本发明属于基因检测与疾病诊断领域，具体涉及一种弥漫性大b细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒。
背景技术：
弥漫性大b细胞淋巴瘤(diffuselargeb-celllymphoma，dlbcl)是一种常见的非霍奇金淋巴瘤，约占非霍奇金淋巴瘤的50％，占淋巴瘤整体发病的30％。dlbcl首次在1994年被定义了该分类，并在后续的世界卫生组织(who)指南中不断的补充其新亚型。在2008年的who指南中将dlbcl定义为：弥漫增生的大b细胞恶性肿瘤，瘤细胞核大于或等于正常吞噬细胞核，或大于正常淋巴细胞的2倍。dlbcl在临床上表现出一定的异质性，并以迅速增大的无痛性肿块为典型表现，肿瘤主要原发于淋巴结内，但有30％左右患者发生于淋巴结外，一般呈局限性病灶。dlbcl的临床过程呈侵袭性，多为单个淋巴结或结外病灶出现迅速长大的局限性肿块，约1/3的患者有全身症状。dlbcl病因复杂，可原发或者从其他低度侵袭性淋巴瘤转化而来(如滤泡性淋巴瘤、慢性b淋巴细胞白血病/小淋巴瘤细胞淋巴瘤等)。
dlbcl下属亚型又分数种，包括非特指型dlbcl、t细胞/组织细胞丰富的dlbcl、原发于中枢神经系统的dlbcl、原发于皮肤的dlbcl(腿型)，及老年人eb病毒阳性的dlbcl等。其中又以非特指型dlbcl(dlbcl-nos)为最常见类型，该型dlbcl主要有转化的大淋巴样细胞组成。根据形态学特点，可分为常见形态变异型及罕见形态变异型，前者包括中心母细胞性、免疫母细胞性、间变大细胞性淋巴瘤、富于t细胞/组织细胞性的b细胞淋巴瘤等；后者包括浆母细胞性淋巴瘤及表达间变性淋巴瘤激酶(alk)全长的淋巴瘤。
基于人类基因组计划的完成，近年来医学进入了飞速发展阶段。针对于dlbcl的研究也取得了重要成果。2000年cdna微阵列技术被首次运用于dlbcl分型，根据基因表达谱将dlbcl分为两类，生发中心b细胞样(gcb型)和活化的外周血b细胞样(abc型)。两型dlbcl来源于不同分化发育阶段的b细胞：gcb型起源于生发中心细胞，而abc型来自后生发中心细胞(pgc)。随后又发现一类基因表达与gcb型和abc型不同，但预后与abc型无显著差异的第3型(与abc型合称非gcb型)。gcb型预后明显较好，治疗后gcb型和非gcb型的5年生存率分别为76％和34％。
在分子方面，dlbcl已经有多篇研究报告其相关的分子特征。约3/4的dlbcl存在着基因重排，bcl2、bcl6、myc等属于dlbcl的典型重排基因。而在基因突变方面，dlbcl已经被研究报道了一系列的突变基因。诸如著名的myd88基因l265p突变位点、ezh2的y646突变位点和cd79b基因的y196突变位点等等。这些突变位点影响着dlbcl的分型判定、预后分层以及药物敏感性等等。例如ezh2的y646突变常见于gcb型dlbcl中，而gcb型dlbcl普遍研究表明其疾病预后较好，具有该突变的患者可以尝试采用tazemetostat(临床2期)等抑制剂进行治疗。另外诸如cd79b基因的y196突变常见于abc型弥漫大b细胞淋巴瘤中，该亚型预后较差，具有该突变的患者可能对伊布替尼、fostamatinib等药物敏感。整体而言，分子水平的突变检测对于dlbcl的整体诊断评估意义巨大，随着研究的不断深入，一些新的基因及相关突变模式、突变位点对dlbcl的影响机制也随之被发现。
高通量测序技术，又称为下一代测序技术(nextgenerationsequence，ngs)是近年来发展成熟的一项革命性技术。一次性对一个样本进行数十个数百个基因的检测，能良好的对疾病的分子特征进行整体评估。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供kcng1基因在制备dlbcl辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的还在于提供包含kcng1基因在内的基因组合在制备dlbcl基因突变检测试剂盒中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明发现了多例dlbcl患者的kcng1基因存在g185a突变，表明kcng1基因与dlbcl的发生存在一定的联系，通过检测kcng1基因是否存在g185a突变可用于dlbcl的辅助诊断。基于此，kcng1基因具有制备dlbcl辅助诊断试剂盒的应用。进一步地，扩增kcng1基因的引物也具有制备dlbcl辅助诊断试剂盒的应用。更进一步地，一种dlbcl辅助诊断试剂盒，包含扩增kcng1基因的引物。
现有技术已确定与dlbcl发生有关的基因突变包括myd88、cd79b、ezh2、b2m、notch2、stat6、tp53等基因的突变，与本发明发现的与dlbcl发生相关的kcng1基因结合，检测这些基因的突变情况对于dlbcl的诊断、分型判定、预后分层以及药物选择等有重大意义。基于此，本发明提供一种基因组合在制备dlbcl基因突变检测试剂盒中的应用，所述的基因组合包括myd88、cd79b、ezh2、b2m、notch2、stat6、tp53、kcng1基因。进一步地，扩增该基因组合中各基因的引物也具有制备dlbcl基因突变检测试剂盒的应用。
高通量测序技术能够一次性对一个样本进行数十到数百个基因进行检测，本发明进一步提供一种基于高通量测序技术的dlbcl基因突变检测试剂盒，以检测包含myd88、cd79b、ezh2、b2m、notch2、stat6、tp53、kcng1基因在内的基因组合中各基因的突变情况。为了检测上述基因组合中各基因的突变情况，需要建立测序文库进行测序。以采用多重pcr法构建测序文库为例，本发明设计了检测这些基因全部外显子区域的引物库，经过了引物及引物之间的错配评估及大量实验验证，将导致错配发生的引物去除并引入新的不会导致引物间错配的引物序列，得到由表1中的引物组成的引物库，保证了基因组合中各基因的高检测质量，保证了每个特异性目的片段均能正常扩增。
表1引物信息
上述引物库能够用于制备检测dlbcl基因突变的高通量测序文库以及dlbcl基因突变检测试剂盒。
一种制备检测dlbcl基因突变的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)以待检样本的基因组dna为模板，使用引物库中的引物进行多重pcr反应，得到含有dna片段集合的混合物；
(2)向步骤(1)获得的混合物添加ngs测序标签(index)，然后在两端连接测序所需的接头，利用磁珠进行纯化，获得带测序接头的目标dna片段混合物，即获得高通量测序文库。
进一步地，步骤(2)中的ngs测序标签(index)和接头，采用illumina通用index、illumina通用接头，获得高通量测序文库的结构为：
tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag-xxxxxxx-aaaaaaaaaa-ctgtctcttatacacatctccgagcccacgagac。其中，第一部分以及最后一部分碱基序列为illumina测序所需的两端接头碱基序列，“xxxxxxxx”为不同序列的index，用以区分不同样本的dna数据，“aaaaaaa”为pcr产物，其长度在150bp左右。另外，接头序列包括并不仅限于上述序列，可以为其它illumina对应接头序列。所述的ngs测序标签(index)和接头也可以为lifetech的index、接头。
一种dlbcl基因突变检测试剂盒，包含扩增上述基因组合中各基因的引物，或包含上述引物库。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明发现了kcng1基因的g185a突变与dlbcl的发生存在一定的联系，为dlbcl的辅助诊断提供了新的材料。
(2)本发明能够一次性检测包含myd88、cd79b、ezh2、b2m、notch2、stat6、tp53、kcng1基因的基因组合的突变情况，为dlbcl的前期诊断、分型判定、预后分层及用药指导提供了依据。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
样品的收集和样品资料的整理：申请人收集了国内118例dlbcl患者福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)切片样本，每个样本均采集患者口腔拭子作为病人的内部对照。样本的收集过程符合以下条件：
(1)所有患者样本均为通过病理切片、染色体核型分析、免疫学、流式细胞术等多方法学综合诊断为弥漫性大b细胞淋巴瘤患者样本；
(2)所有患者样本均来源于首诊时采集的淋巴结样本及1个月内采集的口腔拭子对照样本；
(3)所有的样本均配套采集了相关的临床资料。
基于上述要求收集的样本，采用商业化的dna提取试剂盒(凯杰qiagen，《genereaddnaffpekit》)提取dna，采用试剂盒xgenexomeresearchpanelv1.0(货号：1056115)进行全外显子测序，测序平台为illuminaxten。采用数据分析软件bwa和gatk进行基因组数据比对以及排序，利用varscan软件进行vcf文件生成，利用annovar软件进行突变结果注释。
基于上述全外显子的检测分析结果，本发明发现在118例dlbcl患者样本中有2例患者样本的kcng1基因(ncbi转录本号：nm_002237)存在g185a突变，占比1.69％。g185a突变位于kcng1基因外显子2上，kcng1基因编码蛋白的第62位氨基酸由精氨酸突变为组氨酸。现有的报道中，dlbcl主要突变集中在myd88、cd79b、ezh2、b2m、stat6、notch2、tp53等基因，本发明发现的kcng1基因突变比例低于这些基因的突变比例。
上述发现表明kcng1基因的g185a突变与dlbcl的发生存在一定的联系，可将kcng1基因用于dlbcl的辅助诊断，即通过检测kcng1基因是否存在g185a突变来对dlbcl进行辅助诊断。
实施例2
基于本发明发现的kcng1基因的g185a突变与dlbcl之间的关系，本发明提供一种基于高通量测序技术的dlbcl基因突变检测试剂盒，该试剂盒检测基因包括：本发明发现的与dlbcl相关的kcng1基因，与现有技术已报道的myd88、cd79b、ezh2、b2m、notch2、stat6、tp53基因。该试剂盒的检测范围为上述基因的全部外显子区域，其主要组分包含上述表1中的引物。该试剂盒基于高通量测序技术，通过多重pcr构建测序文库，对文库进行测序及数据测序，以检测上述基因是否存在突变。具体实施流程如下：
(1)样本dna的提取：采用商业化的dna提取试剂盒(凯杰qiagen，《genereaddnaffpekit》)，从ffpe样品中提取基因组dna，采用nonodrop测定dna260/280质量，利用qubit仪器检测dna浓度。
(2)测序文库制备：
将上述得到的基因组dna样本进行建库，所用试剂盒为ampliseqlibraryplusforillumina，流程如下：
a)按如下体系配制反应液：
备注：y为10ngdna所需加入的液体体积。
其中，高保真pcr反应液为ampliseqlibraryplusforillumina试剂盒中的试剂。
b)将上述步骤a)加入dna的反应液放入到热循环仪中按照如下程序进行pcr反应：
c)将1μlfupa溶液加入到上述步骤b)得到的pcr反应液，混匀后放置于热循环仪中进行如下反应以消化引物序列：
其中，fupa溶液为ampliseqlibraryplusforillumina试剂盒中的试剂。
d)上述步骤c)反应结束后，往反应液(11μl消化的扩增子)中加入如下组分进行下一步反应液配制：
其中，switch溶液、dna连接酶为ampliseqlibraryplusforillumina试剂盒中的试剂；特异性标签、接头混合液为amplisqcdindexessetaforillumina试剂盒中的试剂。
e)将上述步骤d)配制的反应液放置于热循环仪中进行如下反应：
f)上述步骤e)反应结束后，将反应液按如下步骤进行纯化：
打开pcr管或96孔板薄膜，每管/孔加22.5μl(1.5×样本体积)ampurexp磁珠，移液器上下吹打5次，将dna和磁珠充分混匀。
混合液室温孵育5分钟。
将混合液放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心的去除上清，不要扰动磁珠。
每管加150μl新配制的70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。
重复上一步骤一次。
确保所有乙醇被除尽，pcr管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟。
g)待步骤f)中乙醇完全干燥后，开pcr管或96孔板薄膜，每管/孔加25μl高保真platinumpcr混合液，1μl文库扩增引物。高保真platinumpcr混合液和文库扩增引物可以提前混匀。其中，高保真platinumpcr混合液、文库扩增引物为ampliseqlibraryplusforillumina试剂盒中的试剂。
h)将步骤g)中加入pcr混合液与文库扩增引物的pcr管或96孔板放置于热循环仪上，进行如下反应：
i)反应结束后每管/孔加12.5μl(0.5×样本体积)ampurexp磁珠，每管大约25μl样本。盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀，室温孵育5分钟。
j)将pcr管或96孔板放到磁力架上，至少5分钟，直到溶液澄清。
k)紧接着上面步骤，每管/孔加30μl(1.2×样本体积)ampurexp磁珠，每管大约25μl样本。盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀，室温孵育5分钟。
l)将pcr管或96孔板放到磁力架上，静置2分钟，直到混合液变清澈。小心的去除上清，不要扰动磁珠。
m)每管加150μl新配制的70％乙醇，转动管壁，使磁珠从管壁的一侧转到另一侧，重复几次，吸弃上清，不要扰动磁珠。
n)重复上一步骤一次。
o)pcr管或96孔板放在磁力架上，室温空气干燥5分钟，确保所有乙醇被除尽。
p)各pcr管或96孔板每孔加25μl去核酸水溶解ampurexp磁珠，盖上pcr管或96孔板薄膜。涡旋混匀或移液器上下吹打5次混匀。
q)将pcr管或96孔板放到磁力架上，至少2分钟，直到溶液澄清。小心吸取上清20μl，上清即文库，做好标记。
r)将上述文库进行qubit仪器质控检测，并记录浓度。浓度低于0.2ng/μl的文库视为不合格文库。
(3)文库测序：
将上述制备的文库按illumina测序流程操作进行测序。
(4)数据分析：
a)测序得到的原始总数据经过机器拆分后，得到不同样本的原始测序数据。
b)利用bwa软件对数据进行比对，比对到人类基因组数据库hg19参考序列上，同时筛除低于q30质量的数据。
c)利用gatk软件将上述数据针对hg19数据库进行排序。
d)利用varscan软件对上述处理完毕后的数据进行进一步分析得到所需的snp及indel信息。
e)利用falsefliter进行假阳性突变的过滤，生成最终的vcf文件。
f)通过annovar软件进行上述snp及indel进行注释，并结合clinvar、cosmic、pubmed等数据库整理突变意义信息。
去掉对临床指导没有帮助的突变结果，保留具备明确临床指导的突变位点及注释信息。
实施例3
选取实施例1中的2例kcng1基因g185a突变样本，以及另外20例dlbcl福尔马林固定石蜡包埋切片(ffpe切片)样本、10例正常人外周血样本，使用实施例2中的试剂盒，按照其实施流程进行检测，检测结果如下：
表2试剂盒下机数据质控表
样本编号n开头表示为正常人样本，d开头为dlbcl样本，e开头表示为实施例1中的全外显子测序得到的kcng1基因g185a突变的样本，测序质量>30、深度>500、均一性>80％的测序结果视为合格的样本测序结果，表2中显示上述的所有样本均显示测序结果合格。
在本次实验中，所有试剂盒相关基因检测突变结果如下：
表3本次实验中所有样本的突变检测结果
表3中可知，实施例1中2例样本kcng1基因的g185a突变在本次检测结果中均被良好的重复出来，且在另外20例dlbcl样本中检测到1例样本的kcng1基因存在g185a突变。
上述检测结果中，dlbcl样本中myd88基因突变占比25％，符合目前国际文献、研究报道中的比例；10例正常人样本中的检测结果均为阴性；dlbcl样本中的存在基因突变的整体阳性检出率为65％，能达到较好的辅助诊断dlbcl结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>珠海铂华生物工程有限公司
<120>一种弥漫性大b细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒
<160>16
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ggacagtgacatcttgttcggaagt25
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
acactagaacatcagcagaggggcc25
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
acattccttaagtgaaatttgtgta25
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tgttgttaatatgtatggcattagc25
<210>5
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
ccgccggctttcgctttccgagaag25
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
tgagatctggagaggtccacggcac25
<210>7
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
caactttttattgccttctcaccag25
<210>8
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
gctttcaggactgctcaacaaaaaa25
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
tcccctatcccattctccctctcaa25
<210>10
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
taactgctcagataggtgctgcggt25
<210>11
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
ccgaatgctgtcagcttcaggaatg25
<210>12
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
ttcccgttttcagtttccttttctt25
<210>13
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>13
tccctttttatatcccatttttata25
<210>14
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
acctgagtctgcaatgagtgtgggc25
<210>15
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>15
gagccacaggaacatcattcctctc25
<210>16
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>16
atgtgggcacttctgttgtttgaat25