抗CLDN抗体及其药物组合物和检测方法与流程

本发明涉及一种抗cldn抗体，本发明还涉及一种包含抗cldn抗体的药物组合物，本发明还涉及检测生物样品中是否存在cldn的方法。
背景技术：
：紧密连接(tightjunction,tj)在细胞间物质流转中起到关键作用，还通过阻断膜蛋白和膜脂径向扩散维持细胞极性，此外还参与招募调控细胞增殖、分化和运动的信号分子。紧密连接由紧密连接蛋白(claudin,cldn)形成，而紧密连接蛋白家族由超过20种蛋白分子组成，其成员均含有一个四次跨膜的结构域和相似的氨基酸序列，但组织分布具有一定特异性。人类cldn基因以成对形式分布在不同染色体上，这暗示了某些cldn基因来源于基因复制。cldn蛋白分子量大多处于20-34kda范围内，最大区别是胞内c-端的序列和大小，该段序列包含1个pdz结构域结合基序，该基序使得cldn蛋白能够直接和胞质内的紧密连接相关蛋白，如zo-1、zo-2、zo-3以及mupp1相互作用。此外，这段序列种含有磷酸化位点等转录后修饰位点，能够影响蛋白分子的定位和功能。mapk(mitogen-activatedproteinkinase)或者pkc(proteinkinasec)能够磷酸化cldn1，camp(cyclicamp)诱导cldn5磷酸化，都能促进cldn蛋白的屏障功能，而pka介导的cldn16磷酸化则能增强镁离子运输。cldn在调控细胞旁路的选择性渗透中起到关键作用，cldn2和cldn15参与形成阳离子通道和阳离子孔隙，cldn4/7/10则参与构成阴离子通道和孔隙。在某些细胞系中claudin蛋白高表达，从而影响跨膜电阻和渗透性。在培养的表皮来源细胞中，cldn1/4/5/7能够提高跨膜电阻，而cldn2和cldn10反之。cldn基因突变被认为与多种疾病有关。cldn1突变可能会导致硬化性胆管炎(sclerosingcholangitis)和鱼鳞癣(ichthyosis)，cldn16和cldn19突变则被认为与低镁症(hypomagnesemia)和高钙尿症(hypercalcinuria)有关。cldn蛋白的差异性表达被认为与多种癌症相关联。cldn1和cldn7在侵入性乳腺癌、前列腺癌和食管癌中发生下调，而在宫颈癌、结肠癌、食管癌、胃癌等多种癌症中发现cldn3/4发生不同程度上调。sahin等发现在正常组织中，cldn18的isoform2亚型(cldn18.2)只在胃黏膜的分化后表皮细胞中表达，在胃干细胞区域则未见表达，但在原发性胃癌及其转移灶中均发现异常高表达。在胰腺癌、食管癌和肺癌中也有cldn18.2高表达的报道。由于cldn18.2定位于细胞膜表面，其生物学功能和特征决定了它是一种理想的治疗靶点，而近年来针对该靶点也有单抗面世，其中发展最快的是ganymed公司的imab362(claudiximab)。imab362在肿瘤细胞表面结合cldn18.2，诱导抗体依赖的细胞毒性作用(antibody-dependentcytotoxicity，adcc)和补体依赖的细胞毒性作用(complementdependentcytotoxicity，cdc)从而杀伤肿瘤细胞。而与化疗结合使用时，imab362还能增强t细胞浸润及上调促炎症因子。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种抗cldn抗体及其药物组合物和检测方法。本发明采用了如下技术方案：一种抗cldn抗体，其特征在于，包括重链和轻链：其中，抗体的重链包含一种或一种以上的cdr，重链的cdr与seqidno.1至seqidno.7中或者seqidno.15至seqidno.30中的任意一条的cdr序列相比，相差不多于三个氨基酸，抗体的轻链包含一种或一种以上的cdr，轻链的cdr与seqidno.8至seqidno.14中或者seqidno.31至seqidno.46中的任意一条的cdr序列相比，相差不多于三个氨基酸。进一步，本发明的抗cldn抗体，还具有这样的特征：抗体的重链选自seqidno.1至no.7中的任意一条。进一步，本发明的抗cldn抗体，还具有这样的特征：抗体的轻链选自如seqidno.8至seqidno.14中或者seqidno.31至seqidno.46中的任意一条。进一步，本发明的抗cldn抗体，还具有这样的特征：抗体的重链选自seqidno.15至seqidno.30中的任意一条。进一步，本发明的抗cldn抗体，还具有这样的特征：抗体的轻链选自seqidno.31至seqidno.46中的任意一条。进一步，本发明的抗cldn抗体，还具有这样的特征：其中，抗体的重链和轻链的组合有：seqidno.1和seqidn0.8，seqidno.2和seqidn0.9，seqidno.3和seqidno.10，seqidno.4和seqidno.11，seqidno.5和seqidno.12，seqidno.6和seqidno.13，seqidno.7和seqidno.14，seqidno.15和seqidno.31，seqidno.16和seqidno.32，seqidno.17和seqidno.33，seqidno.18和seqidno.34，seqidno.19和seqidno.35，seqidno.20和seqidno.36，seqidno.21和seqidno.37，seqidno.22和seqidno.38，seqidno.23和seqidno.39，seqidno.24和seqidno.40，seqidno.25和seqidno.41，seqidno.26和seqidno.42，seqidno.27和seqidno.43，seqidno.28和seqidno.44，seqidno.29和seqidno.45，seqidno.30和seqidno.46。本发明还提供一种编码如上所述的抗体的多核苷酸。本发明还提供一种包含上述任意一项所述的抗体的药物组合物。本发明还提供上述任意一项所述的抗体，在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供一种检测生物样品中是否存在cldn的方法，其特征在于，包括：给予生物样品如上述任意一项所述的抗体的步骤，其中所述抗体具有可检测标志物，以及检测是否存在所述可检测标志物，或者检测所述可检测标志物含量的步骤。发明的有益效果本发明的抗cldn抗体，与细胞结合的能力较imab362强。并且本发明的抗体比imab362在体内动物药效中表现出更好的抑制肿瘤生长的效果。附图说明图1a是对照抗体qp024025对chos细胞的结合能力图1b是杂交瘤筛选出的抗体qp188189对chos细胞的结合能力图1c是杂交瘤筛选出的抗体qp190191对chos细胞的结合能力图1d是杂交瘤筛选出的抗体qp192193对chos细胞的结合能力图1e是杂交瘤筛选出的抗体qp196198对chos细胞的结合能力图1f是杂交瘤筛选出的抗体qp199200对chos细胞的结合能力图1g是杂交瘤筛选出的抗体qp201202对chos细胞的结合能力图1h是杂交瘤筛选出的抗体qp207208对chos细胞的结合能力图2a是噬菌体筛选出的抗体qp10731074对chos细胞的结合能力。图2b是噬菌体筛选出的抗体qp10791080对chos细胞的结合能力。图2c是噬菌体筛选出的抗体qp10851086对chos细胞的结合能力。图2d是噬菌体筛选出的抗体qp10911092对chos细胞的结合能力。图2e是噬菌体筛选出的抗体qp10971098对chos细胞的结合能力。图2f是噬菌体筛选出的抗体qp10991100对chos细胞的结合能力。图3a是噬菌体筛选出的抗体qp11051106对chos细胞的结合能力。图3b是噬菌体筛选出的抗体qp11071108对chos细胞的结合能力。图3c是噬菌体筛选出的抗体qp11091110对chos细胞的结合能力。图3d是噬菌体筛选出的抗体qp11111112对chos细胞的结合能力。图3e是噬菌体筛选出的抗体qp11131114对chos细胞的结合能力。图3f是噬菌体筛选出的抗体qp11151116对chos细胞的结合能力。图4a是噬菌体筛选出的抗体qp11171118对chos细胞的结合能力。图4b是噬菌体筛选出的抗体qp11031104对chos细胞的结合能力。图4c是噬菌体筛选出的抗体qp10451046对chos细胞的结合能力。图4d是噬菌体筛选出的抗体qp10471048对chos细胞的结合能力。图5a是对照抗体qp024025对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图5b是杂交瘤筛选出的抗体qp188189对不同293t瞬转细胞株的结合能力图5c是杂交瘤筛选出的抗体qp190191对不同293t瞬转细胞株的结合能力图5d是杂交瘤筛选出的抗体qp192193对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图5e是杂交瘤筛选出的抗体qp196198对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图5f是杂交瘤筛选出的抗体qp199200对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图5g是杂交瘤筛选出的抗体qp201202对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图5h是杂交瘤筛选出的抗体qp207208对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6a是噬菌体筛选出的抗体qp10451046对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6b是噬菌体筛选出的抗体qp10711072对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6c是噬菌体筛选出的抗体qp10731074对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6d是噬菌体筛选出的抗体qp10851086对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6e是噬菌体筛选出的抗体qp10911092对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6f是噬菌体筛选出的抗体qp10991100对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6g是噬菌体筛选出的抗体qp11031104对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图6h是噬菌体筛选出的抗体qp11051106对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图7a是噬菌体筛选出的抗体qp11071108对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图7b是噬菌体筛选出的抗体qp11091110对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图7c是噬菌体筛选出的抗体qp11111112对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图7d是噬菌体筛选出的抗体qp11131114对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图7e是噬菌体筛选出的抗体qp11151116对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图7f是噬菌体筛选出的抗体qp11171118对不同293t瞬转细胞株的结合能力。图8a是对照抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中,对照组imab362的曲线。图8b是抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中qp190191的曲线。图8c是抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中qp192193的曲线。图8d是抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中qp201202的曲线。图8e是抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中qp207208的曲线。图8f是抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中qp11091110的曲线。图8g是抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中qp11131114的曲线。图8h是抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验中qp11151116的曲线。图9是抗体对胃癌pdx模型ga0006的药效试验。图10a是pbs组(阴性对照)处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10b是qp192193组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10c是qp207208组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10d是qp11151116组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10e是对照抗体imab362组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图11是加入本发明各抗体及对照抗体各组小鼠肿瘤d31重量。图12是各实验组的肿瘤体积实拍图。图13是各组小鼠的体重曲线。图14是各组小鼠的体重变化率曲线。具体实施方式以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。本发明的抗体，包括但不限于人源抗体。本发明中所提供的各种抗体的筛选方法，通常优先采用较为便利的杂交瘤筛选抗体，然而这个靶点的抗原(claudin18.2)较难获得，因此也同时采用了噬菌体库筛选抗体。本实施方式中筛选得到的抗claudin18.2的抗体序列如下所示：杂交瘤筛选的抗体，重链可变区(vh)cdr如序列中带下划线的部分所示>qp189qvqlqqsgaelvkpgasvklsckasgytftsyginwvrqrpeqglewigwlfpgdgtikynenfkgkatlttdrsssaaymqlsrltsedsavyfcarggyygnamdywgqgtsvtvss>qp191evklvesggglvkpggslklscaasgftfsnyamswvrqtpekrlewvasiisggrtyyldsekgrftisrdnarnnlylqmsslrsedtamyyctriyygnsfdywgqgttltvss>qd193qvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiypgngdttyngkfkgqatltadkssstvymqlssltsedsavyfcarfvkgnamdywgqgtsvtvss>qd198qvqlkesgpglvapsqslsitctvsgfsltiygvhwvrqppgrglewlgviwaggstnynsalmsrlsiskdnsksqvflkvnslqtddtamyycardyyygsgfdywgqgttltvss>qd200dvqlvesggglvqpggsrklscaasgftfssfgmhwvrqapekglewvayissgsnsiyyvdtvkgrftisrdnpkntlflqmtslksedtamyycarnayygnsfdywgqgttltvss>qd202evqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytftnyfvhwvkqkpgqglewigyinpynddtkynekfkgkatltsdkssstaymdlssltsedsavyyclslrffaywgqgtlvtvsa>qd208evqlqqsgpelvkpgasvkmsckasgytftsyimhwvkqkpgqglewigyinpyndgtkynekfkgkatltsdkssstvymelssltsedsavyccarlgfttrnamdywgqgtsvtvss轻链序列：其中，轻链可变区(vl)cdr如序列中带下划线的部分所示。>qd188divmtqspssltvtagekvtmsckssqsllnsgnqksyltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtdftltissvqaedlavyfcqndyfypytfgggtkleik>qd190divmtqspssqtvtagekvtmsckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtdftltisnmqaedlavyycqndysypftfgsgtkleik>qd192divmtqspssltvtagekvtmsckssqsllnsgnqknyltwyqqnpgqppkmliywastresgvpdrftgsgsgidfsltissvqaedlalyycqnaysypftfgsgtkleik>qd196divmtqspsslsvsagekvtmsckssqsllnsgnqknylawyqqkpgqppklliygastresgvpdrftgsgsgtdftltissvraedlavyycqndhyypftfgsgtkleik>qd199divmtqspssltvtagekvtmsckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqppklliywastresgvpdrftgsgsgtvftltissvqaedlavyfcqnnyyypltfgagtklelk>qd201divmtqspssltvtagekvtmsckssqsllnsgnqknyltwyqqkpgqapklliywastresgvpdrfigsgsgtdftltishvqaedlavyfcqndysypltfgagtnlelk>qd207divmtqspsslsvsagekvtmnckssqsllnsgnqknylawyqqkpgqppklliygastresgvpdrftgsgsgtdftltissvqaedlavyycqndhsypftfgsgtkleik噬菌体库筛选的抗体，重链可变区(vh)cdr如序列中带下划线的部分所示>qd1045qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycardyaftgfdywgqgtlvtvss>qd1047qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycarssaygtysmdywgqgtlvtvss>qd1073qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtgvyycargsgswfgpyfdywgqgttvtvss>qd1079qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycartdgatpfdywgqgttvtvss>qd1085qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarrsyygtgafdywgqgttvtvss>qd1091qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarslgyfsglafdywgqgttvtvss>qd1097qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycargynwsfgmdywgqgttvtvss>qd1099qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycaragyfprsldywgqgttvtvss>qd1103qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycargyswywlfgfdywgqgttvtvss>qd1105qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgqglewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarggdwggymdywgqgttvtvss>qd1107evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardyyyyfwfdywgqgtlvtvss>qd1109evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardyyyyywfdywgqgtlvtvss>qd1111evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakgyyyyfwfdywgqgtlvtvss>qd1113evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaksaayyyfwfdywgqgtlvtvss>qd1115evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardsyyyyfwydywgqgtlvtvss>qd1117evqllesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakaidyytfdywgqgtlvtvss轻链序列：其中，轻链可变区(vl)cdr如序列中带下划线的部分所示。>qd1046divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalmtptfgqgtkveik>qd1048divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqdlwprtfgqgtkveik>qd1074divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqaaqsptfgqgtkveik>qd1080divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalntpptfgqgtkveik>qd1086divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvtdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalmtptfgqgtkveik>qd1092divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqgrqfptfgqgtkveik>qd1098divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqglntftfgqgtkveik>qd1100divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqwdtfgqgtkveik>qd1104divmtqsplslpvtpgepasiscrssqsllhsngynyldwylqkpgqspqlliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqalqtgtfgqgtkveik>qd1106divmtqspdslavslgeratinckssqsvlyssnnknylawyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqyyttpftfgqgtkveik>qd1108diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsystfgqgtkveik>qd1110diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqyssysptfgqgtkveik>qd1112diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgtkftltisslqpddfatyycqqystypltfgqgtkveik>qd1114diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqylsypptfgqgtkveik>qd1116diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsypltfgqgtkveik>qd1118diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqystypltfgqgtkvevk抗体结合能力实验：实验一：facs检测抗体对肿瘤细胞系结合能力a)1.96孔板铺细胞，每孔2×105个细胞，1000×rpm离心5分钟，1×pbs细胞清洗一次，吸去上清多余液体；b)加入3％bsa-pbs溶液封闭细胞，4℃封闭60分钟；c)封闭液稀释待测抗体至5ug/ml，加入到孔中，4℃孵育60分钟；d)吸去抗体，每孔220ul1×pbs细胞清洗三次；e)每孔加入50ulpe-anti-humanfc(1：200稀释)二抗，4℃避光孵育40分钟；f)吸去抗体，每孔1×pbs细胞清洗四次；g)上机检测。实验二：facs检测抗体对pdx组织肿瘤细胞结合能力a)每个瘤子准备一个gentlemacstmctube和3ml消化液，消化液按照tumordissociationkit(miltenyibiotech，130-096-730)说明书配制，现配现用；b)处死小鼠，用洁净工具取瘤，1×pbs清洗后去除附着在肿瘤表面的血管、脂肪、筋膜等组织。每根消化管可消化不大于0.8g的肿瘤组织，以保证肿瘤组织被消化液完全消化；c)将肿瘤组织置于6孔板的孔中，加入消化液，用洁净镊子和解剖刀将肿瘤组织切割为约1mm3小块；d)将组织块放入gentlemacstmctube，使用残留消化液清洗孔板并一起转移至消化管中，放置于冰面上；e)将消化管倒置放入gentlemacs全自动组织处理器，选择程序37_c_m_tdk_1进行消化。程序结束后，取下消化管，300×g瞬时离心收集细胞和剩余组织；f)弃上清，用1×pbs重悬细胞和组织，将细胞悬液加至细胞过滤网上，置于50ml离心管中，用10mlpbs使悬液过筛网成为单细胞悬液；g)300×g离心5分钟，去上清，5mlpbs重悬，细胞计数并调整细胞浓度至每份样品1×106个细胞；h)每份样品加入100ul浓度为1μg/mlmousebdfcblock(cat#553141)pbs溶液重悬细胞，加入20ulhumanfcrblockingreagent，混匀，室温避光孵育10分钟；i)加入5ug/ml一抗，4℃避光孵育60分钟；j)加入2mlfacswashbuffer，轻柔重悬细胞，300×g离心5分钟，去上清，重复2次；k)加入100ul含pe标记的humaniggfc二抗和染料的facswashbuffer避光孵育细胞60分钟；l)加入2mlfacswashbuffer，轻柔重悬细胞，300×g离心5分钟，去上清，重复2次；m)200ulfacswashbuffer重悬细胞，上机检测。实验附图中hybridomacloneinchossystem和phagecloneinchossystem即分别指杂交瘤和噬菌体筛选出的抗体对chos细胞的结合能力。图中的cho18.2：chos-cldn18.2稳转细胞，cho18.1：chos-cldn18.1稳转细胞，chos：chos转染空载体。chos是仓鼠卵巢细胞永生化得到的细胞系，使用facs(流式细胞荧光分选技术)来检测抗体对细胞系结合能力。图1a到图1h显示了杂交瘤筛选出的抗体对chos细胞的结合能力。图2a到图2f，图3a到图3f以及图4a到图4d显示了噬菌体筛选出的抗体对chos细胞的结合能力。实验目的：在chos细胞系中验证抗体与claudin18.1(非特异性结合)和claudin18.2的结合能力。在chos细胞系的附图中，每一个panel由一种待测抗体对3种chos细胞系的facs检测结果组合而成，其中：1.红色曲线③，表明待测抗体对转染空载体的chos细胞系(chos)的结合能力，即阴性对照；2.蓝色曲线②，表明待测抗体对转染claudin18.1的chos细胞系(cho18.1)的结合能力，即检测非特异性结合；3.黄色曲线①，表明待测抗体对转染claudin18.2的chos细胞系(cho18.2)的结合能力，即检测目的蛋白结合能力。图5a到图5h，显示了杂交瘤筛选出的抗体对293t细胞的结合能力。图6a到图6h以及图7a到图7f显示了噬菌体筛选出的抗体对chos细胞的结合能力。图中，293t-qd012：293t-cldn18.1瞬转细胞293t-qd010：293t-cldn18.2瞬转细胞实验目的：在293-t细胞系中验证抗体与claudin18.1(非特异性结合)和claudin18.2的结合能力。293t-qd210:293t-cldn18.2-18.1ecd1瞬转细胞；cldn18.2的第1个胞外结构域更换为18.1的第1个胞外结构域293t-qd211:293t-cldn18.1-18.2ecd1瞬转细胞；cldn18.1的第1个胞外结构域更换为18.2的第1个胞外结构域实验目的：在293-t细胞系中验证抗体结合区域是claudin18.2的exon-1编码的结构域。hybridomclonein293t及phageclonein293t同理分别指杂交瘤和噬菌体筛选出的抗体对不同293t瞬转细胞株的结合能力。在293t中实验目的与在cho细胞系中相同，各个曲线及其代表的涵义解释如下。1.红色曲线⑤，表明待测抗体对瞬转空载体的293t细胞系的结合能力，即阴性对照；2.蓝色曲线④，表明待测抗体对瞬转claudin18.2的293t细胞系(293t-qd010)的结合，检测目的蛋白结合能力；3.橙色曲线③，表明待测抗体对瞬转claudin18.1的293t细胞系(293t-qd012)的结合，检测非特异性结合；4.深绿曲线②，表明待测抗体对瞬转claudin18.1-18.2ecd1(cldn18.1的第1个胞外结构域更换为18.2的第1个胞外结构域，后者是设计抗体结合位点所在区域)的293t细胞系(293t-qd211)的结合，验证抗体结合位点所在结构域；5.浅绿曲线①，表明待测抗体对瞬转claudin18.2-18.1ecd1(cldn18.2的第1个胞外结构域更换为18.1的第1个胞外结构域，前者是设计抗体结合位点所在区域)的293t细胞系(293t-qd210)的结合，验证该结构域对抗体结合的必要性。图8a到图8h显示了抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合能力实验。表1：抗体与胃癌pdx模型ga0006肿瘤细胞结合比例以上实验结果表明，本发明所提供的抗体，与蛋白的结合能力更好，并且非特异性结合的情况较低。在其它的实施方式中，本发明还提供一种编码如上所述的抗体的多核苷酸，这些编码本发明所提供的抗体的多核苷酸，当是以dna的形式提供时，其可以包含在后续的转录和编辑过程中会被去除的非编码序列，也可以只包含编码与本发明实施例中所提供的抗体相对应的序列以及在进行蛋白表达时所必须的序列。本发明还提供一种包含上述任意一项所述的抗体的药物组合物，本发明所提供的药物组合物，可以仅包含实施方式中所提供抗体中的任意一种或者至少两种的组合物。本领域的技术人员应当清楚的是，对于药物组合物，还包含药物上可接受的赋形剂，利用制成粉剂或者片剂等其它剂型所需要的常规赋形剂均应当作为制药过程中所应当添加的成分。本发明还提供一种检测生物样品中是否存在cldn的方法，其特征在于，包括：给予生物样品如上述任意一项所述的抗体的步骤，其中所述抗体具有可检测标志物，以及检测是否存在所述可检测标志物，或者检测所述可检测标志物含量的步骤。动物药效试验a)从胃癌异种移植模型ga0006荷瘤小鼠收取肿瘤组织，切成直径为2-3mm的瘤块接种于balb/c裸小鼠右前肩胛处皮下；b)当balb/c裸小鼠平均肿瘤体积到达约100mm3时，将小鼠随机分组，每组6只。称量所有动物的体重，并用游标卡尺测量肿瘤体积。根据肿瘤体积，采用随机分组方法进行分组，保证不同组别间的肿瘤体积相似。各组内的肿瘤体积的变异系数(cv)用公式cv＝sd/mtv×100％计算，应小于40％。随机分组使用studydirectortm完成。分组当天为d0，并于当天开始给药。详细的给药方法、给药剂量和给药途径见下表。表2：动物药效试验的给药参数组别动物数给药组剂量(mg/kg)给药方式给药周期16vehiclecontrol--i.p.biw×4周26qp19219310i.p.biw×4周36qp20720810i.p.biw×4周46qp1115111610i.p.biw×4周56imab36210i.p.biw×4周给药体积为10μl/g.表1和表2中的抗体编号的含义，例如qp190191，表示一条重链和一条轻链的组合。c)开始给药后，每周测量两次小鼠体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)＝1/2×(a×b2)(其中a表示长径，b表示短径)。当最后一次给药后一星期终止实验，处死小鼠，取瘤称重、拍照。选用以下分析方法进行数据分析：相对肿瘤增殖率，t/c(％)，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。计算公式为：t/c％＝trtv/crtv×100％(trtv：治疗组平均rtv；crtv：对照组平均rtv；rtv＝vt/v0，v0为分组时该动物的瘤体积，vt为治疗后该动物的瘤体积)；相对肿瘤抑制率，tgi(％)，计算公式为：tgi％＝(1-t/c)×100％(t和c分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(rtv))。pbs对照组小鼠在给药后第31天平均肿瘤体积为911.16±177.81mm3。抗体分子qp192193(10mg/kg)、qp207208(10mg/kg)、和qp11151116(10mg/kg)组在给药后第31天平均肿瘤体积分别为580.97±67.97mm3、680.28±193.50mm3、和722.38±118.07mm3，tgi分别为36.34％、25.34％、和20.72％，对照分子imab362(10mg/kg)在给药后第31天平均肿瘤体积为661.28±104.49mm3，tgi为27.42％(见下表)。三个筛选出的分子均在一定程度上抑制了肿瘤的生长，虽然没有统计学显著性差异，但qp192193表现优于对照分子imab362的趋势，qp207208和qp11151116也表现出与imab362相同水平的抑制肿瘤生长能力。而且小鼠体重在给药过程中没有发生明显下降，说明抗体分子对小鼠没有明显毒副作用。肿瘤重量的分析结果与肿瘤体积的结果相似。pbs对照组小鼠在给药后第31天平均肿瘤重量为722.57±176.32mg，抗体分子qp192193、qp207208、和qp11151116治疗组在结束给药后第31天平均肿瘤重量分别为455.5±46.42mg、391.93±111.15mg和432.03±66.25mg，tgi分别为36.96％、45.76％和40.21％；对照分子imab362治疗组在给药后第31天平均肿瘤重量为435.78±91mg，tgi为39.69％。(见下表)因此通过pdx动物药效试验，我们发现筛选出的抗体分子抗体分子具有比对照分子imab362更优或相同水平的体内抑制肿瘤能力。实验结果如图9至图14所示，其中，抗体对胃癌pdx模型ga0006的药效试验的结果如图9所示。图10a是pbs组(阴性对照)处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10b是qp192193组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10c是qp207208组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10d是qp11151116组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图10e是对照抗体imab362组处理在分组后的肿瘤生长曲线。图11是加入本发明各抗体及对照抗体各组小鼠肿瘤d31重量。图12是各实验组的肿瘤体积实拍图。图13是各组小鼠的体重曲线。图14是各组小鼠的体重变化率曲线。从实验结果中可见，发明的抗体比imab362在体内动物药效中表现出更好的抑制肿瘤生长的效果。序列表<110>jsp11902614<120>抗cldn抗体及其药物组合物和检测方法<130>jsp11902614<160>46<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>119<212>prt<213>artificial<400>1glnvalglnleuglnglnserglyalagluleuvallysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530glyileasntrpvalargglnargprogluglnglyleuglutrpile354045glytrpleupheproglyaspglythrilelystyrasngluasnphe505560lysglylysalathrleuthrthraspargserserseralaalatyr65707580metglnleuserargleuthrsergluaspseralavaltyrphecys859095alaargglyglytyrtyrglyasnalametasptyrtrpglyglngly100105110thrservalthrvalserser115<210>2<211>117<212>prt<213>artificial<400>2gluvallysleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserasntyr202530alametsertrpvalargglnthrproglulysargleuglutrpval354045alaserileileserglyglyargthrtyrtyrleuaspserglulys505560glyargphethrileserargaspasnalaargasnasnleutyrleu65707580glnmetserserleuargsergluaspthralamettyrtyrcysthr859095argiletyrtyrglyasnserpheasptyrtrpglyglnglythrthr100105110leuthrvalserser115<210>3<211>118<212>prt<213>artificial<400>3glnvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyser151015servallysilesercyslysalaserglytyralaphesersertyr202530trpmetasntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glyglniletyrproglyasnglyaspthrthrtyrasnglylysphe505560lysglyglnalathrleuthralaasplysserserserthrvaltyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys859095alaargphevallysglyasnalametasptyrtrpglyglnglythr100105110servalthrvalserser115<210>4<211>118<212>prt<213>artificial<400>4glnvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyser151015servallysilesercyslysalaserglytyralaphesersertyr202530trpmetasntrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glyglniletyrproglyasnglyaspthrthrtyrasnglylysphe505560lysglyglnalathrleuthralaasplysserserserthrvaltyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrphecys859095alaargphevallysglyasnalametasptyrtrpglyglnglythr100105110servalthrvalserser115<210>5<211>119<212>prt<213>artificial<400>5aspvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serarglysleusercysalaalaserglyphethrpheserserphe202530glymethistrpvalargglnalaproglulysglyleuglutrpval354045alatyrileserserglyserasnseriletyrtyrvalaspthrval505560lysglyargphethrileserargaspasnprolysasnthrleuphe65707580leuglnmetthrserleulyssergluaspthralamettyrtyrcys859095alaargasnalatyrtyrglyasnserpheasptyrtrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserser115<210>6<211>115<212>prt<213>artificial<400>6gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530phevalhistrpvallysglnlysproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrileasnprotyrasnaspaspthrlystyrasnglulysphe505560lysglylysalathrleuthrserasplysserserserthralatyr65707580metaspleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095leuserleuargphephealatyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valserala115<210>7<211>120<212>prt<213>artificial<400>7gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530ilemethistrpvallysglnlysproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrasnglulysphe505560lysglylysalathrleuthrserasplysserserserthrvaltyr65707580metgluleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrcyscys859095alaargleuglyphethrthrargasnalametasptyrtrpglygln100105110glythrservalthrvalserser115120<210>8<211>113<212>prt<213>artificial<400>8aspilevalmetthrglnserproserserleuthrvalthralagly151015glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleuasnser202530glyasnglnlyssertyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserservalglnalagluaspleualavaltyrphecysglnasn859095asptyrphetyrprotyrthrpheglyglyglythrlysleugluile100105110lys<210>9<211>113<212>prt<213>artificial<400>9aspilevalmetthrglnserproserserglnthrvalthralagly151015glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleuasnser202530glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrglnglnlysproglygln354045proprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrleuthr65707580ileserasnmetglnalagluaspleualavaltyrtyrcysglnasn859095asptyrsertyrprophethrpheglyserglythrlysleugluile100105110lys<210>10<211>113<212>prt<213>artificial<400>10aspilevalmetthrglnserproserserleuthrvalthralagly151015glulysvalthrmetsercyslysserserglnserleuleuasnser202530glyasnglnlysasntyrleuthrtrptyrg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