一组用于评估弥漫大B细胞淋巴瘤分子分型的基因群，其试剂盒及分析方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一组用于评估弥漫大b细胞淋巴瘤分子分型的基因群，其试剂盒及分析方法。
背景技术：
：淋巴瘤是发病率最高的血液系统恶性肿瘤，种类繁多，分型复杂。传统的淋巴瘤分类主要依据病理形态、细胞遗传学及单基因突变检测等方法，对淋巴瘤细胞来源及恶性程度进行判断，大体上可分为霍奇金淋巴瘤(hodgkin’slymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma，nhl)两大类，后者又可分为b细胞nhl和t细胞nhl等不同类别。弥漫大b细胞淋巴瘤(diffuselargebcelllymphoma，dlbcl)是最常见的侵袭性淋巴瘤，是一种高度异质性的侵袭性nhl。利妥昔单抗(rituximab，r)联合chop方案(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱及泼尼松)显著地改善了dlbcl患者的预后，但仍有30～40％的患者无法缓解或缓解后复发。传统方法上，对dlbcl的预后判断主要基于临床指标、免疫组化及细胞遗传学异常。临床指标上，以国际预后指数(internationalprognosticindex，ipi)为基础的一系列评分体系，纳入年龄、疾病分期、乳酸脱氢酶、ecog评分、结外累及等指标，将dlbcl患者分为不同的危险度，能够区分患者生存预后情况；病理诊断上，hans分型可将dlbcl分为生发中心型(germinalcenterb-cell，gcb)和非生发中心型(non-gcb)，bcl2/myc双表达为表现的dlbcl具有相对更差的预后；细胞遗传学检测中，dlbcl患者bcl2/myc/bcl6基因重排阳性提示不良预后。随着分子检测技术的不断发展，2000年asha.alizadeh等使用基因表达芯片测序分析，提出通过基因表达情况区分dlbcl分子亚型的概念，将dlbcl按照细胞来源区分为生发中心b细胞样(gcblike)，活化b细胞样(activatedb-celllike，abclike)及部分不能分型。在此基础上，大量研究表明，相对gcb亚型，在标准r-chop方案的治疗下，abc亚型的dlbcl中位生存期更短，更易复发。通过基因表达谱检测对dlbcl进行细胞来源分析逐渐成为人们判断dlbcl患者预后的指标之一。2016年who淋巴瘤分型在2008年的版本基础上，将dlbcl(非特指型)进一步分为生发中心b细胞型(gcbtype)及活化b细胞型(abctype)，对dlbcl的诊断提出了新要求，基于基因表达水平的分子诊断成为dlbcl诊断的重要组成部分。此外，近年来出现了一些针对abc型dlbcl的治疗方案。剂量调整(dose-adjusted，da-)epoch-r(利妥昔单抗，依托泊苷，环磷酰胺，阿霉素，长春新碱及泼尼松)方案及r-acvbp(利妥昔单抗，阿霉素，环磷酰胺，长春新碱，博来霉素及泼尼松)方案均显示，相对r-chop方案可提高abc亚型dlbcl患者预后，但毒副作用更大。abc型dlbcl具有nf-κb激活的特征，硼替佐米作为一种蛋白酶体抑制剂，能够减少nf-κb抑制蛋白iκbα的降解，从而促进肿瘤细胞凋亡。在复发dlbcl患者中的小样本临床实验中，硼替佐米联合da-epoch治疗对abc型dlbcl的疗效优于gcb型dlbcl，来那度胺作为免疫调节剂，在体外条件下也可以抑制nf-κb通路，联合r-chop方案对dlbcl患者的治疗，可以改善non-gcb患者的预后。cd79b及myd88突变多发生在abc型dlbcl中。伊布替尼作为选择性小分子btk抑制剂，在bcr通路激活的复发abc亚型dlcl患者中能够明显改善预后。通过基因表达谱检测对dlbcl进行细胞来源分析也成为dlbcl患者治疗方案选择的指标之一。然而，当前的dlbcl细胞来源诊断仍存在一定的局限性。作为“金标准”的asha.alizadeh等使用基因表达芯片选择的基因数目有限，仍有一部分患者无法被诊断为abc或gcb亚型；2014年davidw.scott等使用福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织，设计了包含20个基因的芯片lymph2cx，使用nanostring的方法检测用以区分dlbcl的细胞来源，但其基于西方人群获得的基因组和在区分我国dlbcl患者的应用中存在较高的无法分型比例。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的首要发明目的在于提出一组用于评估弥漫大b细胞淋巴瘤分子分型的基因群。本发明的第二发明目的在于提出该基因群的应用。本发明的第三发明目的在于提出一种试剂盒。本发明的第四发明目的在于提出一种分子分型数据的分析方法。为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：本发明提出一组用于评估弥漫大b细胞淋巴瘤分子分型的基因群，所述用于评估弥漫大b细胞淋巴瘤分子分型的基因群至少由178个基因组成，所述178个基因为：sacs-as1基因、pim1基因、cd44基因、cyb5r2基因、tmprss6基因、napsa基因、myocd基因、rab29基因、abhd17c基因、slc2a13基因、sftpb基因、ccnd2基因、il12a基因、adtrp基因、tgif1基因、fut8基因、entpd1基因、il17rb基因、sh3bp5基因、limd1基因、foxp1基因、cdhr3基因、pnma6a基因、ehhadh基因、dusp15基因、batf基因、arid3a基因、plbd1基因、ephb1基因、rasgrp4基因、igsf3基因、rubcnl基因、fa2h基因、sla基因、epb41l5基因、ercc6l2基因、tnfrsf13b基因、isl2基因、irf4基因、linc01268基因、pim2基因、fut8-as1基因、hacd1基因、pigr基因、tas1r1基因、hck基因、ell2基因、mtcl1基因、c1qb基因、jade3基因、vsnl1基因、nrros基因、ccr10基因、actg2基因、kcna3基因、mocos基因、gtsf1l基因、foxc1基因、dhrs9基因、arnt2基因、aicda基因、kiss1r基因、lilra3基因、arhgap24基因、clecl1基因、fam129c基因、pstpip2基因、epyc基因、vash2基因、xk基因、znf385c基因、cacna1d基因、scn2a基因、cd163基因、aspn基因、rnf183基因、fcgr3a基因、spic基因、dgkg基因、dpcr1基因、fam149a基因、bspry基因、chdh、基因tox2基因、bcl2l14基因、mir155hg基因、spink2基因、rgs8基因、linc00487基因、pkhd1l1基因、kcnk12基因、enpp3基因、mybl1基因、actn2基因、s1pr2基因、cpa6基因、umodl1基因、ccdc85a基因、s100z基因、hopx基因、il22ra2基因、mapk10基因、kank1基因、nlrp11基因、eepd1基因、pdlim3基因、cadps基因、pde8b基因、csrnp3基因、usp2基因、hmces基因、pcdhga4基因、izumo4基因、rnf180基因、slc30a4基因、mir631基因、tmem132b基因、asb13基因、linc01013基因、shisa8基因、kcnh8基因、clip2基因、maml3基因、sugct基因、dapl1基因、bmp7基因、uchl1基因、kcnn3基因、inhba基因、auts2基因、tex9基因、cgnl1基因、snx22基因、tpm1基因、pmepa1基因、col4a4基因、slc12a8基因、def8基因、ttc9基因、crhbp基因、ssbp2基因、hemgn基因、hip1r基因、tiam2基因、gdpd5基因、irs1基因、icoslg基因、slc1a1基因、enpp1基因、stag3基因、kif5c基因、kcnj1基因、tfpi2基因、adrb1基因、serpina9基因、btnl9基因、cdk14基因、gng8基因、eya4基因、slc25a27基因、jup基因、sybu基因、sox9基因、linc00877基因、col16a1基因、fhod3基因、cux2基因、mme基因、rgs7基因、stxbp6基因、col12a1基因、vpreb3基因、bfsp2-as1基因、cyp39a1基因、map2基因、ptprd基因、mmp20基因和ank3基因。可选的，所述178个基因包括表达水平上调的基因和表达水平下调的基因，所述表达水平上调的基因为：sacs-as1基因、pim1基因、cd44基因、cyb5r2基因、tmprss6基因、napsa基因、myocd基因、rab29基因、abhd17c基因、slc2a13基因、sftpb基因、ccnd2基因、il12a基因、adtrp基因、tgif1基因、fut8基因、entpd1基因、il17rb基因、sh3bp5基因、limd1基因、foxp1基因、cdhr3基因、pnma6a基因、ehhadh基因、dusp15基因、batf基因、arid3a基因、plbd1基因、ephb1基因、rasgrp4基因、igsf3基因、rubcnl基因、fa2h基因、sla基因、epb41l5基因、ercc6l2基因、tnfrsf13b基因、isl2基因、irf4基因、linc01268基因、pim2基因、fut8-as1基因、hacd1基因、pigr基因、tas1r1基因、hck基因、ell2基因、mtcl1基因、c1qb基因、jade3基因、vsnl1基因、nrros基因、ccr10基因、actg2基因、kcna3基因、mocos基因、gtsf1l基因、foxc1基因、dhrs9基因、arnt2基因、aicda基因、kiss1r基因、lilra3基因、arhgap24基因、clecl1基因、fam129c基因、pstpip2基因、epyc基因、vash2基因、xk基因、znf385c基因、cacna1d基因、scn2a基因、cd163基因、aspn基因、rnf183基因、fcgr3a基因、spic基因、dgkg基因、dpcr1基因、fam149a基因、bspry基因、chdh基因、基因tox2基因、bcl2l14基因和mir155hg基因；所述表达水平下调的基因为：spink2基因、rgs8基因、linc00487基因、pkhd1l1基因、kcnk12基因、enpp3基因、mybl1基因、actn2基因、s1pr2基因、cpa6基因、umodl1基因、ccdc85a基因、s100z基因、hopx基因、il22ra2基因、mapk10基因、kank1基因、nlrp11基因、eepd1基因、pdlim3基因、cadps基因、pde8b基因、csrnp3基因、usp2基因、hmces基因、pcdhga4基因、izumo4基因、rnf180基因、slc30a4基因、mir631基因、tmem132b基因、asb13基因、linc01013基因、shisa8基因、kcnh8基因、clip2基因、maml3基因、sugct基因、dapl1基因、bmp7基因、uchl1基因、kcnn3基因、inhba基因、auts2基因、tex9基因、cgnl1基因、snx22基因、tpm1基因、pmepa1基因、col4a4基因、slc12a8基因、def8基因、ttc9基因、crhbp基因、ssbp2基因、hemgn基因、hip1r基因、tiam2基因、gdpd5基因、irs1基因、icoslg基因、slc1a1基因、enpp1基因、stag3基因、kif5c基因、kcnj1基因、tfpi2基因、adrb1基因、serpina9基因、btnl9基因、cdk14基因、gng8基因、eya4基因、slc25a27基因、jup基因、sybu基因、sox9基因、linc00877基因、col16a1基因、fhod3基因、cux2基因、mme基因、rgs7基因、stxbp6基因、col12a1基因、vpreb3基因、bfsp2-as1基因、cyp39a1基因、map2基因、ptprd基因、mmp20基因和ank3基因。可选的，所述基因群用于区分弥漫大b细胞淋巴瘤分子的abc亚型和gcb亚型。本发明还提出上述基因群作为标记物在制备用于淋巴瘤分子分型的试剂盒中的应用。本发明还提出获得或检测弥漫大b细胞淋巴瘤患者中上述178个基因群的表达量在制备预测预后生存率或指导用药的产品中的应用。本发明还提出一种试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测生物标志物的试剂，所述生物标志物选自上述的基因群。可选的，所述试剂盒含有用于检测所述生物标记物的表达量的试剂，优选的，所述试剂盒含有采用全转录组测序法检测所述生物标记物的表达量的试剂。本发明还提出一种分子分型数据的分析方法，至少包括以下步骤：s1：采用全转录组测序对样本进行测序；s2：利用star软件对测序数据进行比对；s3：利用htseq-count计算每个基因的表达量；s4：利用edgerr包对表达数据进行差异分析，筛选得到所述样本在在不同亚群下表达水平显著差异的基因群，所述基因群为如权利要求1所述的基因群。可选的，在s1中，利用trimmomatic软件对测序数据进行处理，从3’端去除接头序列片段和q值小于25的低质量片段，同时去除长度小于35bp的片段，得到的序列片段用于后续分析。可选的，所述差异分析至少包括以下步骤：s41：采用tmm算法对原始的测序数据进行标准化；s42：统计学模型进行假设检验概率的计算，所述假设检验概率的计算模型是负二项分布；s43：进行多重假设检验校正，得到错误发现率，所述错误发现率采用bh算法，筛选基因条件：foldchange>1且pvalue<0.01。本发明至少具有以下有益的效果：本发明获得优化的、符合我国人群背景的淋巴瘤细胞来源分子亚型鉴定所需基因组合及检测方式，从而可准确、快速对弥漫大b细胞淋巴瘤进行分型，从而可为患者选择治疗方案，从而帮助医生进行用药指导，实现精准医疗，以提高患者的生存率，改善患者生存状况。本发明采用mrna-seq转录测序检测基因表达水平并用于分子分型，增加了检测的敏感度，提高了检测能力和效率，同时极大降低了检测成本。经试验验证，本发明试剂盒适用范围广、准确率高，有助于实现个性化用药，对患者进行精准治疗具有重要的临床意义。附图说明图1为178个基因表达水平数据分析热图；图2至图7为实施例2中的加样方式示意图；图8为实施例2的质控结果图。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本发明的范围。具体实施方式下面通过实施例和对比例进一步说明本发明，这些实施例只是用于说明本发明，本发明不限于以下实施例。凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。全转录组测序(transcriptomesequencing，rna-seq)可检测样品中全部基因的表达量水平，相比基因表达芯片可以更为全面准确地反映不同来源的组织/细胞之间的差异，本发明实施例结合我国dlbcl患者背景，通过对不同细胞来源的部分dlbcl患者肿瘤组织样品中的基因表达水平相互比较，筛选出具有代表性的178个表达水平具有差异的差异基因，通过对这178个基因表达水平进行数据分析，获得如图1所示的热图。并利用一百余例模型以外的dlbcl患者肿瘤组织检测结果进行验证，从而提出一种基于rna-seq的淋巴瘤细胞来源分子亚型鉴定所需基因组合及检测方式，结合病理及已知细胞来源分子亚型分类验证，准确率达100％。本发明实施例提出一组用于评估弥漫大b细胞淋巴瘤分子分型的基因群，该基因群至少由178个基因组成，178个基因为：sacs-as1基因、pim1基因、cd44基因、cyb5r2基因、tmprss6基因、napsa基因、myocd基因、rab29基因、abhd17c基因、slc2a13基因、sftpb基因、ccnd2基因、il12a基因、adtrp基因、tgif1基因、fut8基因、entpd1基因、il17rb基因、sh3bp5基因、limd1基因、foxp1基因、cdhr3基因、pnma6a基因、ehhadh基因、dusp15基因、batf基因、arid3a基因、plbd1基因、ephb1基因、rasgrp4基因、igsf3基因、rubcnl基因、fa2h基因、sla基因、epb41l5基因、ercc6l2基因、tnfrsf13b基因、isl2基因、irf4基因、linc01268基因、pim2基因、fut8-as1基因、hacd1基因、pigr基因、tas1r1基因、hck基因、ell2基因、mtcl1基因、c1qb基因、jade3基因、vsnl1基因、nrros基因、ccr10基因、actg2基因、kcna3基因、mocos基因、gtsf1l基因、foxc1基因、dhrs9基因、arnt2基因、aicda基因、kiss1r基因、lilra3基因、arhgap24基因、clecl1基因、fam129c基因、pstpip2基因、epyc基因、vash2基因、xk基因、znf385c基因、cacna1d基因、scn2a基因、cd163基因、aspn基因、rnf183基因、fcgr3a基因、spic基因、dgkg基因、dpcr1基因、fam149a基因、bspry基因、chdh、基因tox2基因、bcl2l14基因、mir155hg基因、spink2基因、rgs8基因、linc00487基因、pkhd1l1基因、kcnk12基因、enpp3基因、mybl1基因、actn2基因、s1pr2基因、cpa6基因、umodl1基因、ccdc85a基因、s100z基因、hopx基因、il22ra2基因、mapk10基因、kank1基因、nlrp11基因、eepd1基因、pdlim3基因、cadps基因、pde8b基因、csrnp3基因、usp2基因、hmces基因、pcdhga4基因、izumo4基因、rnf180基因、slc30a4基因、mir631基因、tmem132b基因、asb13基因、linc01013基因、shisa8基因、kcnh8基因、clip2基因、maml3基因、sugct基因、dapl1基因、bmp7基因、uchl1基因、kcnn3基因、inhba基因、auts2基因、tex9基因、cgnl1基因、snx22基因、tpm1基因、pmepa1基因、col4a4基因、slc12a8基因、def8基因、ttc9基因、crhbp基因、ssbp2基因、hemgn基因、hip1r基因、tiam2基因、gdpd5基因、irs1基因、icoslg基因、slc1a1基因、enpp1基因、stag3基因、kif5c基因、kcnj1基因、tfpi2基因、adrb1基因、serpina9基因、btnl9基因、cdk14基因、gng8基因、eya4基因、slc25a27基因、jup基因、sybu基因、sox9基因、linc00877基因、col16a1基因、fhod3基因、cux2基因、mme基因、rgs7基因、stxbp6基因、col12a1基因、vpreb3基因、bfsp2-as1基因、cyp39a基因1、map2基因、ptprd基因、mmp20基因和ank3基因。进一步可选的，178个基因包括表达水平上调的基因和表达水平下调的基因，具体的，表达水平上调的基因如表1所示，表达水平下调的基因如表2所示：表1：基因表达上调的差异基因表2：基因表达下调的差异基因由表1和表2所示的数据可知，本发明实施例基因组的差异基因在不同亚群下的p值均小于0.005，说明上述差异基因的差异均非常显著。并且，差异基因错误发现率非常低，说明准确率高。本发明实施例的上述基因群用于区分弥漫大b细胞淋巴瘤分子的abc亚型和gcb亚型。本发明实施例还涉及用于评估弥漫大b细胞淋巴瘤分子分型的基因作为标记物在制备用于淋巴瘤分子分型的试剂盒中的应用。本发明实施例还涉及一种评估弥漫大b细胞淋巴瘤分子分型基因群的试剂盒，该试剂盒检测生物标志物，生物标志物选自上述基因群。可选的，该试剂盒中含有用于检测上述基因群表达量的试剂。可选的，该试剂盒中含有采用全转录组测序法检测上述基因群表达量的试剂。具体的，该试剂盒的使用方法为：通过该试剂盒检测待测样本中上述178个基因的表达水平，与图1所示的基因分型图进行类比，如果待测样本落在图1所示的abc标尺区域内(位于图1左侧的深色区域)，则为abc亚型，如果待测样本落在图1所示的gcb标尺区域内(位于图1右侧的浅色区域)，则为gcb亚型。图1给出了待测样本落在gcb标尺区域内的实例。本实施例还涉及获得或检测弥漫大b细胞淋巴瘤患者中178个基因群的表达量在制备预测预后生存率或指导用药的产品中的应用。具体的，在预后部分，目前认为abc亚型dlbcl在标准r-chop(利妥昔单抗，环磷酰胺，阿霉素，长春新碱及泼尼松)治疗方案下预后较差。在指导用药方面，剂量调整(dose-adjusted，da-)epoch-r(利妥昔单抗，依托泊苷，环磷酰胺，阿霉素，长春新碱及泼尼松)方案及r-acvbp(利妥昔单抗，阿霉素，环磷酰胺，长春新碱，博来霉素及泼尼松)方案均显示，相对r-chop方案可提高abc亚型dlbcl患者预后。本发明实施例还涉及一种分子分型数据分析方法，至少包括以下步骤：s1：采用全转录组测序对样本进行测序；s2：利用star软件对测序数据进行比对；s3：利用htseq-count计算每个基因的表达量；s4：利用edgerr包对表达数据进行差异分析，筛选得到样本在在不同亚群下表达水平显著差异的基因群，所述基因群为上述的基因群。进一步可选的，在s1中，利用trimmomatic软件对测序数据进行处理，从3’端去除接头序列片段和q值小于25的低质量片段，同时去除长度小于35bp的片段，得到的序列片段用于后续分析。进一步可选的，差异分析至少包括以下步骤：s41：采用tmm算法对原始的测序数据进行标准化；s42：统计学模型进行假设检验概率的计算，假设检验概率的计算模型是负二项分布；s43：进行多重假设检验校正，得到错误发现率，错误发现率采用bh算法，筛选基因条件：foldchange>1且pvalue<0.01。下面通过具体实施方式对试剂盒、试剂盒的使用方法展开进一步详细说明。实施例1差异基因的筛选本实施例所用到的具体试剂盒的厂家型号如表3所示，其他试剂如无具体说明均为市售试剂。表3：试剂名称厂家型号qubitdsdnahsassaykitinvitrogen5067-4626qubitrnahsassaykitinvitrogenq32855qubitassaytubeinvitrogenq32856agencourtampurexpkitbeckmancoultera63881vahtsmrna-seqv3libraryprepkitforilluminavazymenr611vahtsrnaadaptersforilluminavazymen809agilentrna6000picokitagilent5067-1513agilentdna1000kitagilent5067-1504一、样本的获得初次确诊并未经治疗的dlbcl患者(瑞金医院临床试验患者，全部为中国人)，有分子检测意愿并征得知情同意后，获取患者穿刺或活检组织标本。注：最后根据病理hans分型/nanostring结果，选择等量的gcb/abc患者标本进行下一步分析。二、新鲜样本的取样流程：取肿瘤部分约1mm×1mm大小，新鲜标本置于0.5-1mlrnalater中，-80℃冰箱或液氮罐内保存。三、新鲜样本的抽提rna流程：1.对于rnalater中保存的组织，镊子夹取并用吸水纸吸干表面残留液体；新鲜组织处理成1mm×1mm左右小块；组织置于ep管内。2.向组织中加入1mltrizol试剂，使用匀浆仪匀浆，静置5分钟。3.加入0.2ml氯仿，静置2-3分钟。4.12000g4℃离心15分钟。5.将上半部分无色水相溶液转移至新ep管中，加入0.5ml异丙醇，静置10分钟。6.12000g4℃离心10分钟。7.此时rna应为白色略透明沉淀，使用移液器小心弃去上清液部分。8.使用1ml75％乙醇洗涤rna，7500g4℃离心5分钟。9.使用移液枪小心弃去上清，通风橱内干燥rna。10.根据rna量，使用20-50ul无rna酶水溶解rna。11.进行后续实验或保存于-80℃冰箱。四、rna样品质控：为保证建库质量，在开始实验前必须对rna样品进行质控，rna样品总量、纯度和完整性须满足以下条件：1.总rna模板的起始投入量应≥10ng，若起始投入量过低，不能确保得到足够的mrna用于后续文库构建。2.od260/od280比值介于1.8-2.1之间。若比值>2.1则rna样品中可能有基因组污染，若比值<1.8则可能有蛋白质污染；od230/od260比值介于0.4-0.5之间，若比值>0.5则可能rna样品中有盐或小分子杂质污染，比值<0.4可能有基因组污染。3.若使用bioanalyzer进行rna完整性检测，rin值≥7.0；若使用琼脂糖凝胶电泳检测，则28s和18s条带明显，且无蛋白质和基因组污染。五、rna样品准备：1.尽量使用rin值高、杂质少的起始模板量为0.01-4μgrna样品，否则会影响建库质量。2.混匀含rna样品的溶液时应小心操作，轻柔吹打，切勿涡旋振荡，否则会使rna断裂，影响文库片段大小。3.rna用nuclease-freeh2o稀释至50μl后放置于冰上并尽快进行后续操作，避免rna降解。4.如果rna的初始体积>50μl，可以使用冻干、乙醇沉淀、过柱回收或磁珠纯化等方法浓缩rna。六、建库流程：(一)mrna分离与片段化1.将mrnacapturebeads、beadswashbuffer、trisbuffer、beadsbindingbuffer从2-8℃取出，静置使其平衡至室温。2.准备rna样品：将0.01-4μg总rna溶解于nuclease-freeh2o至总体积50μl，冰上放置备用。3.缓慢颠倒使mrnacapturebeads充分混匀，吸取50μl加入到准备好的rna样品中，液器轻轻吸打10次充分混匀。4.在pcr仪中进行第一次mrna结合：65℃5min，25℃5min。5.置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。6.将样品从磁力架上取出，加入200μlbeadswashbuffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。7.将样品从磁力架上取出，加入50μltrisbuffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。8.在pcr仪中进行mrna洗脱：80℃5min，25℃hold。9.加入50μlbeadsbindingbuffer，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。10.室温放置5min，使mrna结合到磁珠上。11.置于磁力架上，使mrna与总rna分离，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。12.将样品从磁力架上取出，加入200μlbeadswashbuffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀并置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。13.将样品从磁力架上取出，加入19.5μlfrag/primebuffer重悬磁珠，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。将样品置于pcr仪中，根据插入片段大小的需要，选择片段化条件：85℃6min，4℃hold。14.将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取17μl上清至一个新的nuclease-freepcr管中，并立刻进行第一链cdna合成反应。(二)双链cdna合成1.将1ststrandbuffer从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在pcr管中配制第一链cdna合成反应液，具体配制方法如表4所示：表4组分体积fragmentedmrna17μl1ststrandbuffer6μl1ststrandenzymemix22μltotal25μl2.使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。3.在pcr仪中进行第一链cdna合成反应：25℃10min，42℃15min，70℃15min，4℃hold。结束后立刻进行第二链cdna合成反应。4.将2ndstrandbuffer从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在pcr管中配制第二链cdna合成反应液，具体配制方法如表5所示：表5组分体积1ststrandcdna25μl2ndstrandbuffer20μl2ststrandenzymemix25μltotal50μl5.使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。6.在pcr仪中进行第二链cdna合成反应:16℃60min，4℃hold。二链合成产物可在4℃暂存1小时。7.双链cdna纯化：a.将dnacleanbeads提前30min从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温。b.颠倒或旋涡振荡使dnacleanbeads充分混匀，吸取90μl(1.8×)加入到双链cdna样品中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。c.室温孵育10min，使dna结合到磁珠上。d.将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。e.保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。f.重复步骤e一次。g.保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。h.将样品从磁力架上取出，加入52.5μlnuclease-freeh2o，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取50μl上清至一个新nuclease-freepcr管中。洗脱产物可在-20℃暂存24小时。(三)末端修复1.将endprepmix3从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在pcr管中配制末端修复反应液，具体配制方法如表6所示：表62.使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。3.在pcr仪中进行末端修复反应：20℃15min，65℃15min，4℃hold。(四)接头连接1.将rnaadapter从-20℃取出，解冻后颠倒混匀。2.将rapidligationbuffer解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。3.在pcr管中配制如下反应，具体配制方法如表7所示：表7组分体积endpreparation产物65μlrapidligationbuffer25μlrapiddnaligase5μlrnaadapter2.5μlnuclease-freeh2o2.5μltotal100μl4.使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。5.在pcr仪中进行连接反应：20℃15min，4℃hold。(五)连接产物纯化和片段大小分选1.将dnacleanbeads提前30min从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温。2.颠倒或旋涡振荡使dnacleanbeads充分混匀，吸取100μl(1×)加入到接头连接产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。3.室温孵育10min，使dna结合到磁珠上。4.将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。5.保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。6.重复步骤5一次。7.保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。8.将样品从磁力架上取出，加入102.5μlnuclease-freeh2o，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取100μl上清至一个新的nuclease-freepcr管中。9.颠倒或旋涡振荡使dnacleanbeads充分混匀，吸取60μl(0.6×)加入到纯化过的连接产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。10.室温孵育10min，使dna结合到磁珠上。11.将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，保持样品始终处于磁力架上，吸取155μl上清至一个新的nuclease-freepcr管中。12.加入10μldnacleanbeads，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。13.室温孵育10min，使dna结合到磁珠上。14.将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。15.保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。16.重复步骤15一次。17.保持样品始终处于磁力架上，在室温下干燥磁珠约5-10min。18.将样品从磁力架上取出，加入22.5μlnuclease-freeh2o，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μl上清至一个新的nuclease-freepcr管中。(六)文库扩增1.将pcrprimermix、amplificationmix1从-20℃取出，解冻后颠倒混匀，在pcr管中配制pcr反应液，具体配制方法如表8所示：表8组分体积纯化过的接头连接产物20μlpcrprimermix5μlamplicationmix125μltotal60μl使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。2.将样品置于pcr仪中，进行文库扩增反应：98℃30sec，(98℃10sec，60℃30sec，72℃30sec)12cycles，72℃5min。3.pcr产物纯化：a.将dnacleanbeads提前30min从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温。b.颠倒或旋涡振荡使dnacleanbeads充分混匀，吸取50μl(1×)加入到pcr产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。c.室温孵育10min,使dna结合到磁珠上。d.将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清。e.保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。f.重复步骤e一次。g.保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。h.将样品从磁力架上取出，加入25μlnuclease-freeh2o，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取22.5μl上清至一个新的nuclease-freepcr管中。(七)数据分析流程：1.数据基本统计及评估采用illumina测序平台的双端测序(2×150bp)模式对样本进行高通量测序，测序数据以fastaq文件格式存储，其中包含测序序列的序列信息和测序质量信息。一般情况下，测序序列5，端前几个碱基错误率较高，3，端碱基错误率随着序列延伸而不断升高。根据测序数据的低质量碱基集中于末端的分布特点，利用trimmomatic软件对测序数据进行处理，标准如下:从3’端去除接头序列片段和q值小于25的低质量片段，同时去除长度小于35bp的片段，得到的干净的序列片段用于后续分析。2、利用star软件对测序数据进行比对本发明实施例采用rna-seq比对算法star(splicedtranscriptsalignmentstoareference，star)软件，该软件算法使用了未压缩后缀阵列中的连续最大可比对种子搜索，接着种子聚类和缝合过程，改进了比对敏感性和准确性。除了典型剪接的非偏从头检测外，star能够发现非典型拼接和嵌合(融合)转录本，并能够比对全长rna序列3、利用htseq-count计算每个基因的表达量利用htseq-count对比对后的bam计算每个基因的表达量。4、利用edgerr包筛选出对应的差异基因基因表达定量完成后，利用edgerr包，对其表达数据进行统计学分析，筛选样本在不同状态下表达水平显著差异的基因。差异分析主要分为三个步骤。4.1对原始的测序数据进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正，标准化方法是tmm算法。4.2统计学模型进行假设检验概率(pvalue)的计算，pvalue计算模型是负二项分布。4.3进行多重假设检验校正，得到fdr值(错误发现率)。fdr计算方法是bh算法。筛选基因条件：foldchange>1且pvalue<0.01。筛选得到的结果如表1和表2所示。(八)结果验证采用本发明实施例的方法对样本进行分型，具体方法为：检测待测样本中上述178个基因的表达水平，与图1所示的基因分型图进行类比，如果待测样本落在图1所示的abc标尺区域内(位于图1左侧的深色区域)，则为abc亚型，如果待测样本落在图1所示的gcb标尺区域内(位于图1右侧的浅色区域)，则为gcb亚型。图1给出了待测样本落在gcb标尺区域内的实例。分型得到的实验结果如表9所示。同时对患者进行临床分类，参考dlbcl病理hans分型及公认的石蜡组织检测dlbcl来源的lymph2cx。临床分类的结果也如表9所示。表9由表9可知，本发明实施例分型的准确率可达到100％。实施例2rna标本aglient2100质控流程：(一)rnaladder的制备1、将ladder试剂取出并离心，转移至rnase-freepcr管；2、加热使ladder变性，反应条件为：70℃，2min；3、立即放置于冰上冷却；4、合并，加入90μlrnase-free水，充分混匀；5、将上述变性、稀释后的ladder按照日常实验每日所需的量，分装于0.5mlrnase-free离心管中；6、分装的ladder存放于-70℃冰箱内。ladder仅需一次变性，分装后的ladder不需要重复加热变性。7、使用时，应将分装后的一管ladder置于冰上，避免温度过高。(二)凝胶的制备1、吸取550μlrnagelmatrix(红盖)至带有吸附柱的离心管中；2、室温离心：1500g±20％，10min；3、将过滤后的凝胶按照每管65μl的规格分装至0.5mlrnase-free离心管中，过滤后的凝胶仅可使用最多4周，应保存在4℃环境中。(三)凝胶-染料混合液(gel-dyemix)的制备1、试剂rnadyeconcentrate(蓝盖)应提前置于室温平衡30min；2、震荡混匀10s，简短离心，取1μl染料加入65μl分装的、过滤后的凝胶中；3、充分震荡，室温条件下13000g离心10min。该配置好的凝胶-染料混合液仅供当天使用。(四)加入凝胶-染料混合液(gel-dyemix)1、将一块新的rna芯片放置于压胶装置的底座上；2、吸取9μl凝胶-染料混合液，加进标志为“g”的孔中(g字母有黑底，即第四列与第三行交叉的孔，如图2所示)；3、确定将吸筒的活塞推至1ml刻度处，然后关闭压胶装置；4、向下压活塞直至活塞尾部被压胶装置上部的夹子扣住；5、等待30s，然后松开夹子；6、等待5s，将活塞轻轻拉至1ml处；7、打开压胶装置，吸取9μl凝胶-染料混合液，加进标志为“g”的两个孔中(g字母为白底，即第四列与第一行、第二行交叉的孔，如图3所示)；8、遗弃剩余的凝胶-染料混合液。(五)加入conditioningsolution试剂和marker试剂1、吸取9μlrnaconditioningsolution(白盖)，加进标有“cs”的孔中(即第四列与第四行交叉的孔，如图4所示)；2、吸取5μlrnamarker(绿盖)，加进所有11个样本孔(samplewells)和标有“梯子”的孔中(即第1～3列与第1～4行交叉的孔，如图5所示)。(六)加入稀释的ladder试剂和样本1、吸取1μl加热变性、分装的ladder试剂，加进标有“梯子”的孔中(即第三列与第四行交叉的孔，如图6所示)。2、吸取1μl待测样本，按顺序依次加进11个样本孔(samplewells，即第1～2列与第1～4行交叉的孔以及第3列与第1～3行交叉的孔，如图7所示)中。如果有多余的样本孔，则加入1μlrnamarker(绿盖)进行补足。3、将芯片平稳放置于ika振荡器中，2400rpm震荡1min。4、在5min之内使用agilent2100bioanalyzerinstrument进行检测。得到实验结果如图8所示。如图8所示，图8上主要有18s和28s两个峰，表明rna样本未见明显降解，质量合格。本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。当前第1页12