤病毒的疫苗预防中，应添加经典毒s1133株和bb18株两个血清型的病毒作为疫苗抗原，方能对目前流行的白羽肉鸡病毒性关节炎疾病起到很好的预防作用。试验中还发现，市售的商品疫苗新支法关对s1133毒株和bb18毒株均不能提供完全的保护，从二免后的血清抗体水平来看，商品疫苗新支法关组鸡群抗体水平明显低于单苗s1133组和bb18组，这可能与商品疫苗新支法关疫苗中鸡呼肠孤病毒的抗原含量偏低有很大关系，由于四联疫苗要求的疫苗工艺比较高，需要将鸡呼肠孤病毒高度浓缩，使之与单苗的抗原含量一致才能激发足够高的血清循环抗体水平，从而产生很好的保护作用。