本发明涉及免疫学和细胞生物学技术领域,具体说是含有不稳定结构域的car-t细胞及其制备方法和调节car-t细胞功能方法。
背景技术:
在细胞免疫治疗领域,car-t疗法已成为研究热点,其主要原理为经嵌合抗原受体修饰的t细胞,可以特异性的识别肿瘤相关抗原,使效应性t细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均高于常规应用的免疫细胞,并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。目前,随着研究的深入,人们越来越考虑car-t应用中的安全性问题,即如何精确控制car-t细胞引起的抗原活动(如细胞因子风暴等),并减少其他可能引起的副作用,对car-t细胞的活性实现精细控制等。
化学诱导的二聚体化技术cid即当加入小分子药物rimiducid时,会引起分开的两个单体结合,当每个单体上连接的激活或抑制原件靠近形成二聚体时,会起激活或抑制作用,最终实现用药物控制活性开关。cid技术结合car-t技术,即开发了自杀开关cidecar和活性开关gocar-t,以提供比现有细胞免疫疗法更安全有效的方法。其中,自杀开关cidecar技术是将引起细胞凋亡的自杀蛋白caspase9连接到药物结合结构域单体上,当口服化学药物后,引起caspase9二聚体化,从而被激活启动细胞凋亡程序,进而引发car-t细胞凋亡,从体内清除car-t,中止反应。而活性开关gocar-t技术是将car的共激活信号连接到药物结合结构域单体上,若不口服化学药物后,仅靠肿瘤细胞的接触不能启动car-t细胞,通过口服化学药物,可提供共激活信号,启动和激活car-t反应。
近年来发展出来一种依赖于细胞内分解机器的蛋白调控系统,利用细胞膜可透过的小分子化合物配体和特定结构域来实现对感兴趣蛋白的调节,所谓的特定结构域,指蛋白相应的结构域编码基因经过突变后,在小分子化合物配体不存在的情况下,该结构域变的不稳定,易被细胞内蛋白酶体降解,而结合小分子配体后,该结构域趋于稳定,这样的结构域称为不稳定结构域(destabilizingdomains;dd)。目前不稳定结构域一般和免疫调节因子连接,这些因子可能增强过继细胞疗法的功效,但需要精确控制以优化其治疗效果,目前的技术无法精确调控细胞发挥治疗作用的时间或细胞因子的表达水平,这使许多潜在的应用难以安全有效地部署,缺乏可调性也使得瞬时表达的强效蛋白难以安全表达。
技术实现要素:
为解决上述问题,本发明的目的是提供一种含有不稳定结构域的car-t细胞及其制备方法和调节car-t细胞功能方法。
本发明为实现上述目的,通过以下技术方案实现:
一种含有不稳定结构域的car-t细胞,在car-t细胞中含有不稳定结构域的编码基因,并且去除终止密码子的car基因的3’端与不稳定结构域的编码基因直接连接,构成融合基因;在car-t细胞中表达上述融合基因编码的融合蛋白,该融合蛋白n端为car分子,c端为不稳定结构域,定位于细胞膜。
在car-t细胞中,由于不稳定结构域的特性,上述表达的融合蛋白易被蛋白酶体降解,导致细胞膜上car分子不能积累;当不稳定结构域对应的小分子化合物配体存在于car-t细胞中时,上述融合蛋白不被蛋白酶体降解,细胞膜上car分子得到积累。融合蛋白中不稳定结构域的存在,不会影响car分子自身的功能。
本发明对不稳定结构域的种类和来源不进行限定,可以来源于文献报道或者操作者筛选得到。
优选的一种含有不稳定结构域的car-t细胞,所述的不稳定结构域为二氢叶酸还原酶dhfr的不稳定结构域、fkbp12蛋白的不稳定结构域或基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域erlbp。
本发明还包括含有不稳定结构域的car-t细胞的制备方法,包括以下步骤:
①将不稳定结构域的编码基因与car基因末端连接,构建融合基因;具体的,将不稳定结构域的编码基因置于car基因的3’端,连接构成融合基因;
②将步骤①所得融合基因克隆插入慢病毒质粒;
③包装病毒,制备携带融合基因的慢病毒;
④用步骤③所得慢病毒感染t细胞并扩增。
本发明还公开了调节含有不稳定结构域的car-t细胞功能的方法,加入不稳定结构域对应的小分子化合物。
优选的调节含有不稳定结构域的car-t细胞功能的方法,当所述不稳定结构域为二氢叶酸还原酶dhfr的不稳定结构域,对应小分子化合物为甲氧苄啶tmp;当所述不稳定结构域为fkbp12蛋白的不稳定结构域,对应小分子化合物为shied-1;当所述不稳定结构域为基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域erlbp,对应小分子化合物为4-羟基他莫昔芬。
本发明相比现有技术具有以下优点:
在本申请所指的car-t细胞中,去除终止密码子的car基因的3’端与dd的编码基因直接连接,构成融合基因;该融合基因编码的融合蛋白,n端为car分子,c端为不稳定结构域;dd的不稳定特性直接传递给car分子,包含car分子在内的整个融合蛋白被细胞内蛋白酶体降解,导致细胞膜上car分子不能积累;在dd小分子配体存在的情况下,包含car分子在内整个融合蛋白不被蛋白酶体降解,细胞膜上car分子得到积累。融合蛋白中不稳定结构域的存在,不会影响car分子自身的正常功能。通过人为添加小分子这一简便方式,调节细胞膜上car分子的数量,进而改变car-t细胞的功能。本申请所述方法直接在蛋白水平上对car分子数量进行调节,调节快速。
本发明的含有不稳定结构域的car-t细胞的制备方法,流程少,步骤易于操作,便于实现产业化;本发明公开的调节含有不稳定结构域的car-t细胞功能的方法,只需加入不稳定结构域对应的小分子化合物即可调节car分子的数量,并且不稳定结构域的存在,不会影响car分子自身的功能。
附图说明
图1小分子化合物调节含有不稳定结构域的car-t细胞功能的原理示意图;
图2dd-car的序列结构(dd为不稳定结构域,scfv为单链抗体);
图3小分子tmp调节dhfr-cd19car-t细胞表面的car分子数目;
图4小分子tmp调节dhfr-cd19car-t细胞体内抗肿瘤效应;
图5小分子shield调节fkbp-cd19car-t细胞对raji细胞的杀伤效应。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种含有不稳定结构域的car-t细胞及其制备方法和调节car-t细胞功能方法,通过以下技术方案实现:
一种含有不稳定结构域的car-t细胞,在car-t细胞中含有不稳定结构域的编码基因,并且去除终止密码子的car基因的3’端与不稳定结构域的编码基因直接连接,构成融合基因;在car-t细胞中表达上述融合基因编码的融合蛋白,该融合蛋白n端为car分子,c端为不稳定结构域,定位于细胞膜。
在car-t细胞中,由于不稳定结构域的特性,上述表达的融合蛋白易被蛋白酶体降解,导致细胞膜上car分子不能积累;当不稳定结构域对应的小分子化合物配体存在于car-t细胞中时,上述融合蛋白不被蛋白酶体降解,细胞膜上car分子得到积累。融合蛋白中不稳定结构域的存在,不会影响car分子自身的功能。
优选的一种含有不稳定结构域的car-t细胞,所述的不稳定结构域为二氢叶酸还原酶dhfr的不稳定结构域、fkbp12蛋白的不稳定结构域或基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域erlbp。
本发明还包括含有不稳定结构域的car-t细胞的制备方法,包括以下步骤:
①将不稳定结构域的编码基因与car基因末端连接,构建融合基因;具体的,将不稳定结构域的编码基因置于car基因的3’端,连接构成融合基因;
②将步骤①所得融合基因克隆插入慢病毒质粒;
③包装病毒,制备携带融合基因的慢病毒;
④用步骤③所得慢病毒感染t细胞并扩增。
本发明还公开了调节含有不稳定结构域的car-t细胞功能的方法,加入不稳定结构域对应的小分子化合物;小分子化合物的添加量为0-1000μmol/l。如图1所示,图1中的三角形为小分子化合物,其作为配体结合不稳定结构域后使其稳定,使得细胞表面car分子数得到积累。
优选的调节含有不稳定结构域的car-t细胞功能的方法,当所述不稳定结构域为二氢叶酸还原酶dhfr的不稳定结构域,对应小分子化合物为甲氧苄啶tmp;当所述不稳定结构域为fkbp12蛋白的不稳定结构域,对应小分子化合物为shied-1;当所述不稳定结构域为基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域erlbp,对应小分子化合物为4-羟基他莫昔芬。
本发明实施例中部分序列或质粒等的来源:
dhfr的序列来源为文献iwamotom,
cd19car的单链抗体(scfv)序列根据以下文献获取:nicholsonic,lentonka,littledj,decorsot,leeft,etal.(1997)constructionandcharacterisationofafunctionalcd19specificsinglechainfvfragmentforimmunotherapyofblineageleukaemiaandlymphoma.molimmunol34:1157–1165.
fkbp氨基酸序列通过以下文献得到:banaszynskila,chenlc,maynard-smithla,ooiag,wandlesstj.arapid,reversible,andtunablemethodtoregulateproteinfunctioninlivingcellsusingsyntheticsmallmolecules.cell.2006sep8;126(5):995-1004.
基于雌激素受体配体结合结构域发展的不稳定结构域(erlbd),其对应小分子化合物为4-羟基他莫昔芬,erlbd的获取方法在以下文献中有相关介绍:miyazakiy,imotoh,chenlc,wandlesstj.destabilizingdomainsderivedfromthehumanestrogenreceptor.jamchemsoc.2012mar7;134(9):3942-5.
plvx-ef1α-ires-mcherry质粒为常用慢病毒质粒,可从takara公司购买,cat.#631987。cd3分选磁珠购买于美天旎公司,人cd3microbeads,orderno.130-050-101。
使用不稳定结构域对应的小分子化合物调节含有不稳定结构域的car-t细胞功能时,小分子化合物的添加量一般在0-1000μmol/l。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1制备dhfr-cd19car-t细胞
一、全基因合成dhfr与cd19car的融合基因
不稳定结构域dd选择二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase)的不稳定结构域,简称dhfr;其小分子化合物配体为甲氧苄啶(tmp)
dhfr的序列为sedidno:1,cd19car的跨膜区、共刺激信号区、cd3ζ序列序列为sedidno:2,按照图2的位置关系,将scfv序列和跨膜区、共刺激信号区、cd3ζ序列相连,构建cd19car,其序列为seqidno:3;
全基因合成dhfr和cd19car的融合基因,使融合基因上游酶切位点为xbai,下游酶切位点为bamhi;融合基因(dhfr-cd19car)序列为seqidno:4;在本融合基因中,dhfr编码基因与cd19car的cd3-ζ链末端连接,这样在融合基因表达产物融合蛋白中,dhfr位于融合蛋白c端。
二、构建携带dhfr-cd19car融合基因的慢病毒质粒
用xbai和bamhi双酶切上述基因片段,及plvx-ef1α-ires-mcherry质粒;切胶回收;常规分子生物学方法连接;将连接产物转化stbl3感受态细胞,涂布lb培养基平板(氨苄青霉素抗性);挑取单克隆至lb培养基过夜;小提质粒,xbai和bamhi双酶切结合凝胶电泳验证之;利用通用引物进一步质粒测序验证正确性;将质粒保存于-20℃,命名为plvx-dhfr-cd19car。
本实施例通用引物购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。
三、制备携带dhfr-cd19car融合蛋白的慢病毒
1、质粒大提
将plvx-dhfr-cd19car质粒常规转化stbl3感受态,挑取单克隆至500ml锥形瓶(内含200mllb培养基),过夜培养,利用天根质粒大提试剂盒提取质粒,ddh2o洗脱质粒,nanadrop测得质粒浓度大于1.2μg/μl。
2、病毒包装
(1)制备a液:取1.5mlep管,加入opti-mem1.2ml,加入各质粒如下,涡旋振荡5~10s以彻底混匀;
质粒质量比:
pspax27.5μg
pmd2.g2.5μg
plvx-dhfr-cd19car20μg
(2)制备b液:取15ml离心管,取opti-mem1.5ml,lipo200060μl加入离心管中,涡旋振荡5-10s;
(3)将a液加入b液中,涡旋振荡5-10s,常温放置20min;
(4)293t准备:293tcells铺10cmplate,至293tcells融合度达到80%;
(5)将a、b混合液均匀滴在上述10cmplate中,静置3-5min,轻轻摇匀,37℃培养箱培养约60h;
(6)2000rpm离心10min,去除细胞碎片,0.45μm滤膜过滤;
(7)收集上清液,分装置于-80℃保存。
四、携带dhfr-cd19car融合基因的慢病毒感染t细胞
1、cd3阳性t细胞筛选
(1)收集pbmc细胞,计数板计数。
(2)将一定剂量的cd3分选磁珠加入细胞悬液中,(每107细胞加入20ulmicrobeads)等待片刻;
(3)将分选柱放于分选架上,用0.5mlbuffer(pbs+0.5%bsa+0.5mmedta)冲洗分选柱;
(4)细胞悬液过柱,弃过柱液。
(5)将分选柱取下,用buffer将筛选的t细胞冲入培养瓶/皿中,加入完全培养基和il-2培养;
2、t细胞活化
(1)t细胞计数,将5e+5/wt细胞加入24孔板;
(2)每孔加入anti-cd3300ng/ml,il-2100iu/ml;
(3)37℃过夜培养;
3、retronectin包被培养板
(1)pbs稀释retronectin4ug/ml,包被培养板3ug/cm2;
(2)将适量体积的retronectin加入培养板,室温2小时或4℃过夜;
24孔细胞培养板:0.5ml/孔;
6孔细胞培养板:2ml/孔;
(3)弃去retronectin,加适量体积的2%bsa的pbs终止,室温30min;
24孔细胞培养板:0.5ml/孔;
6孔细胞培养板:2ml/孔;
(4)弃去bsa溶液,用pbs洗板一次,弃去上清液。
注:retronectin可以用封口膜封闭后,4℃保存一周。
4、慢病毒感染t细胞
(1)将病毒按照的moi=50值加入retronectin包被的24孔板中,3000rpm32℃离心2h;
(2)将t细胞加入24孔板,细胞数不超过5e+5/孔,3000rpm32℃离心2h;
(3)补充适量培养基(或不补充,最多不超过1ml),加入il-2100iu/ml,polybrene8ug/ml;
(4)37℃培养,5%co2培养。
五、dhfr-cd19car-t细胞扩增
1、dhfr-cd19car-t细胞扩增
37℃培养,5%co2培养。加入适量x-vivo15无血清培养基,il-2100iu/ml,隔天换液或加液,保持细胞密度在1*10^6/ml左右。
2、感染率测定
取1*10^5细胞,流式测定mcherry发光细胞数目的比率,经检测,感染率45%。
实施例2
利用tmp调节实施例1制备的dhfr-cd19car-t细胞膜表面car分子数
取实施例1构建的dhfr-cd19car-t细胞,置于24孔板中,每孔5*10^5个car-t细胞,加入dhfr配体-甲氧苄啶至终浓度分别为0nm、10nm、100nm、1000nm、10000nm;每组3个平行;培养24h;
取生物素标记的cd19蛋白(biotinylatedhumancd19,fctag,ultrasensitivity(primaryaminelabeling),acrobiosystems,cat.no.cd9-h8259),fitc标记的链霉亲和素(fitc-sa,biolegend,cat.no.405201),按照相应说明书方法进行流式检测,测定car阳性细胞群的平均荧光强度,膜表面car分子数越多,荧光强度越强。
如图3所示,平均荧光强度随tmp浓度的增加而增加,呈现剂量依赖性,这显示了tmp可以调节dhfr-cd19car-t细胞膜表面的car分子数。
实施例3
利用tmp调节实施例1制备的dhfr-cd19car-t体内抗肿瘤效应
1、选用雄性nsg小鼠(8周),nsg小鼠处于spf环境中喂养;分为a、b、c组,各6只;
2、常规方法培养raji细胞;收集raji细胞,pbs重悬细胞;每只nsg小鼠尾静脉注射2*10^6个细胞,标为day0(第0天);
3、day3(第3天),收集dhfr-cd19car-t细胞,pbs重悬细胞;对于b、c组nsg小鼠,尾静脉注射2*10^6个dhfr-cd19car-t细胞/只鼠;a组nsg小鼠注射相同体积的pbs;c组小鼠饮水中添加tmp(0.25mg/ml)。
4、每天观察小鼠生存状态,记录小鼠死亡时间,绘制生存曲线,如图4所示,tmp可以延长小鼠生存期,表明tmp可以在机体内调节dhfr-cd19car-t的抗肿瘤效应。
实施例4
制备fkbp-cd19car-t细胞
一、全基因合成fkbp与cd19car的融合基因
1、dd选择fkbp12蛋白的不稳定结构域,简称fkbp,其对应小分子化合物为shield-1;
2、fkbp氨基酸序列见seqidno:5;
3、全基因合成fkbp和cd19car的融合基因,使融合基因上游酶切位点为xbai,下游酶切位点为bamhi;融合基因(fkbp-cd19car);在本融合基因中,fkbp编码基因与cd19car的cd3-ζ链末端连接,这样在融合基因表达产物融合蛋白中,fkbp位于融合蛋白c端。
二、构建携带fkbp-cd19car融合基因的慢病毒质粒
1、用xbai和bamhi双酶切上述基因片段,及plvx-ef1α-ires-mcherry质粒;切胶回收;常规分子生物学方法连接;
2、将连接产物转化stbl3感受态细胞;涂布lb培养基平板(氨苄青霉素抗性);
3、挑取单克隆至lb培养基培养过夜;
4、小提质粒,xbai和bamhi双酶切结合凝胶电泳验证之;利用通用引物进一步质粒测序验证正确性;该通用引物购买于生工生物工程(上海)股份有限公司;
5、质粒保存于-20℃,命名为plvx-fkbp-cd19car。
三、制备携带fkbp-cd19car融合基因的慢病毒
1、质粒大提
将plvx-fkbp-cd19car质粒常规转化stbl3感受态,挑取单克隆至500ml锥形瓶(内含200mllb培养基),过夜培养,利用天根质粒大提试剂盒提取质粒,ddh2o洗脱质粒,nanadrop测得质粒浓度大于1.2μg/μl。
2、病毒包装
(1)制备a液:取1.5mlep管,加入opti-mem1.2ml,加入各质粒如下,涡旋振荡5-10s以彻底混匀。
质粒质量比:
pspax27.5μg;
pmd2.g2.5μg;
plvx-fkbp-cd19car20μg;
(2)制备b液:取15ml离心管,加入opti-mem1.5ml,lipo200060μl加入opti-mem中,涡旋振荡5-10s;
(3)将a液加入b液中,涡旋振荡5-10s,常温放置20min;
(4)293t准备:293tcells铺10cmplate,至293tcells融合度达到80%;
(5)将a、b混合液均匀滴在上述10cmplate中,静置3-5min,轻轻摇匀,37℃培养箱培养约60h;
(6)2000rpm离心10min,去除细胞碎片。0.45μm滤膜过滤;
(7)收集上清液,分装置于-80℃保存。
四、携带fkbp-cd19car融合基因的慢病毒的慢病毒感染t细胞
1、cd3阳性t细胞筛选
(1)收集pbmc细胞,计数板计数;
(2)将一定剂量的cd3分选磁珠加入细胞悬液中,(每107细胞加入20ulmicrobeads),等待片刻;
(3)将分选柱放于分选架上,用0.5mlbuffer(pbs+0.5%bsa+0.5mmedta)冲洗分选柱;
(4)细胞悬液过柱,弃过柱液;
(5)将分选柱取下,用buffer将筛选的t细胞冲入培养瓶/皿中,加入完全培养基和il-2培养。
2、t细胞活化
(1)t细胞计数,将5e+5/wt细胞加入24孔板;
(2)每孔加入anti-cd3300ng/ml,il-2100iu/ml;
(3)37℃培养6h或过夜培养。
3、retronectin包被培养板
(1)pbs稀释retronectin4ug/ml,包被培养板3ug/cm2;
(2)将适量体积的retronectin加入培养板,室温2小时或4℃过夜;
24孔细胞培养板:0.5ml/孔;
6孔细胞培养板:2ml/孔;
(3)弃去retronectin,加适量体积的2%bsa的pbs终止,室温30min;
24孔细胞培养板:0.5ml/孔;
6孔细胞培养板:2ml/孔;
(4)弃去bsa溶液,用pbs洗板一次,弃去上清液;
注:retronectin可以用封口膜封闭后,4℃保存一周。
4、慢病毒感染t细胞
(1)将病毒按照的moi=50值加入retronectin包被的24孔板中,3000rpm32℃离心2h;
(2)将t细胞加入24孔板,细胞数不超过5e+5/孔,3000rpm32℃离心2h;
(3)补充适量培养基(或不补充,最多不超过1ml),加入il-2100iu/ml,polybrene8ug/ml;
(4)37℃培养,5%co2培养。
五、fkbp-cd19car-t细胞扩增
1、car-t细胞扩增
37℃,5%co2培养,加入适量x-vivo15无血清培养基,il-2100iu/ml,隔天换液或加液,保持细胞密度在1*10^6/ml左右。
2、感染率测定
取1*10^5细胞,流式测定mcherry发光细胞数目的比率,经检测,感染率35%。
实施例5
shild-1调节fkbp-cd19car-t细胞杀伤功能
取已构建的fkbp-cd19car-t细胞,置于24孔板中,每孔5*10^5个car-t细胞,加入fkbp配体-shild-1至终浓度分别为0nm、1000nm;每组3个平行;培养24h。
分半收集上述细胞,离心去除上清,更换新鲜培养基。以raji为靶标细胞,按照效靶比5:1构建杀伤体系,流式检测杀伤效应,如图5所示,结果表明加入1000nmshild-1杀伤率为63.9%,而未加入shild-1时,其杀伤效应为28.5%。
序列表
<110>山东大学第二医院
<120>一种含有不稳定结构域的car-t细胞及其制备方法和调节car-t细胞功能方法
<130>20190506a-1
<141>2019-05-06
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>477
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atctctctgatcgccgccctggcagtggaccacgtgatcggcatggagaccgtgatgcca60
tggaacctgcccgccgatctggcctggttcaagcggaacaccctgaataagccagtgatc120
atgggcagacacacatgggagtccatcggcaggcccctgcctggacgcaagaatatcatc180
ctgagctcccagcccagcaccgacgatagggtgacatgggtgaagtccgtggacgaggca240
atcgcagcatgcggcgatgtgcccgagatcatggtcatcggcggcggcagagtgtacgag300
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gacacacactttcctgattacgagccagacgattgggagtccgtgttctctgagtttcac420
gacgccgatgcccagaactctcacagctattgttttgagatcctggagcggagataa477
<210>2
<211>660
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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tgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcc180
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<210>3
<211>1503
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatc900
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tttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaac1080
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gacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtac1200
cagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgat1260
gttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaag1320
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