琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程
技术领域：
，特别涉及一种琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用。
背景技术：
：琼脂是一种来源于红藻细胞壁中的杂多糖，主要由由琼脂糖和琼脂胶两种多糖组成。琼脂或者琼脂糖经琼脂糖酶水解可以得到具有生物活性的寡糖物质，利用琼脂糖酶的这一特性，琼脂糖酶在工业生产中和生物学研究中均具有重要的应用价值。然而，在工业生产以及生物学研究中，往往存在以下问题：琼脂糖酶往往对固体底物活性很差，但琼脂糖液化温度却高于60℃；颗粒状酶功效更佳，但酶产品在颗粒化时需要经历80℃高温过程；此外，在工业化生产时ph环境也会随着工艺条件发生变化，但目前已有的琼脂糖酶对高温以及酸碱性环境的适应性均较差，并不能适应上述应用场景，这极大地限制了琼脂糖酶的应用和发展，因此，需要发掘出具有良好的热稳定性和ph稳定性的琼脂糖酶。技术实现要素：本发明的主要目的是提出一种琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用，旨在提供一种琼脂糖酶，该琼脂糖酶具有较好的热稳定性和ph稳定性。为实现上述目的，本发明提出一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶的氨基酸序列如seqidno：2所示。本发明还提出一种琼脂糖酶基因caagaa，用于编码上述琼脂糖酶，所述琼脂糖酶基因caagaa的核苷酸序列如seqidno：1所示。本发明还提出了一种重组质粒，携带权利要求2所述的琼脂糖酶基因caagaa。优选地，所述重组质粒包含表达载体pet-28a。本发明还提出了一种重组菌株，包含上述的琼脂糖酶基因caagaa。优选地，所述重组菌株由包含上述的琼脂糖酶基因caagaa的重组质粒转化大肠杆菌bl21(rosetta)获得。此外，本发明还提出了上述的琼脂糖酶在新琼寡糖的制备中的应用。以及，本发明还提出了上述的琼脂糖酶在琼脂糖凝胶电泳后的核酸回收中的应用。本发明技术方案中，提供了琼脂糖酶基因caagaa、携带该基因的重组质粒以及重组菌株，该琼脂糖酶基因caagaa可以编码出一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶不仅具有较高的催化活性，可有效地将琼脂或琼脂糖水解为4和6个残基的新琼寡糖，从而可用于生物活性新琼寡糖的制备，而且具有极佳的热稳定性和ph稳定性，从而拓展了琼脂糖酶的应用场景，降低了其应用时的工艺难度，减少了投入成本，因此，本发明提供的琼脂糖酶在工业生产中具有更强的适用性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明提供的琼脂糖酶的sds-page测试结果图；图2为本发明提供的琼脂糖酶在不同ph值下的酶活测定结果图；图3本发明提供的琼脂糖酶在不同ph值下的稳定性测试结果图；图4为本发明提供的琼脂糖酶在不同温度下的酶活测定结果图；图5为本发明提供的琼脂糖酶在不同温度下的稳定性测试结果图；图6为本发明提供的琼脂糖酶在不同金属离子环境中的酶活测定结果图；图7为本发明提供的琼脂糖酶水解琼脂糖的薄层层析测试结果图；图8为本发明提供的琼脂糖酶在琼脂糖凝胶电泳后的核酸回收的测试结果图。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。在工业生产以及生物学研究中，往往存在以下问题：琼脂糖酶往往对固体底物活性很差，但琼脂糖液化温度却高于60℃；颗粒状酶功效更佳，但酶产品在颗粒化时需要经历80℃高温过程；此外，在工业化生产时ph环境也会随着工艺条件发生变化，但目前已有的琼脂糖酶对高温以及酸碱性环境的适应性均较差，并不能适应上述应用场景，这极大地限制了琼脂糖酶的应用和发展。鉴于此，本发明提出了一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶的氨基酸序列如seqidno：2所示。该琼脂糖酶含有310个氨基酸残基，理论分子量为35496.89道尔顿，等电点为4.42。其序列如seqidno：2所示，与现有报道中的同糖苷水解酶家族(gh16)的琼脂糖酶的氨基酸序列(ncbi登录号为：aaf21821.1、axy54922.1、atg22743.1alo78721.1、ati96843.1、axk59832.1、wp_066965750.1、abw77762.1ant83229.1、baq95400.1、agu13985.1、aif29515.1、agw43026.1afr90184.1、acm50513.1、add60418.1、aan39119.2、baf34350.1abl06969.1、aaf21820.1、bad29947.1、bac99022.1)的一致性较低，约为20～63％，也就是说，这是一种全新的琼脂糖酶。发明人发现，该琼脂糖酶为内切型：可以将琼脂糖水解为4个和6个残基的新琼寡糖，而不是水解成为二糖(即新琼二糖)；且最适反应温度为40℃，最适反应ph为7.0。同时，其生化特征还表现为：zn2+和还原性试剂(二硫苏糖醇，dtt)在5mm的浓度下对琼脂糖酶caagaa具有明显的激活效果。具体表现为：在dtt浓度为5mm的条件下，琼脂糖酶caagaa表现出的活性是没有dtt条件下酶活的2.1倍；在zn2+浓度为5mm的条件下，琼脂糖酶caagaa表现出约165％的酶活。此外，该琼脂糖酶在70℃温度下孵育2h后仍然能够保持约80％的酶活，在ph为3～11条件下孵育2h后仍然能够维持大于40％的酶活，即本发明提供的琼脂糖酶具有极好的热稳定性和ph稳定性，也就是说，本发明提供的琼脂糖酶对温度和ph条件的要求更低，它可以适用于更多的应用场景，因此，在工业生产中具有更强的适用性。为此，本发明提出一种琼脂糖酶基因caagaa，用于编码上述琼脂糖酶，所述琼脂糖酶基因caagaa的核苷酸序列如seqidno：1所示。发明人发现，来源于深海微生物cellulophagaalgicola的琼脂糖酶编码基因序列可预测编码的蛋白质具有极好的热稳定性和ph稳定性，基于这种原因，并且为了适应具有不同密码子偏好的工程菌以实现琼脂糖酶的大量表达，发明人对这种来源于深海微生物cellulophagaalgicola的琼脂糖酶编码基因序列进行设计，对琼脂糖酶编码基因序列进行了密码子优化，最终获得核苷酸序列如seqidno：1所示的琼脂糖酶基因caagaa。对该基因重组表达可以获得如上所述的琼脂糖酶，该琼脂糖酶具有较高的催化活性和生物学活性，且经功能鉴定后，证实其为内切型、具有上述生化特征、且具有耐高温及ph耐受范围宽泛的优势。具体地，本发明提供的琼脂糖酶基因caagaa在genbank基因数据库中通过对比搜索(phi-blast，为美国国立生物信息研究中心开发的免费序列相似性搜索程序，网址为：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)找到一种来源于海洋微生物(cellulophagaalgicola)的琼脂糖酶编码基因，然后通过人工合成得到其密码子并优化核苷酸。该基因全长1098个碱基。该基因5’端54个核苷酸可能为信号肽序列，因此在进行基因表达时去除该54个核苷酸，最终用于重组质粒构建时的核苷酸序列为seqidno：1所示，共933个碱基。进一步地，上述琼脂糖酶基因发掘时的具体操作可以通过以下方式实现：首先，构建琼脂糖酶蛋白质序列的模式序列(通过hmmer程序获得)，以该模式序列为查询序列，用blast程序搜索ncbi蛋白质数据库中的蛋白质序列，找到本发明所提出的琼脂糖酶基因caagaa；然后根据大肠杆菌密码子的偏爱性，对该琼脂糖酶基因密码子进行优化设计，得到琼脂糖酶基因caagaa。需要说明的是，该琼脂糖酶基因caagaa在苏州金维智公司合成，合成的琼脂糖酶基因caagaa位于pu57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点ecor1和not1。该两个限制性酶切位点将用于把琼脂糖酶基因caagaa克隆至大肠杆菌表达载体pet-28a。同时，本发明公开了一种重组质粒，该重组质粒携带了上述琼脂糖酶基因caagaa。应当理解，插入了上述琼脂糖酶基因caagaa的重组载体即属于本发明的保护范围内。进一步地，在经过对表达细胞和本发明提出的琼脂糖酶的氨基酸结构的多次考量后，优选为以大肠杆菌表达载体pet-28a作为重组质粒的载体。其原因在于：大肠杆菌表达载体pet-28a本身具有如上所述的酶切位点，便于重组操作，且其本身具有卡那霉素抗性基因，可以用于载体筛选。需要说明的是，上述重组质粒的制备方法可以包括以下步骤：通过人工合成获得琼脂糖酶基因caagaa，所合成的琼脂糖酶基因caagaa位于pu57载体上，通过酶切位点ecor1和not1将琼脂糖酶基因caagaa从pu57载体上切下来，酶切获得的dna片段再连接至经同样酶切(ecor1和not1酶切)的大肠杆菌表达载体pet-28a上，连接产物转化到大肠杆菌dh5α中，试剂盒提取质粒，用ecor1和not1双酶切质粒进行鉴定，酶切正确的即为重组质粒pet-28a-caagaa。此外，本发明还提出了一种重组菌株，包含上述的琼脂糖酶基因caagaa。该重组菌株可以由包含上述的琼脂糖酶基因caagaa的重组质粒转化大肠杆菌bl21(rosetta)获得。即，该重组菌株还可以包含上述重组质粒。将上述重组质粒导入表达细胞中即可获得重组菌株，目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说，所述表达细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞例如动物细胞等，在本实施例中，表达细胞优选为大肠杆菌bl21(rosetta)。基于此，上述重组菌株可以通过下述步骤制得：步骤s1、将琼脂糖酶基因caagaa通过酶切位点ecor1和not1连接到载体pet-28a上，连接产物转化到大肠杆菌dh5α中，用试剂盒提取质粒，通过ecor1和not1双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组质粒pet-28a-caagaa；步骤s2、将重组质粒pet-28a-caagaa采用cacl2法转化大肠杆菌bl21(rosetta)，得到含有重组质粒pet-28a-caagaa的重组大肠杆菌bl21(rosetta)，即为重组菌株。而基于上述重组菌株的制备方法，可以得出培养上述重组菌体以形成上述琼脂糖酶的制备方法，该制备方法具体操作时可以通过以下步骤实现：s10、将琼脂糖酶基因caagaa通过酶切位点ecor1和not1连接到载体pet-28a上，连接产物转化到大肠杆菌dh5α中，用试剂盒提取质粒，通过ecor1和not1双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组质粒pet-28a-caagaa；s20、将重组质粒pet-28a-caagaa采用cacl2法转化大肠杆菌bl21(rosetta)，得到含有重组质粒pet-28a-caagaa的大肠杆菌bl21(rosetta)(即为重组表达菌株)；s30、将含有重组质粒pet-28a-caagaa的大肠杆菌bl21(rosetta)按1:90～110的比例(优选为1:100)接种至zyp-5052培养基中，于37℃、180～220rpm(优选为200rpm)条件下培养至od600为0.95～1.05，然后将温度降低至18～22℃(优选为20℃)，继续培养20～26h(优选为24h)后，离心收集菌体，将菌体悬浮于histrapa缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液(上清液中即包含由重组菌株发酵形成的重组蛋白)；s40、将上清液通过histrap亲和层析柱后，使用20％histrapb缓冲液在akta蛋白纯化仪上洗脱层析柱上的重组蛋白，然后使用截留分子量为10kda的millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/ml，得到纯化的琼脂糖酶。其中，所述histrapa缓冲液的ph值为7.4，所述histrapa缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mm的nacl、20mm的咪唑和20mm的na2hpo4；所述histrapb缓冲液的ph值为7.4，所述histrapb缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mm的nacl、500mm的咪唑和20mm的na2hpo4。zyp-5052培养基的具体配方如下：1％蛋白胨，5％酵母提取物，50mmna2hpo4，50mmkh2po4，25mm(nh4)2so4，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，2mmmgso4，卡那霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml。所述磷酸盐缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mmnacl，2.7mmkcl，10mmna2hpo4，1.8mmkh2po4。需要说明的是，上述涉及到基因合成、重组质粒及重组菌株制备、以及重组菌株发酵培养获得重组蛋白等实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均按照基因工程及基于基因工程进行微生物发酵培养制备蛋白质的常规方法进行。此外，基于上述琼脂糖酶的内切型、耐高温及酸碱性的特征，本发明还提出如上所述的琼脂糖酶在生物活性新琼寡糖制备或核酸回收中的应用。由于本发明提出的琼脂糖酶为内切型，即该琼脂糖酶可以将琼脂或琼脂糖水解为4个和6个残基的新琼寡糖，因此，可以将该琼脂糖酶应用到生物活性新琼寡糖的制备中，即以琼脂或琼脂糖为原料，加入本发明提出的琼脂糖酶进行水解，然后经过分离纯化步骤获得新琼寡糖。而且，由于本发明提出的琼脂糖酶具有耐高温及ph耐受范围宽泛的特征，该琼脂糖酶可以被制备成颗粒状酶，同时为琼脂糖酶的应用工艺设计带来方便，例如，将琼脂糖酶与琼脂或琼脂糖一起高温液化后进行水解反应。琼脂糖凝胶电泳检测方法是分子生物学中常用的一种检测方法，在检测结束后如何将凝胶中的核酸物质回收是该检测方法中极为重要的一环。基于琼脂糖酶可以降解琼脂糖这一功能，可以将琼脂糖酶应用到核酸回收这一步骤中，由于琼脂糖酶往往对固体底物活性很差，而本发明提供的琼脂糖酶具有耐高温的特性，因此，在具体实施时，可以将该琼脂糖酶与电泳后的琼脂糖凝胶一起高温液化后，进行水解反应，通过琼脂糖降解从而将核酸物质释放出来，进而达到回收核酸物质的目的。综上所述，本发明提供的琼脂糖酶基因caagaa，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得琼脂糖酶，所制得的琼脂糖酶耐高温及酸碱性极好，可有效地将琼脂糖水解为4个和6个残基的新琼寡糖，可用于生物活性新琼寡糖的制备以及核酸电泳后核酸的回收。以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1琼脂糖酶基因caagaa的获得以已报道的琼脂糖酶的蛋白质序列为查询序列，用phi-blast程序搜索ncbi蛋白质序列数据库，找到本发明所涉及的琼脂糖酶基因caagaa；然后根据大肠杆菌密码子的偏爱性，对琼脂糖酶基因caagaa密码子进行优化设计，得到用于重组表达的琼脂糖酶基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示。琼脂糖酶基因caagaa在苏州金维智公司合成，合成的琼脂糖酶基因caagaa位于pu57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点ecor1和not1。实施例2重组质粒的制备(1)用限制性内切酶ecor1和not1(均购自takara公司)将实施例1获得的琼脂糖酶基因caagaa从pu57载体上切下来，割胶回收切下的caagaadna片段；(2)将caagaadna片段通过t4dna连接酶(购自takara公司)连接到pet-28a载体(一种用于在大肠杆菌中重组表达外源基因的商业化载体，购自novagen公司，该载体上带有卡那霉素抗性基因)上；(3)将连接产物通过cacl2法转化到大肠杆菌dh5α(一种生物学实验室常规的克隆菌株，购自invitrogen公司，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞中。将转化的细胞涂布在含有100μg/ml卡那霉素(购自sigma公司)的lb琼脂平板上进行阳性转化子筛选；其中涉及到的大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备及cacl2转化方法是生物学实验室的常规操作，具体方法可参考currentprotocolsinmolecularbiology一书中关于dna转化的章节(doi.org/10.1002/0471142727.mb0108s37)；其中用到的lb琼脂平板是通过在lb培养基(每升中含有10gnacl，5g酵母提取液和10g蛋白胨)加入2.5％的琼脂制备而成。(4)挑取单克隆接种至含有100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，过夜培养，然后用试剂盒提取质粒，通过ecor1和not1双酶切进行鉴定，酶切结果正确的即为重组质粒pet-28a-caagaa。实施例3重组菌株的制备(1)将实施例2获得的重组质粒pet-28a-caagaa采用cacl2法转化大肠杆菌bl21(rosetta)(购自novagen公司，为实验室常见的基因工程表达菌，该菌株自带有氯霉素抗性，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞；其中感受态大肠杆菌bl21(rosetta)的制备及转化方法与实施例2(3)中的方法相同；(2)将转化后的大肠杆菌bl21(rosetta)涂布在含有卡那霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml,购自sigma公司)的lb琼脂平板上。在此双抗性平板上生长的菌落为重组菌株。实施例4琼脂糖酶的制备(1)将实施例2制备的重组菌株过夜培养后(培养基中加100μg/ml卡那霉素和34μg/ml的氯霉素)，按1:100的比例接种至zyp-5052培养基中，于37℃、200rpm条件下培养至od600(600nm处的吸光度)为0.95～1.05，然后将温度降低至20℃，继续培养24h后，5000r/min离心收集菌体，将菌体悬浮于histrapa缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液(含有由重组表达菌株发酵形成的重组蛋白)；其中，histrapa缓冲液的ph值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mm的nacl、20mm的咪唑和20mm的na2hpo4；zyp-5052培养基的具体配方如下：1％蛋白胨，5％酵母提取物，50mmna2hpo4，50mmkh2po4，25mm(nh4)2so4，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，2mmmgso4，卡那霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml；(2)取步骤(1)制得的上清液通过histrap亲和层析柱(购自通用公司)后，使用histrapb缓冲液在akta上洗脱上清液中的重组蛋白，然后使用millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/ml，得到纯化的琼脂糖酶；其中，histrapb缓冲液的ph值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mm的nacl、500mm的咪唑和20mm的na2hpo4；磷酸缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mmnacl，2.7mmkcl，10mmna2hpo4，1.8mmkh2po4。对实施例4制备的琼脂糖酶的蛋白表达情况、酶活、最适反应条件、耐热性及耐酸碱性的分析测定(以下所述的琼脂糖酶caagaa代表实施例4制备的琼脂糖酶)，测定方法及结果如下：1、琼脂糖酶caagaa的蛋白表达分析对实施例4步骤(1)中细胞破碎制得的上清液和步骤(2)中纯化后的琼脂糖酶caagaa，分别进行sds-page(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测试，结果如图1所示(图1中：泳道1为全细胞裂解液，泳道2为全细胞破碎后的上清液，泳道3为全细胞破碎后的沉淀，泳道3至7为上清液经过层析柱梯度洗脱得到的收集管样品)。由图1可知，纯化后的琼脂糖酶caagaa在大肠杆菌中得到了高效的表达和纯化。2、琼脂糖酶caagaa的酶活分析(还原糖法，也即dns法)配制标准的反应体系为2ml，包括：0.5ml约1:100稀释的琼脂糖酶caagaa、1ml反应缓冲液以及0.5ml琼脂糖(购自thermoscientific公司)溶液(0.25％)；将该反应体系在40℃水浴中孵育20min后加入dns试剂(3，5-二硝基水杨酸)，沸水水浴5min，然后冷却至室温；再将该反应体系定容至25ml，在520nm测定吸光度。还原糖的定量采用半乳糖标准品做标准曲线，1单位(u)琼脂糖酶活的活性定义为每分钟能够释放1μmol还原糖所需的琼脂糖酶毫克数。经dns法测定，纯化后的琼脂糖酶caagaa的酶活约为36u/mg。3、琼脂糖酶caagaa最适反应ph温度分析将琼脂糖酶caagaa分散在ph值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液(ph3～8的缓冲液由mcilvaine缓冲液制备，ph9～11的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mm)缓冲液制备)中，于40℃温度下，分别通过上述dns法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各ph反应区间的相对酶活。其中，ph3～8的缓冲液由mcilvaine缓冲液制备的方法如下：用摩尔浓度为200mm的na2hpo4溶液和摩尔浓度为100mm的柠檬酸溶液进行勾对配制至所需要的ph值，具体比例如下表1所示：表1由mcilvaine缓冲液制备对应ph值缓冲液的比例phna2hpo4体积(ml)柠檬酸体积(ml)3.004.1115.894.007.7112.295.010.3009.706.012.6307.377.016.4703.538.019.4500.55ph9～11的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mm)缓冲液制备的方法如下：将甘氨酸溶解在水中，用氢氧化钠滴定到需要的ph(9.0，10.0，11.0)。各ph反应区间的相对酶活的计算结果如图2所示。由图2可知，本实施例制备的琼脂糖酶caagaa在ph值为5～8区间都具有较高的活性(>60％)，其最适ph为7.0。4、琼脂糖酶caagaa的ph稳定性分析将琼脂糖酶caagaa分散在不同ph(ph值为3～11)的缓冲液体系中，于4℃温度下孵育2h后，在40℃、ph值为7.0的条件下，通过上述dns法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各ph反应区间的相对酶活，结果如图3所示。由图3可知，本实施例制备的琼脂糖酶caagaa在ph为3～11条件下，孵育1h后能够维持约40％的酶活。综合如上所述的3、4两项的考察结果，可知，本发明提出的琼脂糖酶具有宽泛的ph耐受范围，可适应强酸碱环境或ph变化较大的应用场景。5、琼脂糖酶caagaa最适反应温度分析将琼脂糖酶caagaa分散在ph值为7.0的缓冲液体系中，分别于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃温度下，通过上述dns法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各温度反应区间的相对酶活，结果如图4所示。由图4可知，本实施例制备的琼脂糖酶caagaa在30～50℃温度区间都具有较高的活性(>75％)，其最适温度为40℃。6、琼脂糖酶caagaa的温度稳定性分析将琼脂糖酶caagaa置于在ph值为7.0的缓冲液体系中，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃温度下孵育2h、4h和8h后，在40℃、ph值为7.0的条件下，通过上述dns法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各ph反应区间的相对酶活，结果如图5所示。由图5可知，本实施例制备的琼脂糖酶caagaa在50℃-60℃稳定性较差，但是在70℃-80℃温度下具有极好的稳定性，说明本发明提出的琼脂糖酶对于高温环境具有良好的耐受性，可适应高温环境的应用场景。7、金属离子和化学试剂对琼脂糖酶caagaa的作用分析按照上述酶活分析中的方法配制标准反应体系10份，向标准反应体系中分别加入终浓度为5mm的feso4溶液、mnso4溶液、cacl2溶液、zncl2溶液、cocl2溶液和mgso4溶液、以及浓度分别为5mm的edta(乙二胺四乙酸二钠)和dtt(二硫苏糖醇)溶液，以不含有金属离子或dtt/edta的标准反应体系作为对照组，通过上述dns法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各ph反应区间的相对酶活，结果如图6，图6为不同金属离子和edta/dtt对琼脂糖酶caagaa活性的影响。由图6可知，上述常见的金属离子(fe2+、mn2+、ca2+、co2+和mg2+)在5mm的浓度下对琼脂糖酶caagaa具有不同程度的激活效果，其中mn2+对琼脂糖酶caagaa的活性较大促进效应(160％)。edta对琼脂糖酶caagaa表现出抑制效果。dtt对琼脂糖酶caagaa表现出极大的激活效果，在5mm的浓度下，琼脂糖酶caagaa表达出210％的酶活。实施例5琼脂糖酶caagaa水解琼脂糖的能力测试将琼脂糖作为底物，在标准反应体系(上述酶活分析中提供的标准反应体系)和40℃、ph7.0的反应条件下反应不同时间(0min到24h)后，进行薄层层析分析(薄层层析硅胶板购自merck公司)。薄层层析所用的展开剂为正丁醇：乙酸：水＝10：5：1(体积比)，条带显影剂为浓硫酸：甲醇＝5：95(体积比)，喷洒显影剂后将薄层板置于115℃、10min。分析结果如图7所示，图7中：泳道m为新琼寡糖标准品(新琼二糖na2和新琼四糖na4)，其他泳道为琼脂糖酶caagaa在不同时间水解琼脂糖的产物。由图7可知，随着时间的推移，琼脂糖的水解产物中逐渐开始出现新琼寡糖，且浓度越来越高，说明本发明实施例制备的琼脂糖酶caagaa可有效地将琼脂糖水解为4个和6个残基的新琼寡糖。实施例6琼脂糖酶caagaa用于琼脂糖凝胶中的核酸回收的测试用1％的琼脂糖凝胶电泳长度为1400bp的dna片段。电泳所用的缓冲液为tae(40mmtrishcl，20mm乙酸，1mmedta)，电压为120v，时间为30min。电泳结束后，在溴化乙锭溶液(0.5μg/ml)中染色10min。在紫外灯光下切下目的条带，放入1.5ml的ep管中。在管中加入1μl琼脂糖酶caagaa(约0.5μg)和1u的rnasea酶(赛默飞世尔科技，货号：en0531)，置于70℃水浴中约5min。将溶解后的凝胶置于40℃水浴中酶解15min。之后再将ep管放置在4℃冰箱中，待少量残留的琼脂糖凝固后，于4℃下，以13000rpm的转速离心10min。取离心上清液，加入2倍体积的无水乙醇，在-20℃下放置15min。再于4℃下，以13000rpm的转速离心10min，弃上清液，取沉淀通风干燥后用20μl无菌室溶解，即可获得回收的dna片段。同时，用omega公司的凝胶回收试剂盒(货号：d2501-022)作为对照同时进行核酸回收试验(同样量的起始dna样品)，具体实验流程参考试剂盒说明书。用1％的琼脂糖凝胶电泳分析以上分别使用琼脂糖酶caagaa和凝胶回收试剂盒回收得到的dna样品，记录结果如图8所示，图中，1号条带为通过琼脂糖酶caagaa回收的核酸；2号条带为试剂盒回收的核酸；3号条带为核酸分子量marker。由图8可知，通过琼脂糖酶caagaa可以有效地回收琼脂糖凝胶中的核酸。综上所述，本发明提供的琼脂糖酶基因caagaa，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得高纯度的琼脂糖酶，所制得的琼脂糖酶具有较好的活性，可有效地将琼脂糖水解为4个和6个残基的新琼寡糖，可用于生物活性新琼寡糖的制备和核酸物质的回收。同时，琼脂糖酶具有极好的热稳定性和耐酸碱性。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。sequencelisting<110>武汉轻工大学、中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）<120>琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用<130>2019/1/17<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>936<212>dna<213>人工合成<400>1atgagtaaaagcagcactgatgaaaaaccaaccagtgaagaagataaccagggcgaagtg60attacgccggaagaggaagttgaagaagaggtggtgaaagactggaaaaccattccggtt120ccggcagacgccggggcgggtaacgtctgggaattccaggagttaagcgacgatttcgat180tacgacgcgccggccgatgcgaaaggtgcaaaatttgataaaaaatggacggatttttat240cacaacctctgggcgggcccgggtctgaccgaatggcgccgtgatcacagcctggtggtc300gatggcaacctgcagatgatcgccaaccgcgctgaaggcagcaataaaatcaatctgggc360tgtattaccagcaaagaacaggtggtttatccggtgtatattgaagcgaacgttaaaatt420gccaataccaccctggccagcgatgtgtggctgctgagcagtgatgatacccaggaaatc480gatatcgtggaagcctatggcgcgagctacagcgaactggctgacagcgatcaaacctgg540tacgcagaacgtattcatatcagccatcatatgtttatccgcgacccgtttcaggattat600cagccgaccgatgccggtagctggtatcgcgatggtacgctgtggcgtgaagactatcat660accgttggcgtttactggaaagatccgttccatctggagtattacatcgacggcaaactg720gcgcgtaccacgagcggcacggaaatgattgatccgaacaactttgccgaaggtaaaggc780ctgtataaaccgatggatattattatcaacgcggaagatcagacctggcggtctgataat840aatgtgacgccatctgacaaagagctggaaaacaaagaaaataacacctttaaagtggac900tggattcgcattttcaaacctgtgccggcgaattaa936<210>2<211>310<212>prt<213>人工合成<400>2serlysserserthraspglulysprothrserglugluaspasngln151015glygluvalilethrprogluglugluvalgluglugluvalvallys202530asptrplysthrileprovalproalaaspalaglyalaglyasnval354045trpglupheglngluleuseraspasppheasptyraspalaproala505560aspalalysglyalalyspheasplyslystrpthraspphetyrhis65707580asnleutrpalaglyproglyleuthrglutrpargargasphisser859095leuvalvalaspglyasnleuglnmetilealaasnargalaglugly100105110serasnlysileasnleuglycysilethrserlysgluglnvalval115120125tyrprovaltyrileglualaasnvallysilealaasnthrthrleu130135140alaseraspvaltrpleuleuserseraspaspthrglngluileasp145150155160ilevalglualatyrglyalasertyrsergluleualaaspserasp165170175glnthrtrptyralagluargilehisileserhishismetpheile180185190argasppropheglnasptyrglnprothraspalaglysertrptyr195200205argaspglythrleutrparggluasptyrhisthrvalglyvaltyr210215220trplysaspprophehisleuglutyrtyrileaspglylysleuala225230235240argthrthrserglythrglumetileaspproasnasnphealaglu245250255glylysglyleutyrlysprometaspileileileasnalagluasp260265270glnthrtrpargseraspasnasnvalthrproserasplysgluleu275280285gluasnlysgluasnasnthrphelysvalasptrpileargilephe290295300lysprovalproalaasn305310当前第1页12