携带ES/CD基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备与应用的制作方法

本发明涉及一种携带es/cd基因和spio-peg-bsab、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备方法，与其在肝癌诊断和治疗中的应用。

(二)

背景技术：

肝细胞癌(hcc)是世界上第5大常见恶性肿瘤，为我国第3大常见恶性肿瘤。虽然手术治疗已取得了显著的疗效，但是，由于hcc发现时多为中晚期，手术切除率低，晚期患者即使行肝移植远期预后也欠佳。包括经肝动脉化疗栓塞术(tace)、射频消融(radiofrequencyablation,fra)在内的多种介入微创治疗方法已被广泛应用于临床，但5年生存率仍较低。

以基因治疗为代表的生物靶向治疗为近年迅速发展起来的最有希望取得突破性进展的肿瘤治疗方法，在肝癌基因治疗方面，也取得了令人鼓舞的结果。其中胞嘧啶脱氨酶(cd)基因是研究较多的一种自杀基因，它可以通过表达胞嘧啶脱氨酶使无毒性的前药5-氟胞嘧啶(5-fc)转变为有毒性的5-氟尿嘧啶(5-fu)直接杀伤瘤细胞。另一方面，抗血管生成(anti-angiogenesis)治疗已成为肿瘤治疗的重要手段，由于大多数hcc肿瘤血管较为丰富，抗肿瘤血管生成治疗对于肝癌尤为重要。内皮抑素(endostatin)是目前发现的抗血管生成活性最强的血管生成抑制因子之一，对肿瘤新生血管内皮细胞增殖的抑制作用特别强烈。应用endostatin基因治疗肝癌也显示了令人振奋的结果。由于内皮抑素对肿瘤细胞无明显杀伤作用，因此，如能构建含cd基因和内皮抑素基因的融合基因则理论上既能直接杀伤肿瘤细胞，又能抑制肿瘤血管生成，应能取得更好疗效，更具临床价值。

1997年asahara首次从人外周血中分离出了内皮祖细胞(ndothelialprogenitorcell，epc)，成人的脐血、胎肝、胎脾、外周血和骨髓均存有epc。大量研究显示epc在肝癌等各种肿瘤血管新生中起重要作用，利用epc向肿瘤血管迁移的特性，以epc为载体，把各种治疗基因特异性地导入肿瘤部位，可以有效地抑制肿瘤生长。wei等把转染酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的epc注入肺癌转移小鼠尾静脉，显示小鼠生存期明显延长。epc携带cd40配体可以进入肺转移瘤刺激肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素-γ的分泌，增加细胞凋亡蛋白酶-3/7的活性而抑制肿瘤。本申请团队前期研究结果也证明转染了内皮抑素基因的epc能向肝癌组织归巢并能抑制肿瘤血管生成。所有以上研究均表明：epc可以作为基因治疗的载体治疗肿瘤，而且具有许多优点：(1)靶基因可在体外转导，避免人体直接暴露于病毒质粒；(2)比较容易得到自体epc，可重复使用，避免排斥反应，还可避免伦理学矛盾；(3)在体内通过整合epc到增殖的血管网而使转导基因有扩增的可能，使治疗效应放大；(4)可以通过静脉输入，比较方便。

目前细胞移植术业已进入临床应用，迫切需要对细胞进行活体追踪和监测。目前的活体细胞示踪方法中，mr由于分辨率高，应用前景看好。在应用mr进行细胞群示踪前，需要细胞体外标记示踪剂。超顺磁性氧化铁(superparamageticironoxide，spio)类纳米粒子是目前较理想的磁共振示踪剂。研究者在多种器官损伤及疾病动物模型上，采用mr示踪spio标记的各种干细胞均取得成功。这一细胞标记示踪技术也已在临床上初步显示了其安全性和有效性。

arbab等用mri成功地活体示踪了标记spio的epc在肿瘤血管形成中的表达。本研究团队也已完成了间充质干细胞(msc)、epc的spio标记及活体示踪，采用mr成像观察到了归巢至损伤血管内皮的epc，采用spio标记了内皮抑素基因修饰的epc，建立了肝癌动物模型进行了相关研究。

基于以上理论和研究背景，并根据前期研究工作基础及发现的科学问题，本发明拟构建内皮抑素和自杀基因的融合基因重组慢病毒含es/cd基因的重组慢病毒，体外转染epc，然后以在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁(fe3o4)表面进行peg修饰，从而引入anti-afp和anti-cd34抗体形成复合物spio-peg-bsab，再以spio-peg-bsab标记含es/cd基因的重组慢病毒-epc，将该epc移植入肝癌小鼠体内，利用anti-afp的免疫导向作用及epc的肿瘤归巢性双重介导使epc高效迁移到肝癌组织，发挥融合基因抑制肿瘤血管生成及直接杀伤肿瘤细胞的双重作用；同时采用磁共振(mr)成像活体监测epc向肝癌组织的归巢过程。这将有可能为肝癌及其它恶性肿瘤的免疫导向epc抗肿瘤基因治疗提供新思路和新途径。

(三)

技术实现要素：

为解决肝癌分子靶向显像和治疗的问题，本发明提供了一种一种携带es/cd基因和spio-peg-bsab、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备方法，与其在肝癌诊断和治疗中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种携带es/cd基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针，由如下方法获得：

(1)合成内皮抑素(endostatin)和自杀基因(cd)的融合基因重组慢病毒，将该慢病毒转染内皮祖细胞(epc)，形成es/cd-epc；

(2)在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁表面进行peg修饰，并引入anti-afp和anti-cd34抗体，形成复合物spio-peg-bsab；

(3)步骤(1)es/cd-epc和步骤(2)spio-peg-bsab结合，得到spio-peg-bsab-es/cd-epc，即所述靶向探针。

所述内皮抑素基因序列如seqidno.1所示，所述自杀基因序列如seqidno.2所示。

seqidno.1(552bp，无atg，无tag)：

catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtctggaggcatgcgtggtatccgtggagcagatttccagtgcttccagcaagcccgagccgtggggctgtcgggcaccttccgggctttcctgtcctctaggctgcaggatctctatagcatcgtgcgccgtgctgaccgggggtctgtgcccatcgtcaacctgaaggacgaggtgctatctcccagctgggactccctgttttctggctcccagggtcaactgcaacccggggcccgcatcttttcttttgacggcagagatgtcctgagacacccagcctggccgcagaagagcgtatggcacggctcggaccccagtgggcggaggctgatggagagttactgtgagacatggcgaactgaaactactggggctacaggtcaggcctcctccctgctgtcaggcaggctcctggaacagaaagctgcgagctgccacaacagctacatcgtcctgtgcattgagaatagcttcatgacctctttctccaaa。

seqidno.2：

atgtcgaataacgctttacaaacaattattaacgcccggttaccaggcgaagaggggctgtggcagattcatctgcaggacggaaaaatcagcgccattgatgcgcaatccggcgtgatgcccataactgaaaacagcctggatgccgaacaaggtttagttataccgccgtttgtggagccacatattcacctggacaccacgcaaaccgccggacaaccgaactggaatcagtccggcacgctgtttgaaggcattgaacgctgggccgagcgcaaagcgttattaacccatgacgatgtgaaacaacgcgcatggcaaacgctgaaatggcagattgccaacggcattcagcatgtgcgtacccatgtcgatgtttcggatgcaacgctaactgcgctgaaagcaatgctggaagtgaagcaggaagtcgcgccgtggattgatctgcaaatcgtcgccttccctcaggaagggattttgtcgtatcccaacggtgaagcgttgctggaagaggcgttacgcttaggggcagatgtagtgggggcgattccgcattttgaatttacccgtgaatacggcgtggagtcgctgcataaaaccttcgccctggcgcaaaaatacgaccgtctcatcgacgttcactgtgatgagatcgatgacgagcagtcgcgctttgtcgaaaccgttgctgccctggcgcaccatgaaggcatgggcgcgcgagtcaccgccagccacaccacggcaatgcactcctataacggggcgtatacctcacgcctgttccgcttgctgaaaatgtccggtattaactttgtcgccaacccgctggtcaatattcatctgcaaggacgtttcgatacgtatccaaaacgtcgcggcatcacgcgcgttaaagagatgctggagtccggcattaacgtctgctttggtcacgatgatgtcttcgatccgtggtatccgctgggaacggcgaatatgctgcaagtgctgcatatggggctgcatgtttgccagttgatgggctacgggcagattaacgatggcctgaatttaatcacccaccacagcgcaaggacgttgaatttgcaggattacggcattgccgccggaaacagcgccaacctgattatcctgccggctgaaaatgggtttgatgcgctgcgccgtcaggttccggtacgttattcggtacgtggcggcaaggtgattgccagcacacaaccggcacaaaccaccgtatatctggagcagccagaagccatcgattacaaacgttga(tga为终止密码子)

本发明首先合成内皮抑素(endostatin)和自杀基因(cd)的融合基因重组慢病毒，将该慢病毒转染内皮祖细胞(epc)，形成es/cd-epc。再与前期合成的磁性纳米探针spio-peg-bsab(在超顺磁性纳米颗粒四氧化三铁(fe3o4)表面进行peg修饰，从而引入anti-afp和anti-cd34抗体形成复合物spio-peg-bsab结合形成spio-peg-bsab-es/cd-epc，即本发明靶向探针。利用免疫介导和epc归巢性介导spio-peg-bsab-es/cd-epc进入肝癌组织，抑制肿瘤血管生成和直接杀伤肿瘤细胞，同时mr成像可以活体动态示踪spio-peg-bsab-es/cd-epc，实现评价靶向治疗肝癌疗效的重要作用。

本发明还涉及制备所述靶向探针的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)用pcr方法得到atg+es+t2a+cd+taa目的基因片段，克隆到载体lv5中，连接产物转化至大肠杆菌获感受态细胞，筛选阳性克隆，进行慢病毒包装，获得es/cd-epc；所述内皮抑素基因序列如seqidno.1所示，所述自杀基因序列如seqidno.2所示；

(2)对油酸修饰的超顺磁性fe3o4纳米颗粒进行peg修饰，再在表面引入anti-afp和anti-cd34抗体，形成复合物spio-peg-bsab；

(3)步骤(1)es/cd-epc和步骤(2)spio-peg-bsab结合，得到spio-peg-bsab-es/cd-epc，即所述靶向探针。

本发明还涉及所述靶向探针在制备肝癌诊断试剂中的应用。具体的，所述靶向探针用于mr成像。

本发明还涉及所述靶向探针在制备肝癌治疗药物中的应用。具体的，所述药物为抑制肿瘤血管生成的药物。或者，所述药物为直接杀伤肿瘤细胞的药物。

本发明的有益效果主要体现在：本发明靶向探针epc具有肿瘤归巢性，其携带es/cd基因和spio-peg-bsab可同时靶向肝癌细胞和肿瘤血管，起到诊断加治疗的双重目的，为肿瘤基因治疗提供了一种崭新的活体监测手段，具备临床应用性和现实的治疗意义。

(四)附图说明

图1为es/cd融合基因的构建流程图。

图2lv5质粒图谱；

图3为重组质粒双酶切验证结果；1：lv5-atg+es+t2a+cd+taa重组质粒noti和bamhi双酶切；2：markerfermentassm0331；3：markerfermentassm0331。

图4为各moi不同toi病毒侵染情况(注：图片100×)；

图5为超顺磁纳米fe3o4颗粒扫描电镜照片。

图6为spio-peg-bsab的扫描电镜图片。

图7为spio-peg-bsab的动态光散射图。

图8为spio-peg-bsab的zeta电位图。

图9为不同浓度的spio-bsab-es/cd-epc浓度的mr分析(t2)。

图10为mri检测各组肿瘤模型。

图11为普鲁士蓝染色检测肝脏组织铁纳米。

图12为透射电子显微镜检测肝脏组织铁元素和细胞状态，黑色箭头指向铁纳米。

图13为westernblot检测es蛋白的表达。g1：对照组，g2：hepg2，g3：hepg2+epc，g4：hepg2+spio-bsab-epc，g5：hepg2+es/cd，g6：hepg2+es/cd-epc，g7：hepg2+spio-bsab-es/cd-epc。

图14为qrt-pcr检测es基因转录水平。

图15为he染色检测肝组织病变情况。

图16为tunel染色检测肝组织细胞凋亡情况。

图17为免疫组化染色检测肝组织flk-1表达情况。

图18为免疫组化染色检测肝组织vegf表达情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：spio-peg-bsab-es/cd-epc的制备

1.内皮祖细胞的体外诱导培养和鉴定

1.1内皮祖细胞的分离培养：

采集大鼠外周血，密度梯度离心，收集单个核细胞，种植于包被纤维连结素的培养瓶，培养于egm-2-mv(lonza，美国)中，4d后换液，弃未贴壁细胞，加入新鲜egm-2-mv培养基继续培养，之后每4天换液一次，待细胞铺满培养瓶底，0.25％胰蛋白酶消化后进行传代培养。

1.2流式细胞仪检测：细胞cd133，cd34，cd31，flk-1的表达情况

用流式细胞仪对epc的特异性表面标志物进行鉴定，结果显示：cd34、cd133、cd31和flk-1阳性率分别为：(99.35±0.19)％、(90.97±1.35)％、(97.06±0.75)％和(90.09±1.20)％；cd34和cd133双阳性率为(90.32±1.18)％，cd31/flk1双阳性率为(87.16±0.96)％。

1.3细胞荧光染色检测：dil-acldl，fitc-uea-1功能

epc培养7天后，激光共聚焦显微镜下epc的dil-ac-ldl和fitc-uea-1双染色鉴定，结果显示双荧光阳性的细胞(即正在分化的epc)在细胞总数所占比例为(90.99±2.41)％。

2.es/cd融合基因的构建及细胞转染

2.1主要试剂

表1：主要实验试剂

2.2主要仪器

表2：主要实验仪器

2.3实验方法

2.3.1细胞培养

epc细胞，常规培养使用含10％fbs的dmem培养基(hyclone)(含1.5mml-glutamine，100u/mlpenicillin，100μg/mlstreptomycin)，于37℃5％co2饱和湿度培养箱中培养。

2.3.2针对基因endostatin/cd的慢病毒过表达载体构建和慢病毒包装

2.3.2.1构建流程图

构建流程图参见图1，质粒图谱参见图2。

2.3.2.2实验过程

2.3.2.2.1用pcr方法得到atg+es+t2a+cd+taa序列片段

1)在genbank上查询小鼠es基因和cd序列，对序列进行分析，检查基因内部有无特别复杂二级结构和重复序列连接。根据基因序列分析的结果，分别进行单链oligo的设计及合成，单链oligo序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。

2)引物设计，引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。

3)目的基因上下游引物分别加上lv5载体上noti和bamhi两侧同源序列，用于载体的亚克隆，引物序列如下：

4)利用pcr将合成的oligo(由上海吉玛制药技术有限公司合成的一系列短核苷酸序列片段，用于合成atg+es+t2a+cd+taa)重叠拼接成完整的基因序列，将oligo溶解成50μm，将oligo分别取相同体积至1.5ml离心管，混合均匀，配成oligomix。

5)用配制好的oligomix进行第一轮pcr反应，pcr体系如下：

循环条件：

6)用b2693n-1和b2693n-88进行第二轮pcr反应，模板为第一轮pcr反应的产物。pcr体系如下：

反应条件与第一轮相同。第一轮pcr可得到混有目的基因条带的非单一条带pcr产物混合物，再用第一轮的pcr产物为模板，通过第二轮pcr则可获得单一的目的基因条带。

7)pcr反应完成后，利用agarose电泳并切胶回收atg+es+t2a+cd+taa基因片段。

2.3.2.2.2目的基因atg+es+t2a+cd+taa克隆到载体lv5中

1)用noti和bamhi对lv5进行酶切，37℃酶切2h，酶切体系如下：

2)电泳，用dna凝胶回收试剂盒回收载体lv5。

3)利用entryonestepcloningkit，将扩增回收好的片段，重组克隆到线性化的lv5载体中，反应体系如下：

4)使用移液器上下吹打数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min。

2.3.2.2.3感受态细胞的制备(氯化钙法)：

1)从于37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个大肠杆菌单菌落，转到一个含有100mllb培养基的1l烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h(旋转摇床，300rpm)。

2)在无菌条件下将菌液转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。

3)于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

4)倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽。

5)用10ml预冷的0.1mol/lcacl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

6)于4℃，以4000离心10min，回收细胞。

7)倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽。

8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/lcacl2(含20％甘油)重悬每份细胞沉淀。

9)将细胞分装成小份(100μl/支)，放于-70℃冻存。

2.3.2.2.4连接产物的转化

1)从-70℃中取出感受态细胞，将装有感受态细胞的离心管冰上放置4min，待感受态细胞解冻后，加入10μl连接产物，轻轻混匀内容物，在冰中放置30min。

2)将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90s，不要摇动离心管。

3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3min。

4)向每支离心管加入800μllb培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250rpm，培育45min使细菌复苏。

5)取200μl培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mlampicillinlb平板上。

6)等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16h。

2.3.2.2.5阳性克隆的鉴定与测序

1)从平板上挑取克隆菌落，小抽质粒并做鉴定挑出阳性克隆。从每块平板上挑取4个单菌落，接种到含50μg/mlampicillin的lb培养基中，37℃250rpm振荡培养16h。

2)将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒抽提质粒。

3)将抽提好的质粒进行双酶切鉴定，每管反应体系如下：

4)酶切37℃1h后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。

5)取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液用甘油保存。

6)将测序结果与目的基因序列进行比对，确认无误后用保存的甘油菌液接菌lb培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒。

2.3.2.2.6慢病毒包装

1)取细胞状态良好，处于对数生长期的293t细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿5×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％co2的培养箱中培养过夜；

2)第二天转染前去除旧的培养液，加入5ml新鲜的含10％fbs的dmem培养液；制备dna-lipofectamine2000复合物，以一个10cm培养皿的用量为示范：

①准备一支无菌的5ml离心管，先加入1.5ml无血清i培养液，再加入plv/helper-sl3、plv/helper-sl4、plv/helper-sl5、目的质粒(各4μg)，轻轻颠倒混匀；

②准备另外一支无菌的5ml离心管里，加入1.5ml无血清i培养液和40μl的lipofectamine2000，轻轻颠倒混匀。室温孵育5min；

③5min后，将已稀释dna加入到含有lipofectamine2000的无血清i培养液，轻轻颠倒混匀。室温孵育20min；

3)将dna-lipofectamine2000复合物一滴一滴地添加到293t细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置37℃、5％co2饱和湿度培养箱中过夜培养；

4)转染后一天，更换10ml含10％fbs的dmem培养液。放置37℃、5％co2饱和湿度培养箱中继续培养；

5)转染后48小时收集培养上清进行浓缩；加入10ml新鲜的培养液继续培养，转染后72h再次收集浓缩：

①3000rpm低速离心15min，上清用0.45μm滤器进行过滤，以彻底去除细胞碎片；

②每个ut离心管装20ml滤液，50000g高速离心90min沉淀病毒颗粒，弃去上清；

③每管沉淀用200μl培养液重悬病毒沉淀，分装进2个0.5ml进口axygen管中，每管100μl。

6)分装好的病毒放置-80℃保存。

2.3.2.2.7病毒侵染效率检测

1)epc细胞在6cmdish中培养至80～90％融合时，倾去培养液，用3mlpbs洗涤细胞2次。

2)加1mltrypsin-edtasolution,混匀后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3min。

3)在加入2ml含10％fbs的dmem培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。

4)血球计数板计数，将细胞稀释至1×10⁵细胞/ml。取100μl上述细胞稀释液加入96孔板，混匀后于37℃5％co2培养24h。

5)将慢病毒原液100μl分别用含10％fbs的dmem培液稀释4个梯度，使终moi值分别为5、25、50、100。

6)吸去96孔板中的培养液，每孔加入上述已稀释的100μl病毒液，，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene。同时设立空白对照组，于37℃5％co2培养24h。

7)吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入含10％fbs的dmem培液，于37℃5％co2继续培养至48、72、96h，观测慢病毒侵染结果。

2.4实验结果及分析

2.4.1载体构建与验证结果

连接有目的基因片段atg+es+t2a+cd+taa的lv5-atg+es+t2a+cd+taa重组质粒提取后，noti和bamhi双酶切鉴定，核酸电泳图片参见图3。电泳结果显示，酶切产物小片段大小介于2000bp与2500bp之间，与atg+es+t2a+cd+taa片段理论大小2028bp相符。

选取阳性克隆，质粒送测序，测序结果与理论序列比对，结果显示峰形单一，序列正确，载体构建成功。

2.4.2病毒青染效率检测

结果参见图4和表3，可见，50pfu/cell侵染细胞时，随着时间点的推移，侵染效率逐渐提高；而以100pfu/cell侵染细胞时，从96h起，细胞侵染效率基本可达80％以上。

表3：不同moi/toi侵染效率统计

3.双重靶向磁性纳米颗粒的制备

3.1.超顺磁性纳米颗粒(spio)的制备(高温热解法)

将2mmol乙酰丙酮铁(fe(acac)3)加入200ml斜三口烧瓶中，继续向瓶中加入20ml的二苄醚，先后加入油酸(6mmol)和油胺(6mmol)。在氮气氛围保护下，将混合物加热至200℃，并在该温度下反应60min，之后再升温至280℃，在该温度下反应30min。中断加热并冷却至室温后，加入乙醇40ml磁分离洗涤，重复多次以去除体系中残留的二苄醚、油酸和油胺，最后将制备出油酸修饰的磁性fe3o4纳米颗粒，将其保存于正己烷溶液中，其扫描电镜图片参见图5，粒径大小约为10nm，粒径均匀，形态成球形或椭球形。

3.2.peg化spio的合成

将dspe-peg2000(50mg)溶于氯仿(5ml)，再将已制备的分散于正己烷的spio与dspe-peg2000以1：2的质量比(铁含量：dspe-peg2000)混合于50ml圆底烧瓶，并于70℃下超声仪超声混匀10分钟，再缓慢加入去离子水5ml，置于旋转蒸发仪下于70℃水浴作用20min，通过疏水作用，颗粒表面修饰的油酸烷基链上包裹了单层具有较好水溶性的磷脂分子，从而获得水溶性的材料。待反应体系冷却至室温后，经超声处理20min使颗粒分散均匀，再将其多次离心去除多余磷脂胶束，将上层黑色透明的peg化sipo的溶液保存于4℃环境中。peg化spio的动态光散射图显示其水动力尺寸为16.57nm，zeta电位检测为-21.4mv。

3.3.利用dspe-peg2000修饰spio并交联双抗anti-cd34&anti-afp

通过30kd超滤管将抗体缓冲液替换为ph8.5的0.02m硼酸盐缓冲液。两种抗体各取1mg，分别加入到30kd超滤管中，3500rpm，8min离心3次，每次加入1ml硼酸盐缓冲液吹打均匀，减少抗体损失。最终将两种抗体混合并定容到5ml。取3mgpeg化纳米颗粒(1mg/ml)，用ph计调ph至5-6。然后加入1mgedc分子，0.5mgnhs分子，于恒温摇床反应25min(25℃，180rpm)。活化结束后采用30kd超滤管去除edc/nhs，3000rpm，5min离心2次。用预处理好的抗体溶液重悬peg化纳米颗粒，然后置于摇床反应结合2h。反应结束后，利用分子筛分离未反应的抗体，制备得到肝癌双重靶向磁性纳米颗粒spio-peg-bsab。本实施例制备得到的spio-peg-bsab的扫描电镜图片参见图6，动态光散射图参见图7，从图7可以看出水动力尺寸为25.6nm，说明纳米颗粒表面成功连接了抗体，从而使水动力尺寸变大，增大的尺寸与igg抗体的水动力尺寸相近，从pdi(单分散系数)数据可知颗粒分散性良好，可排除由于纳米颗粒聚集导致尺寸变大的可能性。spio-peg-bsab的zeta电位图参见图8，zeta电位为-40.7mv。

4.es/cd-epc和spio-peg-bsab结合制备spio-peg-bsab-es/cd-epc

取制备好的spio-bsab100ng分别与1×10⁶个epc悬液进行混合(共孵育法)，在4℃下孵育1h，冷pbs洗涤，合成spio-peg-bsab-es/cd-epc。

实施例2：spio-bsab-es/cd-epc治疗肝癌的作用机制研究

1.肝癌模型构建

1.1瘤块的获取(5只)

取对数生长期的hepg2细胞(细胞数2×10⁶/只)接种至5周龄的balb/c雄性裸鼠(5只)右侧颈背部皮下。经7d-10d成瘤后，可触及到瘤体，将瘤块取出，分割成1mm³大小。

1.2移植瘤肝癌模型建立

1.4实验分组(5只)

将5周龄balb/c雄性裸鼠麻醉，于左上腹做长约1cm横切口，暴露肝脏，将已切割好的人源肝癌组织块植入，缝合固定于肝叶实质中。缝合伤口后，于spf级饲养。

1.5肿瘤生长检测—活体荧光检测

于建模后不同时间点(0、7、14、21、28d)，体内检测肝癌细胞荧光强度，观察测量肝脏组织中肿瘤的大小。

确定移植瘤在裸鼠内的生长情况，确定荧光检测能够清晰检测到移植瘤的时间t1。

2.spio-bsab-es/cd-epc治疗肝癌的作用机制研究

2.1实验分组(7组×6只)

取对数生长期的hepg2细胞(细胞数2×10⁶/只)接种至5周龄的balb/c雄性裸鼠(10只)右侧颈背部皮下。经7d-10d成瘤后，可触及到瘤体，将瘤块取出，分割成1mm³大小。

将5周龄balb/c雄性裸鼠(40只)麻醉，于左上腹做长约1cm横切口，暴露肝脏，将已切割好的人源肝癌组织块植入，缝合固定于肝叶实质中。缝合伤口后，于spf级饲养。饲养t1后，使用活体荧光观察法(40只×1个时间点)进行肝脏组织肿瘤大小检测。

根据观察结果筛选出构建成功的严重程度一致的肝癌模型小鼠36只，分成以下几组。

i组：正常对照组(n＝6)；

ii组：小鼠肝癌模型+注射生理盐水(n＝6)(尾静脉注入)；

iii组：小鼠肝癌模型+移植epc(n＝6)(尾静脉注入，1×10⁶cells/只)；

iv组：小鼠肝癌模型+移植spio-bsab-epc(n＝6)(尾静脉注入，1×10⁶cells/只)；

v组：小鼠肝癌模型+es/cd慢病毒(n＝6)(尾静脉注入，10⁸tu/ml)；

vi组：小鼠肝癌模型+移植es/cd-epc(n＝6)(尾静脉注入，1×10⁶cells/只)；

vii组：小鼠肝癌模型+移植spio-bsab-es/cd-epc(n＝6)(尾静脉注入，1×10⁶cells/只)。

v组、vi组、vii组进行5-fc(500mg/kg/d)处理，每日腹腔注射。

2.2.1.spio-bsab标记epc细胞悬液体外mri扫描

图9为spio-bsab标记epc细胞悬液体外mri扫描图。结果显示，标记spio-bsab的内皮祖细胞比未标记的内皮祖细胞信号更具有高度敏感性，且随细胞数量增多呈上升趋势(上排为未标记的对照epc，从左到右细胞数依次为10⁴-10⁷)。

2.2.2对大鼠肝癌模型进行spio-bsab标记es/cd-epc的体内移植，并进行mr动态示踪成像及组织学检测

t1时间点，2.2.2中7d或14d或21d肿瘤有变化但不明显时间点，以及肿瘤变化最明显时间点，这三个时间点分别取2只变化明显的小鼠进行mr检测。结果参见图10，mri检测各组肿瘤模型提示：移植spio-bsab标记es/cd-epc的小鼠肿瘤活性明显降低。

2.2.3普鲁士蓝染色检测肝脏组织铁纳米

取肝脏组织，观察铁颗粒，simplepci图像分析系统软件计数阳性细胞。结果参见图11，与未加spio组比较，hepg2+spio-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的铁纳米明显增加。

2.2.4透射电子显微镜检测肝脏组织铁元素和细胞状态

结果见图12，从图可以看出，与未加spio组比较，hepg2+spio-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的铁纳米明显增加。

2.2.5westernblot检测es蛋白的表达

取肝脏组织，测定es的蛋白含量，以gapdh为内参。结果见图13，结果提示：hepg2+spio-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的es表达高于hepg2+es/cd-epc组和hepg2+es/cd组。这表明spio-bsab具有靶向癌细胞作用。2.2.6qrt-pcr检测es基因转录水平

取肝脏组织，测定es的转录水平，以gapdh为内参。结果见图14，从图中可以看出，hepg2+spio-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的es转录水平高于hepg2+es/cd-epc组和hepg2+es/cd组。这表明spio-bsab具有靶向癌细胞作用。

2.2.7he染色检测肝组织病变情况

he观察肝脏组织的病理情况，包括肝组织的结构以及肿瘤组织的变化。图15为he染色检测肝组织病变情况。结果显示：control组肝组织正常，可见肝小叶，无病变。hepg2组明显的肝癌组织形态。hepg2+epc组和hepg2+spio-bsab-epc组肝癌细胞明显增加。hepg2+es/cd组、hepg2+es/cd-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的肝癌细胞明显减少，其中效果最好的是hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组。这表明spio-bsab具有靶向癌细胞作用，es/cd具有杀伤肝癌细胞的作用。

2.2.8tunel染色检测肝组织细胞凋亡情况

图16为tunel染色检测肝组织细胞凋亡情况。结果显示：control组肝组织细胞凋亡较少。hepg2组有少许细胞凋亡。hepg2+epc组和hepg2+spio-bsab-epc组细胞凋亡数较hepg2组少。hepg2+es/cd组、hepg2+es/cd-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的细胞凋亡增加，其中凋亡最多的组是hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组。这表明spio-bsab具有靶向癌细胞作用，es/cd具有杀伤肝癌细胞的作用。

2.2.9免疫组化染色检测肝组织flk-1表达情况

图17为免疫组化染色检测肝组织flk-1表达情况，结果显示：control组肝组织flk-1表达较低。hepg2组flk-1表达较高。hepg2+epc组和hepg2+spio-bsab-epc组flk-1表达较hepg2组高。hepg2+es/cd组、hepg2+es/cd-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的flk-1表达较低，其中hepg2+es/c组flk-1表达最低。这表明spio-bsab具有靶向癌细胞作用，epc促进flk-1的表达。

2.2.10免疫组化染色检测肝组织vegf表达情况

图18为免疫组化染色检测肝组织vegf表达情况。结果显示：control组肝组织vegf表达较低。hepg2组vegf表达较高。hepg2+epc组和hepg2+spio-bsab-epc组vegf表达较hepg2组高。hepg2+es/cd组、hepg2+es/cd-epc组、hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组的vegf表达较低，其中hepg2+spio-bsab-es/cd-epc组vegf表达最低。这表明spio-bsab具有靶向癌细胞作用，epc促进vegf表达。

序列表

<110>浙江大学

<120>携带es/cd基因、具有肿瘤归巢性的靶向探针及其制备与应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>552

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catactcatcaggactttcagccagtgctccacctggtggcactgaacacccccctgtct60

ggaggcatgcgtggtatccgtggagcagatttccagtgcttccagcaagcccgagccgtg120

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