一种与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记BanII-1及其应用的制作方法

本发明涉及分子标记及其应用，具体涉及一种与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记及其应用。
背景技术：
：分子标记辅助选择(mas)是一种快速、简便对目标性状进行筛选的方法。可以在淡季进行，没有环境限制，允许同时筛选几个性状。在mas中，与目标性状紧密连锁的分子标记在植物中定位。然后通过杂交将目标基因区段引入供体植物中，在回交期间，利用分子标记锚定目标基因，直到目标基因稳定遗传在最终的植物品种中。白粉病是甜瓜生产中影响其产量品质的主要真菌性病害之一，在甜瓜的露地栽培、保护地栽培中广泛发生，白粉病菌通过释放分生孢子，侵染植物的叶片、花和果实。孢子萌发产生吸器，在吸器上生长分生孢子梗，进而继续产生分生孢子。因而白粉病发病、传播速度极快，叶片感染之后首先产生白色的病斑，在植株生长后期变黄萎蔫。白粉病的发生使甜瓜生长势衰弱，影响甜瓜由营养生长向生殖生长转化，最终在生长后期导致植株死亡，使得甜瓜的产量和品质下降，严重影响甜瓜的品质和产量。单囊壳白粉菌是中国主要的甜瓜白粉病病原菌，但不同甜瓜材料对不同生理小种的病原菌抗性不同。因此通过分子标记辅助选择的方法高效的选育抗白粉病的甜瓜品种是当前甜瓜育种工作的主要部分。但存在以下技术难题：首先,甜瓜抗白粉病材料较少，且白粉病生理小种区分不明。其次,目前已公布的大多数分子标记很难与相关性状紧密结合,因此能用于对甜瓜白粉病抗性进行基因定位和分子标记辅助选择的分子标记少之又少。技术实现要素：基于上述现有情况，本发明提供了一种与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记banii-1及其应用，用以对抗单囊壳白粉菌2f生理小种和不抗单囊壳白粉菌2f生理小种的甜瓜植株进行分子标记辅助选择。首先，本发明提供了一种与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记banii-1，其分子标记引物，正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示，反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示。第二，本发明提供了上述与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记banii-1的应用，包括以下步骤：(1)提取待测甜瓜植株基因组；(2)以步骤(1)所得基因组为模板，利用分子标记引物进行pcr扩增反应，获得pcr产物；(3)对步骤(2)所得的pcr产物进行酶切，得酶切产物；(4)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)所得的酶切产物进行鉴定，根据鉴定所得酶切产物片段大小判定待测甜瓜植株为甜瓜抗单囊壳白粉菌2f生理小种或甜瓜不抗单囊壳白粉菌2f生理小种。步骤(2)所述分子标记引物，正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示,反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示。步骤(2)所述pcr产物，大小为720bp，核苷酸序列如seqidno.3或seqidno.4所示。步骤(3)所述酶切，酶为banii限制性内切酶。步骤(2)所述pcr扩增反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。步骤(4)所述判定方法具体为：当酶切产物片段为一种片段，且大小为720bp时，判定待测植株为甜瓜抗单囊壳白粉菌2f生理小种；当酶切产物片段为两种以上片段，且大小包括307bp和413bp时，判定待测植株为甜瓜不抗单囊壳白粉菌2f生理小种。步骤(2)所述pcr反应体系为：试剂体积(μl)taq酶0.2dntps0.3buffer(10x)2正向引物1反向引物1dna模板2去离子水13.5步骤(3)所述酶切，酶切体系为：上述酶切体系37℃水浴酶切过夜。有益效果本发明根据高通量测序所得到的甜瓜基因组数据,设计并开发了与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记。所开发分子标记在不同材料中具有通用性,操作简便结果明确。通过分子标记辅助选择的方法,在甜瓜的幼苗期即可对甜瓜白粉病抗性进行辅助选择,大大提高了育种效率缩短育种年限。可以用于今后甜瓜抗白粉病分子标记辅助选择,并加快育种工作效率。本发明获得的分子标记,在不同的白粉病抗性的甜瓜材料中可以进行很好的区分,通过对该基因进行精细定位可知,该标记与甜瓜白粉病抗性基因紧密连锁,因此,本发明获得了一个可以高效区分不同甜瓜是否抗甜瓜单囊壳白粉菌2f生理小种的分子标记。附图说明图1为利用分子标记banii-1引物对m4-125、x055、f1及f2代群体基因组进行pcr扩增的产物电泳情况，(1，d2000matker；2-31分别为m4-125、x055、其杂交所获得的f1植株及部分f2植株的dna通过分子标记banii-1引物进行pcr扩增反应获得的产物片段(720bp))。图2为分子标记banii-1引物扩增m4-125、x055、f1及f2代群体基因组所得pcr扩增产物的酶切产物电泳情况(1，d2000matker；2-4分别为m4-125、x055及其杂交所获得的f1植株的dna通过分子标记banii-1引物进行pcr扩增后所得pcr产物进行酶切后的片段，2号泳道片段大小720bp，3号泳道片段大小307bp和413bp，4号泳道片段大小为720bp、413bp和307bp各一条)；5-14号泳道，f2代中抗病植株的酶切产物；15-31号泳道，f2代中感病植株的酶切产物。marker为d2000marker，条带大小从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。图3为利用分子标记banii-1引物对10份材料基因组进行pcr扩增的产物电泳情况；(1、d2000marker；2、pi124112；3、wmr29；4、edisto47；5、pmr5；6、mr-1；7、x055；8、m1-101；9、m1-7；10、龙甜1号；11、铁把青；marker为d2000marker，条带大小从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)图4为分子标记banii-1引物扩增10份材料基因组所得pcr扩增产物的酶切产物电泳情况；(1、d2000marker；2、pi124112；3、wmr29；4、edisto47；5、pmr5；6、mr-1；7、x055；8、m1-101；9、m1-7；10、东甜1001；11、东甜1002；marker为d2000marker，条带大小从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)具体实施方式实施例1分子标记banii-1的筛选、引物设计及应用(验证)：选用免疫白粉病甜瓜品系m4-125及高感白粉病甜瓜品系x055及其杂交获得的f1、f2代群体为实验材料验证标记鉴定甜瓜是否抗白粉病。利用高通量测序技术对m4-125和x055两个甜瓜品系及f2群体中高抗白粉病植株及高感白粉病植株进行测序,并通ncbi网站获取甜瓜基因组序列,通过该序列与测序材料的比对,得到了存在甜瓜白粉病抗性基因的区段的序列的染色体区间,在该区间内,挖掘测序数据存在snp突变位点的碱基区段,分析位点的酶切信息,获得存在caps突变的序列,利用primer软件在存在位点的序列上设计分子标记banii-1的caps引物。引物长度在18-25bp,退火温度为50-60℃,gc含量为40％-60％。分子标记banii-1的正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示,反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示,pcr产物片段大小为720bp,核苷酸序列分别如seqidno.3、seqidno.4所示。具体如表1所示表1用于pcr反应的分子标记banii-1的引物名称、序列及预期片段大小上述与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记banii-1的应用，包括以下步骤：(1)采集m4-125、x055及其二者杂交获得的f1代、f2代植株的幼嫩真叶,利用改良的ctab法提取基因组；(2)以步骤(1)所得基因组为模板，利用分子标记banii-1的引物进行pcr扩增反应，获得pcr产物；pcr反应体系为：正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示,反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示；pcr扩增反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；利用琼脂糖凝胶电泳对所获得的pcr产物进行检测,检测结果如图1所示,m4-125、x055、f1以及f2单株均扩增出一条大小为的片段,与预期的片段大小一致(720bp)。(3)对步骤(2)所得的pcr产物进行酶切，得酶切产物；按照neb的限制性内切酶操作指南用限制性核酸内切酶,对所获得的pcr产物进行酶切验证,酶切反应体系：试剂体积(μl)pcr产物5banii限制性内切酶0.3cutsmartbuffer1.5去离子水8.2以上体系37℃水浴酶切过夜。(4)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)所得的酶切产物进行鉴定，检测结果如图2所示。由于m4-125存在酶切位点,被banii切开并获得了307、413的片段。f1代表现出共显性特征既包含x055的一条720bp长度的片段,又包含307bp及413bp长度的片段。在供试的28株f2代单株中,有10株为一条带,其余株为两条带或者三条带，判定方法具体为：当酶切产物片段为一种片段，且大小为720bp时，判定待测植株为甜瓜抗单囊壳白粉菌2f生理小种；当酶切产物片段为两种片段，且大小分别为307bp和413bp时，判定待测植株为甜瓜不抗单囊壳白粉菌2f生理小种。验证：根据上述判定方法判定为甜瓜抗单囊壳白粉菌2f生理小种的植株，实际均为甜瓜抗单囊壳白粉菌2f生理小种；根据上述判定方法判定为甜瓜不抗单囊壳白粉菌2f生理小种的植株，实际均为不甜瓜抗单囊壳白粉菌2f生理小种，证明上述育种判定方法准确有效。实施例2分子标记banii-1的扩大范围应用(验证)：利用所获得的分子标记banii-1对不同白粉病(单囊壳白粉菌2f生理小种)抗性的甜瓜品种进行种质资源的筛选：为鉴别所开发的分子标记banii-1对其它甜瓜材料的适用性,选取包括m4-125和x055在内的10种不同白粉病(单囊壳白粉菌2f生理小种)抗性的甜瓜材料,利用该分子标记引物对其基因组进行pcr扩增和酶切验证。这10种甜瓜材料的名称及抗性等描述如表2所示表210种甜瓜材料介绍分子标记banii-1的扩大范围应用：(1)采集上述10种甜瓜材料的幼嫩真叶,利用改良的ctab法提取基因组；(2)以步骤(1)所得基因组为模板，利用分子标记banii-1的引物进行pcr扩增反应，获得pcr产物；pcr反应体系为：正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示,反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示；pcr扩增反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；利用琼脂糖凝胶电泳对所获得的pcr产物进行检测,检测结果如图3所示,供试的10种材料均扩增出一条大小的条带,片段大小一致(720bp)。(4)对步骤(2)所得的pcr产物进行酶切，得酶切产物；按照neb的限制性内切酶操作指南用限制性核酸内切酶,对所获得的pcr产物进行酶切验证,酶切反应体系：试剂体积(μl)pcr产物5banii限制性内切酶0.3cutsmartbuffer1.5去离子水8.2以上体系37℃水浴酶切过夜。利用琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)所得的酶切产物进行鉴定，检测结果如图4所示。结合图4和表3可以看出1-5号供试材料酶切pcr产物均呈现出一条720bp大小的条带，判定为抗白粉病(单囊壳白粉菌2f生理小种),判定结果与实际一致；6-10号供试材料酶切pcr产物呈现出两条307bp和413bp大小的条带或者三条720bp、307bp和413bp大小的条带，判定为感白粉病即不抗白粉病(单囊壳白粉菌2f生理小种)，判定结果与实际一致。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明精神和范围内,都可以做各种的改动与修饰,因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>东北农业大学<120>一种与甜瓜白粉病抗性相关的分子标记banii-1及其应用<130><160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>正向引物<220><221>dna<222>(1)..(22)<400>1actcaacacaacaacacacaac22<210>2<211>21<212>dna<213>反向引物<220><221>dna<222>(1)..(21)<400>2gccgaatccttccacatagac21<210>3<211>720<212>dna<213>pcr产物序列1<220><221>dna<222>(1)..(720)<400>3actcaacacaacaacacacaacttaactaattattacgtaccctcttatttaatatttaa60tcactgatggttagcagtataattctgaaacggaatagagaagtgatcaataagtccagt120gaccggcgtggccaatctaggctcataagcaaacccatgtaaaacttcttccccaccgtg180gccgccaccgggggttcctatataaggacagggcggaacccattgccataatttcttagc240catatcatacaaaagcgcggctttatcccaacaccctctaatcaaaaccatcacaaattc300accatgggctacacattcaaacccacacgatttttccaattcctcaaattggacgtacaa360ctgttgcggcattctttgcatttcaatccacgtggttccacagctttggagcccccaaat420ccttaagctctttggggtgtttagtttgcttttttctaccgcagcgattaacagtaattt480cccttgactttccactaagtttggagaccgtaaaaaccgtctcattggagcttggatttt540ccaccaattgttgtgcgacatgtcgtacgctaggatgctgaatgggctgtagttcatgct600gtataatctgcctgccacgtgaaccattcggcttgattcgaaactgcagagacgtggcaa660tgtggacgtggtggcccacatggagtagaacccggtcgcgtctatgtggaaggattcggc720<210>4<211>720<212>dna<213>pcr产物序列2<220><221>dna<222>(1)..(720)<400>4actcaacacaacaacacacaacttaactaattattacgtaccctcttatttaatatttaa60tcactgatggttagcagtataattctgaaacggaatagagaagtgatcaataagtccagt120gaccggcgtggccaatctaggctcataagcaaacccatgtaaaacttcttccccaccgtg180gccgccaccgggggttcctatataaggacagggcggaacccattgccataatttcttagc240catatcatacaaaagcgcggctttatcccaacaccctctaatcaaaaccatcacaaattc300accatgggctacacattcaaacccacacgatttttccaattcctcaaattggacgtacaa360ctgttgcggcattctttgcatttcaatccacgtggttccacagctttggagtccccaaat420ccttaagctctttggggtgtttagtttgcttttttctaccgcagcgattaacagtaattt480cccttgactttccactaagtttggagaccgtaaaaaccgtctcattggagcttggatttt540ccaccaattgttgtgcgacatgtcgtacgctaggatgctgaatgggctgtagttcatgct600gtataatctgcctgccacgtgaaccattcggcttgattcgaaactgcagagacgtggcaa660tgtggacgtggtggcccacatggagtagaacccggtcgcgtctatgtggaaggattcggc720当前第1页12