一种包含tbFGF的新材料及其用途的制作方法

本发明涉及一种包含tbfgf的新材料及其用途。

背景技术：

许多抗肿瘤药物在临床应用中呈现出很多缺点，包括治疗效果差、剂量限制性毒性以及患者耐受性差等，其中由于药物分布性差导致对正常组织产生较大的毒性作用，促进了新的靶向给药制剂的发展。近期，基于纳米技术的靶向给药系统发展迅速，例如胶束、脂质体、固体脂质纳米粒广泛应用于癌症化疗中,起到改善药物溶解性，延长体内半衰期，增加药物在肿瘤组织和细胞中的分布，从而起到最佳的抗肿瘤效果和最小的毒副作用。

脂质体(liposomes)是由磷脂类物质与胆固醇类物质制得的具有双分子层结构的封闭囊泡(空心)，是一种人工膜，与皮肤细胞膜结构相同。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。

与游离药物相比，采用脂质体包裹药物可以起到一定的缓释作用，但是缓释效果仍然不尽如人意，并且，脂质体的粒径较大，不易被吸收，稳定性也不佳，需要进一步改进。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了新的材料，以及新材料修饰的脂质体，可以优化脂质体作为载体的性能。

首先，本发明提供了一种材料peg-ve，结构式如下式(i)所示：

其中，r¹为h或者c1～c10的烷基；n为1000～4000。

进一步地，所述式(i)中：r¹为h或者甲基；和/或，n为1000～2000。

本发明还提供了一种材料tbfgf-peg-ve，结构式如下式(ii)所示：

其中，表示多肽；n为1000～4000。

进一步地，所述多肽是tbfgf，其氨基酸序列为

krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferlesnnynty(seqidno.1)。

进一步地，式(ii)中的n为1000～2000。

本发明还提供了一种小粒径脂质体，它由peg-ve修饰脂质体得到，其中，脂质体是由磷脂类物质与胆固醇类物质制备而成的具有双分子层结构的封闭囊泡，peg-ve的ve端嵌入脂质体的双分子层结构中；所述peg-ve的结构式如下式(i)所示：

其中，r¹为h或者c1～c10的烷基；n为1000～4000。

进一步地，所述式(i)中：r¹为h或者甲基；和/或，n为1000～2000。

进一步地，所述磷脂类物质为大豆磷脂酰胆碱、卵磷脂、氢化大豆磷脂或二硬脂酰基磷脂酰胆碱；所述胆固醇类物质为胆固醇。

进一步地，peg-ve、磷脂类物质与胆固醇类物质的摩尔比为1：(3～15)：(3～15)，优选为1：8：8。

本发明还提供了一种缓释性能优良的脂质体，它由tbfgf-peg-ve修饰前述的小粒径脂质体得到，其中，tbfgf-peg-ve的ve端嵌入脂质体的双分子层结构中；所述tbfgf-peg-ve的结构式如下式(ii)所示：

其中，表示tbfgf，其氨基酸序列为

krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferlesnnynty；n为1000～4000。

进一步地，式(ii)中的n为1000～2000。

进一步地，所述tbfgf-peg-ve与小粒径脂质体的质量比为1～10：5～50，优选为2.4：10。

本发明还提供了前述材料在制备小粒径、高稳定性和/或具有缓释性能的脂质体中的用途。

本发明脂质体可以制成含药脂质体，含药脂质体它由药物与前述修饰后的脂质体组成。

本发明含药脂质体中的药物可以是任意药物。

优选地，所述药物置于脂质体的囊泡中，优选置于双分子层结构之间。

优选地，所述药物为抗肿瘤药物，优选为紫杉醇、多西紫杉醇(即多西他赛)。

优选地，所述含药脂质体按照如下方法制备：取peg-ve，药物、磷脂类物质、胆固醇类物质，加入有机溶剂溶解，得有机溶液，加入水中，混合，旋蒸，过滤，得peg-ve修饰的含药脂质体。

优选地，所述方法还包括如下步骤：取peg-ve修饰的含药脂质体，加入的tbfgf-peg-ve，溶解，混匀，孵育，得tbfgf-peg-ve修饰的含药脂质体。

本发明还提供了一种含药脂质体制剂，其特征在于：它是以前述的含药脂质体，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

优选地，所述辅料是冻干保护剂，优选为蔗糖、甘露醇、葡萄糖、麦芽糖。

本发明还提供了一种制备前述含药脂质体的方法，其特征在于：步骤如下：取peg-ve、药物、磷脂类物质、胆固醇类物质，按照脂质体制备方法制成peg-ve修饰的含药脂质体。

本发明脂质体制备方式可以是现有制备脂质体的任何方法。脂质体的制备方法有多种，根据药物的性质或需要进行选择。(1)薄膜分散法：系将磷脂等膜材溶于适量的氯仿或其它有机溶剂中，脂溶性药物可加在有机溶剂中，然后在减压旋转下除去溶剂，使脂质在器壁形成薄膜后，加入不含有或者含有水溶性药物的缓冲溶液或其他溶液，进行振摇，则可形成多层脂质体。(2)注入法：将磷脂等脂质材料和脂溶性药物溶于有机溶剂中(油相)，然后把油相均速注射到水相(含有或不含有水溶性药物)中，除尽有机溶剂得到脂质体的方法。根据溶剂的不同可分为乙醇或叔丁醇注入法和乙醚注入法等。(3)逆向蒸发法：系将磷脂等脂质材料溶于有机溶剂，如氯仿中，再按一定比例与含药的缓冲液混合、乳化，然后减压蒸去有机溶剂即可形成脂质体。该法适合于水溶性药物、大分子活性物质，如胰岛素等的脂质体制备，可提高包封率。这几种方法分散形成的脂质体为多室脂质体，可用超声法、匀化法和挤压法获得粒径小而均一的单室脂质体。

优选地，脂质体制备方式是：用有机溶剂溶解peg-ve、药物、磷脂类物质、胆固醇类物质，得有机溶液，加入水或者含糖水溶液中，混匀，旋蒸，过滤，得peg-ve修饰的含药脂质体。

优选地，所述有机溶剂为醇类溶剂，优选为乙醇；和/或，有机溶剂溶解peg-ve、药物、磷脂类物质、胆固醇类物质的方式是：和/或，将peg-ve、药物、磷脂类物质、胆固醇类物质加入有机溶剂中，加热溶解；和/或，所述混匀的方式是搅拌；所述过滤的方式是0.22μm滤膜。

优选地，还包括如下步骤：取peg-ve修饰的含药脂质体，加入的tbfgf-peg-ve，溶解，混匀，孵育，得tbfgf-peg-ve和peg-ve修饰的含药脂质体。

优选地，所述溶解是采用水或者含糖水溶液溶解；和/或，所述孵育是37℃水浴孵育30min。

本发明采用peg-ve以及tbfgf-peg-ve修饰脂质体，使得脂质体的性能得到了明显的提升，一方面降低了脂质体的粒径，使其容易被机体吸收，第二方面提高了脂质体的稳定性，另外还使得脂质体的缓释作用增强，与未经修饰的脂质体相比，本发明修饰后的脂质体的药物释放速度明显降低，有利于药物的吸收和利用；采用多西他赛作为药物进行了验证，本发明修饰后的脂质体的抗肿瘤作用明显优于未经修饰的脂质体，而且副作用降低，同时，本发明脂质体作为药物载体，可以减少肿瘤细胞的多药耐药性。临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1mpeg2000-ve的合成反应路线图。

图2cooh-peg2000-ve的合成反应路线图。

图3tbfgf与ve-peg2000-cooh胶束偶联过程示意图。

图4mpeg2000-ve的¹hnmr谱。

图5ve-peg2000-oh的¹hnmr谱。

图6ve-peg2000-cooh的¹hnmr谱。

图7ho-peg2000-oh(a)、mpeg2000-ve(b)、ho-peg2000-ve(c)和hooc-peg2000-ve(d)的红外吸收光谱图。

图8tbfgf-peg2000-ve的红外吸收光谱图。

图9ho-peg2000-oh(a)、mpeg2000-ve(b)、ho-peg2000-ve(c)和hooc-peg2000-ve(d)的dsc曲线图。

图10tbfgf与ve-peg2000-cooh偶联的sds-page凝胶电泳图(a)游离的tbfgf溶液(b)tbfgf与ve-peg2000-cooh的混合溶液(c)ve-peg2000-tbfgf溶液。

图11dtx-tbfgf-lps脂质体制备示意图。

图12dtx-peg-lps外观图片(a)dtx-peg-lps冻干粉(b)dtx-peg-lps冻干粉经复溶后的溶液。

图13多西他赛脂质体的粒径分布图(a)冻干前的dtx-peg-lps溶液(b)冻干后的dtx-peg-lps溶液(c)dtx-tbfgf-lps溶液)。

图14多西他赛脂质体透射电镜图(a)冻干后复溶的dtx-peg-lps溶液(b)dtx-tbfgf-lps溶液(标尺：100nm)。

图15多西他赛标准曲线图。

图16空白脂质体液相色谱图。

图17不同dtx脂质体的体外释放情况。

图18多西他赛对ll/2细胞生长抑制作用游离dtx和不同dtx脂质体对ll/2细胞作用48h(a)和72h(b)对细胞生长抑制率的影响。

图19多西他赛对b16细胞生长抑制作用游离dtx和不同dtx脂质体对b16细胞作用48h(a)和72h(b)对细胞生长抑制率的影响。

图20香豆素-6作用于b16细胞2h的荧光显微镜照片。

图21香豆素6处理2h后的b16细胞的流式细胞分析结果。

图22不同dtxlps治疗后的小鼠肿瘤外观照片。

图23不同多西他赛脂质体治疗过程中的小鼠体重变化。

图24不同多西他赛脂质体治疗过程中的肿瘤体积变化。

图25各组肿瘤组织的h&e染色结果。

图26各组正常组织的h&e染色结果(a)生理盐水组(b)空白脂质体组(c)freedtx(d)dtxlps(e)dtx-peg-lps(f)dtx-tbfgf-lps。

图27各组肿瘤组织的cd31染色结果。

图28各组肿瘤组织的mvd计数结果。

图29不同多西他赛脂质体治疗后的小鼠血清生化指标结果。

图30本发明脂质体对p-gp酶的抑制作用结果。

具体实施方式

实施例1本发明脂质体载体的构建(mpeg2000-ve与tbfgf-peg2000-ve的制备及表征)

1实验材料

1.1仪器

恒温加热磁力搅拌器：df-101s，郑州长城科工贸有限公司；

循环水式多用真空泵：shb-iii，郑州长城科工贸有限公司；

旋转蒸发仪：rotavapor：rii，瑞士buchi；

分析天平：auw120d，d＝0.1mg/0.01mg，日本岛津；

三用紫外仪：if-i型，上海顾村电光仪器厂；

超声破碎仪：vcx-500，超声探头：6mm，sonics公司；

核磁共振谱仪av-11，400mhz瑞士bruker；

真空干燥箱：vt6130m型，德国heraeus公司；

傅利叶红外光谱仪：nicolet6700美国热电公司；

dsc分析仪：q200日本精工公司；

超纯水机：milli-q，millipore公司；

冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；

垂直电泳仪：miniprotean2&3cell，bio-rad；

化学发光多功能检测仪(md5)：spectramax-m5，moleculardevice。

1.2试剂

聚乙二醇(peg2000)：购自sigma公司(美国)；

聚乙二醇单甲醚(mpeg2000)：购自sigma公司(美国)；

维生素e琥珀酸酯(α-tos)：购自sigma公司(美国)；

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)：成都科龙化工有限公司；

丁二酸酐：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

4-二甲氨基吡啶(dmap)：爱斯特(成都)医药技术有限公司；

硅胶h：化学纯，青岛海洋化工有限公司；

硅胶板：gf254，青岛海洋化工有限公司；

二氯甲烷：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

甲醇：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；

无水硫酸钠：化学纯，成都市科龙化工试剂厂；

人类碱性成纤维细胞生长因子的特异性片段(truncatedhumanbasicfibroblastgrowthfactorpeptide，tbfgf)：氨基酸序列为

krlycknggfflrihpdgrvdgvreksdphiklqlqaeergvvsikgvcanrylamkedgrllaskcvtdecffferlesnnynty，人工合成，由生物治疗国家重点实验室杨莉教授实验室制备；

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)：成都科龙化工有限公司；

氯化钠：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

磷酸二氢钠：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

磷酸氢二钠：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

三氯甲烷：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

十二烷基硫酸钠(sds)：分析纯，bio-rad公司；

丙烯酰胺(acrylamide)：分析纯，bio-rad公司；

甘氨酸(glycine)：分析纯，bio-rad公司；

temed(n,n,n',n'-四甲基乙二胺)：分析纯，bio-rad公司；

tris碱(trisbase)：分析纯，bio-rad公司；

过硫酸铵：分析纯，bio-rad公司；

亚甲双丙烯酰胺：分析纯，bio-rad公司；

考马斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)：分析纯，bio-rad公司。

2实验方法

2.1mpeg2000-ve的合成

为了便于制备peg化的脂质体，我们首先合成单甲醚聚乙二醇维生素e琥珀酸酯(mpeg2000-ve)，利用维生素e琥珀酸酯(α-tos)中的羧基与聚乙二醇单甲醚(mpeg2000-oh)的羟基在脱水剂edci和酰化催化剂dmap的作用下发生酯化反应，合成路线见图1。

具体方法如下：将α-tos(0.98g,2mmol)，mpeg2000-oh(6.0g,3mmol)，edci(0.83g,4mmol)和dmap(0.25g,2mmol)溶于50ml二氯甲烷，室温下搅拌反应24h；反应后依次经过0.1mhcl、饱和氯化钠和纯水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，再经过乙醚沉淀后，即得粗品，粗品用硅胶柱层析进一步纯化，采用甲醇与二氯甲烷体系进行梯度洗脱(甲醇比例：1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％，5％)，收集纯度较高的mpeg2000-ve，真空干燥，tlc检测纯度(展开剂：甲醇和二氯甲烷比例为1:8)，即得mpeg2000-ve。

2.2cooh-peg2000-ve的制备

tbfgf-peg2000-ve由tbfgf经氨基活化后与cooh-peg2000-ve偶联制备。由于一步反应法采用hooc-peg2000-cooh与α-tos直接反应后得到的产物与硅胶柱吸附性更强，更难实现分离，因此我们采用了两步反应法，首先通过ho-peg2000-oh与α-tos合成oh-peg2000-ve，然后羧基化得到cooh-peg2000-ve，反应路线见图2。

2.2.1oh-peg2000-ve的合成

将α-tos(0.98g,2mmol)，peg2000(6.0g,3mmol)，edci(0.83g,4mmol)和dmap(0.25g,2mmol)溶于50ml二氯甲烷中，室温下搅拌反应24h；产物用硅胶柱层析进一步纯化，采用甲醇与二氯甲烷体系进行梯度洗脱(甲醇比例：1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％，5％)，收集目的产物ve-peg2000-oh，用tlc分析(展开剂：甲醇-二氯甲烷比例为1:8)，检测为一个斑点，旋转蒸发除去溶剂，真空干燥，即得。

2.2.2cooh-peg2000-ve的合成

将ve-peg2000-oh(987mg,0.4mmol)，丁二酸酐(100mg,1mmol)和dmap(49mg,0.4mmol)溶于二氯甲烷ch2cl2(10ml)，再加入300μl三乙胺(tea)，加热47℃回流3h，直到用tlc分析(展开剂：二氯甲烷-甲醇比例为8：1)反应完全，冷却至室温，然后用0.1mhcl洗涤三次，除去dmap，依次用饱和氯化钠和纯水将有机相洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，真空干燥，即得。

2.3tbfgf与cooh-peg2000-ve的偶联

tbfgf-peg2000-ve由tbfgf经氨基活化后与cooh-peg2000-ve偶联制备,见图3。称取20mgve-peg2000-cooh，置于25ml茄形瓶中，加入5ml二氯甲烷溶解，室温下减压蒸发形成均匀薄膜，室温真空干燥6h，除去残留的有机溶剂。加入4mlmes(10mm)缓冲液(ph＝5.0)，40℃水浴条件下水化10min。加入40mgnhs和80mgedci，室温下搅拌30min，使羧基活化，过0.22μm的滤膜，用0.1m的naoh溶液调节ph至7.4，加入tbfgf(1mg/ml，1ml)，4℃轻微搅拌过夜。取出样品，置于预处理后的透析袋(8kda)中，以ph7.4的pbs缓冲液为外水相于4℃冰箱透析过夜，以除去nhs和edci，冷冻干燥，即得。

2.4核磁共振氢谱(¹hnmr)

各取mpeg2000-ve、oh-peg2000-ve和cooh-peg2000-ve适量分别溶于氘代氯仿(cdcl3)中，进行¹hnmr测定。

2.5傅利叶红外吸收光谱(ft-ir)

采用溴化钾压片法，在4000～500cm^-1波长范围内对ho-peg2000-oh、mpeg2000-ve、ho-peg2000-ve和hooc-peg2000-ve、tbfgf-peg2000-ve进行了红外光谱测定。

2.6差示扫描量热分析(dsc)

通过核磁和红外对化合物的结构进行了确认以后，我们将通过dsc分析仪对化合物的热性能和热稳定性进行进一步的比较分析，具体方法为：称取适量样品(ho-peg2000-oh、mpeg2000-ve、ho-peg2000-ve和hooc-peg2000-ve)5～10mg，温度扫描范围为-60℃～60℃，升温速率为10℃/min，氮气保护。

2.7蛋白定量

考马斯亮蓝法(bradford法)是目前灵敏度较高的蛋白质测定方法之一。考马斯亮蓝染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰由465nm变为595nm，在595nm处测定的吸光值与蛋白浓度成正比。分别将不同浓度的bsa溶液、tbfgf溶液(已知浓度200μg/ml)与tbfgf-peg2000-ve溶液(稀释至约150μg/ml)加入到考马斯亮蓝溶液中，用分光光度计在595nm波长下检测吸光值。根据bsa标准溶液(25μg/ml～250μg/ml)的吸光值做出标准曲线，从而计算样品浓度。

2.8sds-page电泳

为了考察反应后tbfgf与cooh-peg2000-ve的偶联情况，我们进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)实验，分别取25μl的样品(tbfgf溶液、tbfgf与cooh-peg2000-ve混合溶液以及tbfgf-peg2000-ve溶液)，加入6×loadingbuffer，每组样品蛋白上样量均为1μg，上样到12％的sds-page凝胶中。先用80mv的电压电泳15min，然后改用120mv的电压继续电泳35min。电泳完毕后，用0.25％的考马斯亮蓝染色，之后用脱色液脱色，观察蛋白条带。

3结果与讨论

3.1mpeg2000-ve的合成与¹hnmr

我们首先通过酯化反应合成了mpeg2000-ve，这步反应条件温和，且催化剂容易除去，经硅胶柱层析进一步纯化，产率为38.9％。产物mpeg2000-ve的¹hnmr谱如图4所示：

表征如下，4.27ppm的多重峰(a)属于mpeg2000末端的亚甲基峰，3.53～3.74ppm处的多重峰(b)为mpeg2000中的乙二醇单位的亚甲基峰，3.38ppm处的单峰(c)为mpeg2000中的甲基峰。处于2.55～2.95ppm处的多重峰(d)则属于维生素e琥珀酸酯(α-tos)中琥珀酸的亚甲基峰，1.94～2.08ppm处的多重峰(e)为(ve)苯环上甲基峰，1.07～1.38ppm处的多重峰(f)为ve侧链上的亚甲基峰，0.83ppm处的多重峰(g)为ve烃链上的甲基峰。(d)峰的峰面积与(b)峰的峰面积的比为1:56。¹hnmr谱表明mpeg2000-ve制备成功。

3.2cooh-peg2000-ve的合成与¹hnmr

其次，我们通过两步反应法制备了cooh-peg2000-ve，第一步通过酯化反应制备ho-peg2000-ve，得到的混合产物经过硅胶柱层析进行纯化，纯化后产品的¹hnmr谱如图5所示，产率为12.8％；而第二步反应为ho-peg2000-ve与丁二酸酐直接反应生成cooh-peg2000-ve，产率为82.67％，¹hnmr谱如图6。

由图5可知，4.27ppm的多重峰(a)属于聚乙二醇末端的亚甲基峰，3.64～3.71ppm处的多重峰(b)为聚乙二醇中的乙二醇单位的亚甲基峰。处于2.58ppm处的多重峰(c)则属于琥珀酰的亚甲基峰，1.97～2.08ppm处的多重峰(d)为维生素e苯环上甲基峰，1.23～1.29ppm处的多重峰(e)为维生素e侧链上的亚甲基峰，0.83ppm处的多重峰(f)为维生素e烃链上的甲基峰。从1hnmr谱中特征峰的峰面积计算，α-tos中丁二酸亚甲基峰的峰面积(c)与peg2000中乙二醇单位的亚甲基峰(b)峰面积的比约为1:56。

由图6可见，ve-peg2000-cooh的表征如下，4.27ppm的多重峰(a)属于聚乙二醇末端的亚甲基峰，3.64～3.71ppm处的多重峰(b)为聚乙二醇中的乙二醇单位的亚甲基峰。处于2.58ppm处的多重峰(c)则属于琥珀酰的亚甲基峰，其余0.83～2.08ppm处的多重峰为ve中的其它峰。从1hnmr谱中特征峰的峰面积计算，丁二酰亚甲基峰的峰面积(c)与peg2000中乙二醇单位的亚甲基峰(b)峰面积的比约为1:27，说明ve-peg2000-oh羧基化成功。

3.3tbfgf-peg2000-ve的制备

首先我们制备了cooh-peg2000-ve自组装胶束，然后将tbfgf的氨基端与cooh-peg2000-ve的羧基端偶联，在酸性条件下加入mes和edci使羧基活化，再调节ph至中性，利用酰胺化反应，得到tbfgf偶联的cooh-peg2000-ve胶束，最后通过透析的方法除去催化剂，同时由于tbfgf多肽稳定性较差，因此将透析后的溶液进行冷冻干燥，得到白色疏松状粉末，并于-20℃贮存备用。由于tbfgf与cooh-peg2000-ve的投料摩尔比低于1:1，只有部分cooh-peg2000-ve参与tbfgf偶联，因此为了便于表述，我们将此tbfgf偶联的cooh-peg2000-ve偶联物简称为tbfgf-peg2000-ve。

3.4红外光谱分析

通过傅利叶红外吸收光谱对peg2000及各产物进行了峰归属分析，如图7a，可见h-o特征峰3415.16，c-h的特征峰2882.75，c-o的特征峰1114.57；图7b除了h-o特征峰3430.80，c-h的特征峰2886.96，c-o的特征峰1114.67以外还可见c＝o的特征峰1739.50；图7c，除了h-o特征峰3482.43，c-h的特征峰2883.69，c-o的特征峰1112.56，还可见c＝o的特征峰1750.76和1736.13；图7dh-o特征峰3460.97，c-h的特征峰2883.93，c-o的特征峰1112.42，还可见c＝o的特征峰1735.65。

通过傅利叶红外吸收光谱对tbfgf-peg2000-ve进行了峰归属分析，如图8，可见o-h的特征峰3419.62和3339.88，c-h峰2919.48和2873.46，c-o的特征峰1108.40，n-h的特征峰1666.77和1625.35，c＝o峰1735.67。

3.5差示扫描量热分析

dsc曲线中向上的为吸热峰，由于晶体融化需要吸热，由图9可知各化合物(ho-peg2000-oh、mpeg2000-ve、ho-peg2000-ve和hooc-peg2000-ve)的熔点分别为(32.61℃、32.91℃、27.77℃和36.78℃)，ho-peg2000-ve熔点最低。各化合物在相变过程中热稳定性良好。

3.6蛋白定量

为了验证偶联过程是否使蛋白产生了降解等变化，我们首先采用考马斯亮蓝法对制得的tbfgf-peg2000-ve冻干粉进行了蛋白定量测定，结果见表1-1：

表1-1蛋白定量结果

*线性方程y＝0.0018x+0.3935标准偏差r2＝0.9934

由表可知，测得tbfgf溶液中蛋白浓度为201.26μg/ml，tbfgf-peg-ve样品溶液中蛋白浓度为298.70μg/ml，与加入的理论浓度300μg/ml相符，即tbfgf与ve-peg-cooh的质量比为5％。

3.7sds-page凝胶电泳

通过蛋白定量说明了制备过程未对蛋白含量造成影响，但是为了进一步验证tbfgf短肽是否与ve-peg2000-cooh偶联成功，我们进行了sds-page凝胶电泳实验。结果如图10，ve-peg2000-cooh与tbfgf的混合物的条带b的颜色比tbfgf标准品的条带a稍浅(图10)，是因为带正电荷的tbfgf与略带负电荷的ve-peg2000-cooh溶液通过静电吸引发生了一部分结合，但这种结合能力很弱；而样品c的tbfgf蛋白条带颜色则明显比样品a和b均浅，是由于胶束巨大的分子量，将无法在凝胶上移动，而全部堆积在样品槽里，由此说明大部分的tbfgf已经通过化学反应与ve-peg2000-cooh偶联。

4小结

我们除了利用单甲醚聚乙二醇(mpeg2000-oh)与维生素e琥珀酸酯(α-tos)反应成功地制备了mpeg2000-ve，过柱纯化后产率为38.9％，还用双羟基聚乙二醇(ho-peg2000-oh)与α-tos反应，先制备成ve-peg2000-oh，通过过柱纯化后产率为12.8％，然后ve-peg2000-oh直接与丁二酸酐反应，得到ve-peg2000-cooh，产率为82.67％。

经过¹hnmr进行鉴定，验证各产物结构正确。再通过ft-ir和dsc分析，进一步表明各化合物合成正确，纯度较好。由于短肽tbfgf对热不稳定，不能直接参与脂质体的制备过程，因此先将tbfgf与cooh-peg2000-ve进行偶联，制备tbfgf-peg2000-ve，便于间接插入脂质体双分子层中。通过蛋白定量，sds-page凝胶电泳以及红外吸收光谱分析对产物进行了定量和定性分析，验证连接成功。

实施例2本发明含药脂质体载体的制备及其效果验证构建

1实验材料

1.1仪器

旋转蒸发仪：rotavapor.rii，瑞士buchi；

循环水式多用真空泵：shb-iiis，郑州长城科工贸有限公司；

高压均质机：emulsiflex-05，美国avestin；

分析天平：auw120d,d＝0.1mg/0.01mg，日本岛津；

恒温加热磁力搅拌器：df-101s，巩义市予华仪器责任有限公司；

真空干燥箱：zkd-4025a，上海智城分析仪器制造有限公司；

纯水仪：milli-q，美国millipore；

冰箱：bcd539wh，海尔；

冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；

漩涡混合器：hq-60-ⅱ,北方同正；

纳米粒度仪：zetasizernanozs,英国马尔文公司；

ph计：delta320瑞士梅特勒-托利多；

透射电镜jem-100cx：日本电子公司(jeol)；

离心机sorvallst16：美国thermoscientific；

液相色谱仪：waters2695-2996，美国waters公司；

恒温摇床：thz-100，上海一恒科学仪器有限公司；

水相滤膜：0.22μm，美国millipore。

1.2试剂

多西他赛(dtx)：四川协力制药有限公司,纯度>98％；

大豆磷脂酰胆碱(94％)(s100)：德国lipoidgmbh；

胆固醇：德国merck；

mpeg2000-ve：实验室自制；

tbfgf-peg2000-ve：实验室自制；

聚乙二醇2000：sigma-aldrich；

吐温80：天津市瑞金特化学品有限公司；

无水乙醇：分析纯成都海兴化工试剂厂；

5％葡萄糖溶液：四川科伦药业股份有限公司；

氯化钠：天津市瑞金特化学品有限公司；

磷酸氢二钠：成都科龙化工试剂有限公司；

磷酸二氢钠：成都科龙化工试剂有限公司；

吐温-80：成都科龙化工试剂有限公司；

生理盐水：四川科伦药业股份有限公司；

甲醇：色谱纯天津市大茂化学试剂厂；

乙腈：色谱纯天津市大茂化学试剂厂；

超纯水：milli-q。

2实验方法

2.1多西他赛脂质体的制备

多西他赛(docetaxel,dtx)为第二代紫杉烷类半合成的新型抗肿瘤药物,目前已经成为激素难治性前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等的一线治疗药。由于多西他赛水溶性较差，我们选用它作为模型药物，采用乙醇注入法制备脂质体。

2.1.1dtx-lps和dtx-peg-lps的制备

首先制备多西他赛普通脂质体(dtx-lps)和多西他赛mpeg-ve脂质体(dtx-peg-lps)，按表1-2中处方量称取dtx、大豆磷脂酰胆碱(s100)、胆固醇(chol)、mpeg2000-ve，加入乙醇，50℃加热溶解，之后将蔗糖水溶液(蔗糖浓度为2～15％)加热至50℃，一边搅拌一边将乙醇溶液注入蔗糖水溶液中，注入后搅拌15min，旋转蒸发除去乙醇，纯水定容，过0.22μm滤膜，即得dtx-lps和dtx-peg-lps。同时按表1-2处方量制备不含多西他赛的空白脂质体(空白lps)，将制备好的脂质体溶液分装于西林瓶中，每瓶2ml，加入冻干保护剂甘氨酸，冷冻干燥，取出样品置于4℃冰箱避光贮存。

表1-2不同脂质体组成(mg)

2.1.2dtx-tbfgf-lps的制备

接下来制备含tbfgf-peg-ve的靶向多西他赛脂质体(dtx-tbfgf-lps)，由于前面已制备好的tbfgf-peg2000-ve冻干粉和dtx-peg-lps冻干粉，因此先将制备好的dtx-peg-lps冻干粉复溶至1mg/ml，取1ml复溶后的脂质体溶液，加入tbfgf-peg-ve冻干粉(含tbfgf0.24mg)，轻轻溶解混匀后，37℃水浴孵育30min，即得dtx-tbfgf-lps，现配现用。制备过程如图11。

2.2粒径和电位

采用动态激光散射法(dls)测定粒径和电位，将多西他赛脂质体溶液(多西他赛浓度2mg/ml)稀释10倍，样品温度设定为25℃，每个样品重复测量3次取平均值。

2.3透射电镜(tem)

本实验采用透射电镜(tem)观察脂质体的形貌；观察前，将脂质体溶液滴至铜网上，用磷钨酸染色，室温下干燥，然后用tem观察。钨为重金属，电子束不能穿透，故没有被染色的部分在电镜下呈浅色，被染色的部分在电镜下呈深色。

2.4含量测定

采用hplc法测定多西他赛脂质体含量。

2.4.1液相色谱条件

系统：waters2695-2996；

色谱柱：sunfirec-18反相色谱柱(4.6×150mm)；

温度：25℃

色谱条件：乙腈/水＝50/50；

进样体积：10μl；

测定波长：230nm。

流速：1ml/min

2.4.2标准曲线制备

取多西他赛，精密称定10.20mg，置10ml棕色容量瓶中，色谱级乙腈溶解并定容至刻度，摇匀即得浓度为995.9μg/ml的和厚朴酚对照品储备液，将储备液用乙腈稀释成5、10、20、40、80、160和320μg/ml的对照品溶液，按2.4.1色谱条件进行分析并记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以对照品溶液浓度c(μg/ml)为横坐标进行线性回归。

2.4.3空白脂质体干扰实验

精密吸取2.1.1项下制备的空白脂质体适量，加乙腈精密稀释20倍，超声破乳，12000rpm离心5分钟，取上清液即供试品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪。

2.4.4dtx-peg-lps冻干粉含量测定

取2.1.1项下制备的dtx-peg-lps冻干粉一瓶，加1ml纯水溶解，精密吸取上述溶液适量，加乙腈精密稀释10倍，超声破乳，12000rpm离心5分钟，取上清液即供试品溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。另取多西他赛对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml含多西他赛100μg的对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算即得。

2.5体外释放实验

分别取0.5ml游离的dtx溶液、dtx-lps脂质体溶液、dtx-peg-lps脂质体溶液和dtx-tbfgf-lps脂质体溶液(dtx浓度为1mg/ml)，置于预处理后的透析袋中，以40ml含有1％吐温-80的pbs(ph＝7.4)溶液为透析介质，透析袋密封，置于37℃的恒温摇床上(震摇速度100rpm)，分别在0、0.5、1、2、4、8、12和24h吸取1mlpbs溶液，供液相色谱测定dtx的含量，同时补加1ml含1％吐温-80的pbs溶液。取样后13,000rpm离心3min，取上清溶液进样测定，测定后的峰面积采用含量测定项下标准曲线计算浓度。平行测定三次。

2.6初步稳定性考察

2.6.1dtx-peg-lps脂质体

将制备的dtx-peg-lps脂质体冻干粉及复溶后溶液避光密封保存于4℃冰箱中，分别于第0、5、10和40天测定冻干粉及复溶后溶液的粒径、电位及含量，考察脂质体的稳定性。

2.6.2dtx-tbfgf-lps脂质体

tbfgf是一种短肽，其溶液在4℃条件下稳定性较差，因此dtx-tbfgf-lps脂质体的制备均为现配现用，并且对其4℃条件下放置0、2和4天的粒径和电位进行考察。

3结果

3.1脂质体的制备

乙醇注入法制备工艺简单，容易放大，同时避免了使用氯仿等有机溶剂，使得制剂更加安全。由于本脂质体制备采用天然的大豆磷脂酰胆碱(94％)，大豆磷脂酰胆碱在水溶液中容易水解和氧化，因此将脂质体溶液进行冻干，除去水分，增加贮存过程中的稳定性。冻干前的dtx-peg-lps为带蓝色乳光的澄清透明溶液，经冻干后的样品成型性好，外观为白色疏松状粉末，加2ml纯水复溶后溶解迅速，复溶后的溶液仍为蓝色乳光的澄明溶液。冻干粉如图12所示。

3.2粒径和电位

由图13和表1-3可知，加入mpeg2000-ve后，所得脂质体粒径为(127.1±2.597)nm，pdi为0.160±0.009，相比未使用mpeg2000-ve修饰的脂质体(dtx-lps)，粒径明显减小。dtx-peg-lps冻干后复溶所得溶液粒径为(84.77±0.505)nm，pdi为0.103±0.009，比冻干前的脂质体溶液粒径分布范围变窄，pdi变小，可能是由于，冻干过程和冻干保护剂的加入增加了脂质体的膜结构稳定性，改善了不同大小粒子的分布，dtx-peg-lps溶液带小量负电荷，电位为(-4.47±0.481)mv，当脂质体中加入tbfgf-peg-ve后粒径有所增加，为(89.10±1.100)nm，电位降低至(-7.80±0.704)mv。

表1-3不同多西他赛脂质体粒径和电位测定结果

3.3透射电镜

由于dtx-lps脂质体粒径和pdi均较大，因此只对dtx-peg-lps溶液和dtx-tbfgf-lps溶液进行透射电镜测定观察其形貌，电镜结果如图14所示，dtx-peg-lps为球形或近似球形的封闭囊泡，粒径约100nm，外形规则，大小均一，而含有tbfgf-peg2000-ve的脂质体为近似球形囊泡，囊泡粒径仍为100nm，外有一层层条状物，可能是蛋白在脂质体表面所致。

3.4含量测定

3.4.1标准曲线

不同浓度多西他赛对照溶液hplc测定的结果如表1-4：

表1-4标准曲线制备及相对应峰面积表

将峰面积对多西他赛的浓度进行线性回归，标准曲线如图15：

由图15可知，多西他赛在5～320μg/ml浓度范围内具有良好的线性关系。

3.4.2空白脂质体干扰实验

从图16可以看出，空白脂质体在选定波长下对多西他赛的含量测定无干扰。

3.4.3dtx-peg-lps冻干粉含量测定

由于dtx-tbfgf-lps由临用前将dtx-peg-lps溶液与tbfgf-peg-ve混合而得，因此我们测定了dtx-peg-lps溶液的dtx含量，结果见表1-5和表1-6，多西他赛脂质体冻干粉中dtx含量为100.90％，rsd为0.82％。

表1-5多西他赛对照液测定结果

表1-6含量测定结果

*供试品溶液浓度(mg/ml)＝ax*(cs/as)*10/1000

供试品含量(％)＝计算浓度/标示量*100

3.5体外释放实验

图17显示了游离的dtx溶液(freedtx，按临床常用剂型配置)、dtx-lps脂质体、dtx-peg-lps脂质体和dtx-tbfgf-lps脂质体溶液中的dtx在ph＝7.4的pbs中的体外释放曲线。

结果显示多西他赛从dtx-lps、dtx-peg-lps和dtx-tbfgf-lps中释放较从freedtx中释放更缓慢；在8h时，freedtx释放了48.4％，dtx-lps释放39.1％，而dtx-peg-lps和dtx-tbfgf-lps仅仅释放了27.8％和19.8％；在48h后，dtx-tbfgf-lps中的dtx释放不到46％，而此时游离组中已经有56.1％的dtx释放至外水相中。

3.6稳定性考察

3.6.1dtx-peg-lps冻干粉

将制备的dtx-peg-lps脂质体冻干粉及复溶后溶液避光密封保存于4℃冰箱中，分别于第0、5、10和40天测定冻干粉及复溶后溶液的粒径、电位及含量，考察脂质体的稳定性。结果分别见表1-7和1-8，

表1-7dtx-peg-lps冻干粉复溶后溶液的稳定性

表1-8dtx-peg-lps冻干粉的稳定性

由上述结果可知，dtx-peg-lps溶液和冻干粉经4℃放置40天后粒径和电位变化很小，但是含量有所下降，其中dtx-peg-lps溶液中dtx含量下降了8％，而

dtx-peg-lps冻干粉稳定性明显提高，含量只下降了2％。

3.6.2dtx-tbfgf-lps溶液

由于dtx-tbfgf-lps脂质体溶液属于现配现用，且tbfgf蛋白本身稳定性较差，因此只对dtx-tbfgf-lps脂质体溶液进行了4℃条件下放置0、2和4天的粒径和电位的考察，结果如表1-9：

表1-9dtx-tbfgf-lps溶液的稳定性

由表可见，dtx-tbfgf-lps溶液4℃条件下放置2天稳定性良好，但是放置4天后平均粒径和pdi都有所增加，电位有所升高。

4小结

我们成功地制备了多西他赛普通脂质体(dtx-lps)，含mpeg2000-ve脂质体(dtx-peg-lps)和含tbfgf-peg2000-ve的脂质体(dtx-tbfgf-lps)，其中dtx-lps粒径为(277.2±54.75)nm，电位为(2.77±0.161)mv,dtx-peg-lps冻干前粒径为(127.1±2.597)nm和电位为(-4.53±0.362)mv，说明加入mpeg2000-ve使脂质体粒径大大减小，并使脂质体微带负电，dtx-peg-lps冻干复溶后的粒径为(84.77±0.505)nm，电位为(-4.47±0.481)mv，加入tbfgf-peg2000-ve后的脂质体粒径有所增加，为(89.10±1.100)nm，电位有所降低，为(-7.80±0.704)mv；透射电镜显示脂质体平均直径为100nm左右，结构近球形，大小均一；体外释放试验表明游离dtx释放较快，在8h时释放了48.4％，普通脂质体dtx-lps释放了39.1％，而peg化的脂质体释放更加缓慢，其中，dtx-peg-lps经过8h释放27.8％，而dtx-tbfgf-lps仅仅释放了19.8％。而稳定性考察结果显示制成冻干粉以后明显提高了脂质体的稳定性，降低了多西他赛的降解和减少了脂质体的聚集。

实施例3本发明含药脂质体载体体外细胞毒性和细胞摄取实验

取实施例2制备的dtx-tbfgf-lps、dtx-peg-lps、dtx-lps，以freedtx为对照进行如下实验：

1实验材料

1.1仪器

分析天平：auw120dd＝0.1mg/0.01mg，日本岛津；

恒温加热磁力搅拌器：df-101s巩义市予华仪器责任有限公司；

纯水仪：milli-q，美国millipore；

多功能酶标仪：spectramaxm5，美国moleculardevices；

生物安全柜：classiibiologicalsafetycabinet，esco；

倒置显微镜：ckx31，日本olympus；

离心机：sorvallst16，美国thermoscientific；

恒温培养箱：cellcultureco2incubator，esco；

高压灭菌锅：laboautoclavemls-378，sanyo；

旋涡混匀器type16700，mixerthermolyne；

正置荧光显微镜：bx51，日本olympus；

流式细胞仪：espelite,coulter。

1.2试剂

多西他赛(dtx)：四川协力制药有限公司，纯度＞98％；

香豆素6(c6):上海安耐吉化学有限公司；

dmso：美国sigma-aldrich公司；

dmem培养基：美国gibco.brl公司；

胰酶：美国gibco.brl公司；

四甲基偶氮唑盐(mtt)：美国sigma公司(用生理盐水配制成5g/l储存液，置-20℃冰箱闭光保存备用)；

4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)：beyotime公司；

0.9％氯化钠注射液：四川科伦药业有限公司；

培养皿：whb-150上海卧宏生物科技有限公司；

50ml离心管：rcf9400bdfalcontm；

15ml离心管：rcf6000bdfalcontm；

96孔板：costar3599，美国corning公司；

细胞计数板：南京建成生物工程公司。

1.3细胞

本实验所用的c57/bl小鼠来源黑色素瘤细胞系b16f10和小鼠路易斯肺癌高转移细胞株ll/2：购自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)，由四川大学生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种。

2实验方法

2.1细胞培养及传代

从液氮中取出冻存保种的路易斯肺癌细胞(ll/2)和小鼠黑色素瘤细胞(b16)，迅速置于37℃水浴复温融化，在超净工作台内用dmem培养基洗涤1次。然后用含有10％胎牛血清和100u/ml青霉素及100u/ml链霉素的dmem完全培养基于37℃，5％co2培养箱培养。

ll/2和b16细胞株为贴壁生长，从培养箱中取出培养瓶，吸去培养基后，用无血清培养基洗涤2次，加入1％的胰酶消化，显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入有血清培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集液体，1500rpm，离心3min，细胞沉淀用完全培养基重悬，吹打均匀后分瓶培养。一般2-3天传代1次。

2.2细胞计数

体外培养的细胞经胰蛋白酶消化并吹打混匀后，用培养基稀释到合适的密度。混匀后吸取少量悬液滴加到血球计数板上，在倒置显微镜下观察计数。记下4个大格的细胞总数，取平均数后乘以10⁴，再乘以稀释倍数得到细胞密度，乘以总体积即得到细胞总数。

2.3细胞毒性实验

采用噻唑蓝比色法(mtt法)测定多西他赛脂质体对ll/2和b16细胞的生长抑制作用，设溶剂对照。收集对数生长期的ll/2和b16细胞,稀释成1×10⁴个/ml的细胞悬液,接种于96孔板内(每孔100μl)，置5％co2，饱和湿度，37℃的细胞培养箱中培养24h，分别向各孔中加入不同浓度的freedtx溶液、dtx-lp溶液、dtx-peg-lp溶液，dtx-tbfgf-lp溶液，同时设不含药物的培养基阴性对照孔，每个供试品设四个浓度。每个浓度设3个平行孔。继续培养48h和72h，于每孔中加入20μlmtt(5mg/ml,溶于pbs缓冲液中，ph7.4)，再继续培养4h。培养结束后，弃去培养孔中的上清液,每孔加入150μldmso,室温下振荡10min,使蓝紫色结晶充分溶解。在酶标仪上测定490nm的吸光度(od)值,计算细胞存活率(cellviability):

存活率＝加药孔平均od值/对照孔平均od值×100％。

2.4细胞摄取实验

2.4.1香豆素-6脂质体的制备

香豆素-6(coumarin-6，c6)是一种常用的脂溶性荧光染料，显微镜下即能观察到较强烈的荧光，并且可用hplc定量测定，近年来常被用于载药系统的细胞摄取研究。载c6的脂质体的制备方法同实施例2，只是将药物dtx换为c6，分别得到普通脂质体包裹的c6(c6-lps)、含mpeg-ve脂质体包裹的c6(c6-peg-lps)、含tbfgf-peg-ve修饰的脂质体包裹的c6(c6-tbfgf-lps)，游离c6作为对照组(freec6)。c6-lps、c6-peg-lps、c6-tbfgf-lps和freec6使用注射用水配成溶液。

2.4.2荧光显微镜观察(dapi染色)

取对数生长期的b16细胞,将3×10⁵个/ml的细胞悬液，以每孔2ml的密度接种于6孔板内，放置于5％co2，饱和湿度，37℃的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁24h后，分别加入freec6溶液、c6-lps溶液、c6-peg-lps溶液，c6-tbfgf-lps溶液，每组两个复孔，每孔中c6的终浓度为0.2μg/ml，继续培养2h，弃去孔中的培养基，用pbs(ph7.4)洗三次。dapi染色，继续用pbs(ph7.4)洗三次，中性多聚甲醛(4％)固定后封片。用荧光显微镜观察细胞内的绿色和蓝色荧光并照相。

2.4.3流式细胞实验

分别取对数生长期的b16细胞，将3×10⁵个/ml的细胞悬液，以每孔2ml的密度接种于6孔板内，放置于5％co2、饱和湿度和37℃的细胞培养箱中培养。待细胞贴壁24h后，分别加入freec6溶液、c6-lps溶液、c6-peg-lps溶液和c6-tbfgf-lps溶液，每组两个复孔，每孔中c6的终浓度为40ng/ml，同时使用空白脂质体作对照，继续培养2h，弃去孔中的培养基，用pbs(ph7.4)洗三次，收集漂浮和贴壁细胞，置于流式管中，1500rpm离心3min，弃上清，pbs(ph7.4)洗三次，再用0.5ml左右的生理盐水将细胞沉淀充分混匀，用流式细胞仪检测荧光强度。香豆素6的激发波长为353nm，发射波长为442nm。

3结果与讨论

3.1细胞毒性实验

不同浓度dtx(12.5、25、50和100μg/ml)对ll/2细胞分别作用48h和72h的增殖影响结果如图18，由图a可见，dtx作用48h后，细胞生长受到大于50％的抑制，虽然剂量依赖关系不明显，但是在相同作用剂量下，抑制效果从高到低依次为dtx-tbfgf-lps、dtx-peg-lps、dtx-lps和freedtx。

由图b可见,在低浓度下作用72h后dtx-tbfgf-lps组效果明显好于dtx-peg-lps组，而dtx-peg-lps组和dtx-lps组作用效果相差不大，在高浓度下虽然dtx-tbfgf-lps组和dtx-peg-lps组效果相差不大，但是dtx-peg-lps组效果明显优于dtx-lps组。

由于在ll/2细胞中存在以上结果，因此我们在对b16生长抑制作用进行考察的时候降低了药物作用浓度(0.025、0.25、2.5和25μg/ml)。

由图19a可知，不同浓度dtx(0.025、0.25、2.5和25μg/ml)作用b16细胞48h，脂质体组效果均优于游离药物组，在浓度为25μg/ml时，脂质体组抑制效果从高到低依次为dtx-tbfgf-lps、dtx-peg-lps、dtx-lps，但是在浓度0.025μg/ml和2.5μg/ml时，dtx-peg-lps效果优于dtx-lps，而在浓度为0.25μg/ml时，dtx-lps效果优dtx-peg-lps。

根据图19b，不同浓度dtx(0.025、0.25、2.5和25μg/ml)作用b16细胞72h，dtx-tbfgf-lps抑制肿瘤生长效果均比dtx-peg-lps好，但是剂量不同dtx-peg-lps和dtx-lps作用效果参差不齐。可能是由于脂质体包裹后，增加了dtx的水中溶解度，增加细胞摄取，因此dtx-lps效果比游离dtx好，但是由于peg化的脂质体虽然可以增加脂质体在血液中的稳定性，延长循环时间，但是到达靶部位以后，由于peg长链具有很强的亲水性，阻碍了细胞对脂质体的摄取作用，因此peg化的脂质体在细胞上作用更长时间以后效果不见增加。但是对于含有tbfgf的靶向脂质体来说，由于tbfgf配体可以与细胞表面fgfr受体结合，从而增加细胞对靶向脂质体的摄取，起到更好的效果。

3.2细胞摄取实验

3.2.1香豆素6脂质体的制备和表征

和制备多西他赛脂质体的方法一样，我们成功地制备了香豆素6普通脂质体(c6-lps)、含mpeg2000-ve的脂质体(c6-peg-lps)和含tbfgf-peg2000-ve的靶向脂质体(c6-tbfgf-lps)，粒径和电位结果如下表：

表1-10不同香豆素6脂质体粒径和电位测定结果

加入mpeg-ve后脂质体粒径减小，且粒径分布更加均匀。继续加入tbfgf-peg2000-ve后脂质体粒径稍有增加，电位降低。

3.2.2荧光显微镜

为了观察不同c6脂质体进入细胞的量，我们使用不同的c6脂质体作用于细胞后，对细胞核进行了dapi染色，如图20，蓝色的表示细胞核，绿色荧光表示进入细胞质的c6，由图20可见，游离c6组绿色荧光最弱，其次是含mpeg-ve的c6脂质体组(c6-peg-lps)，普通c6脂质体组(c6-lps)绿色荧光比c6-peg-lps组强，说明mpeg-ve的加入阻碍了细胞对c6的摄取作用，而含tbfgf-peg-ve的c6-tbfgf-lps处方中虽然也加入了mpeg-ve，但是由于靶向短肽tbfgf的引入增加了细胞对c6的摄取。

3.2.3流式细胞实验

为了进一步对细胞的摄取作用进行定量分析，我们对细胞内的香豆素进行了流式细胞测定，结果如图21，细胞摄取从高到低的顺序依次为c6-tbfgf-lps、c6-lps、c6-peg-lps、freec6，比较发现b16细胞对c6-tbfgf-lps的摄取是c6-peg-lps的1.41倍(p<0.001)，对c6-lps的摄取是freec6的2.39倍(p<0.001)，对c6-lps的摄取是c6-peg-lps的1.07倍(p<0.05)，结果同3.2.2荧光显微镜观察的结果一致，证明上述假设成立。

4小结

体外实验表明，不同剂量的dtx脂质体显示了良好的抑制ll/2和b16肿瘤细胞生长的作用，在不同浓度对ll/2细胞作用48h和浓度为25μg/ml对b16细胞作用48h、浓度为0.025μg/ml和2.5μg/ml对b16细胞作用72h结果显示抑制率从高到低依次为dtx-tbfgf-lps、dtx-peg-lps、dtx-lps和freedtx的结果，但是在浓度12.5μg/ml对ll/2细胞作用72h，以及浓度为0.25μg/ml对b16细胞作用48h，以及浓度为2.5μg/ml和25μg/ml对b16细胞作用72h时，出现了含dtx-lps效果优于dtx-peg-lps组的现象。在对b16细胞作用不同时间中，dtx-tbfgf-lps作用效果均比dtx-peg-lps好。为进一步验证这一结果，以低浓度不同c6脂质体对b16细胞的体外细胞摄取实验，显微镜观察和流式细胞分析都显示细胞摄取从强到弱依次为c6-tbfgf-lps、c6-lps、c6-peg-lps、freec6的顺序。

实施例4本发明含药脂质体载体体内抗肿瘤活性评价

1实验材料

1.1仪器

恒温加热磁力搅拌器：df-101s，巩义市予华仪器责任有限公司；

生物安全柜：classiibiologicalsafetycabinet，esco；

倒置显微镜：ckx31，日本olympus；

离心机：sorvallst16，美国thermoscientific；

恒温培养箱：cellcultureco2incubator，esco；

高压灭菌锅：laboautoclavemls-378，sanyo；

培养皿：whb-150，上海卧宏生物科技有限公司；

石蜡切片机：leicarm2125，leica公司；

phy-iii型病理组织漂烘仪：中威电子；

离心管：rcf9400bdfalconbluemaxtm。

1.2试剂及耗材

dmem培养基：gibco公司；

胰酶：美国sigma-aldrich；

0.9％氯化钠注射液：四川科伦药业有限公司；

中性树胶：北京中杉生物技术有限公司；

多聚甲醛：分析纯，天津博迪化工股份有限公司；

细胞计数板：南京建成生物工程公司；

p-gp-glotm试剂盒：promega公司。

1.3细胞

本实验所用的c57/bl小鼠来源黑色素瘤细胞系b16f10：购自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)，由四川大学生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种。

1.4实验动物

c57小鼠，spf级，雌鼠，40只，5～7周龄，18～20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，小鼠置于spf级动物房中饲养，温度24±2℃，湿度50±10％。

2实验方法

2.1肿瘤模型的建立

0.25％胰酶消化并收集处于对数生长期的b16细胞，1500rpm离心3分钟沉淀细胞，各自用dmem双无培养基洗3次，细胞计数后各自用dmem的双无培养基调节细胞浓度为2×10⁶个/ml。采用6～8周龄的c57bl/6雌性小鼠，每只小鼠接种2×10⁵个细胞(0.1ml)。接种部位均为小鼠右侧协肋部皮下。

2.2分组及给药

模型建立约10天后，可扪及肿瘤直径约5-7mm,此时将荷瘤小鼠随机分为6组，前4组为治疗组(每组10只小鼠)，分别按照10mg/kg的多西他赛剂量尾静脉注射不同形式的多西他赛，依次为游离多西他赛(freedtx，按临床常用剂型配置)，普通脂质体包裹的多西他赛(dtx-lps)、含mpeg-ve脂质体包裹的多西他赛(dtx-peg-lps)、含tbfgf-peg-ve修饰的脂质体包裹的多西他赛(dtx-tbfgf-lps)。后两组为对照组(每组6只小鼠)，分别尾静脉注射生理盐水和相应剂量的普通脂质体(lps)。以上给药均为每周2次，持续2周，共计给药4次。

2.3肿瘤生长观察

开始治疗后用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长、宽、高径，并用下列公式计算肿瘤体积，即肿瘤体积(v)＝0.52×长×宽²，同时测定小鼠体重。整个实验过程中注意观察小鼠皮毛色泽、食欲及活动变化。待生理盐水组和空白脂质体对照组肿瘤超过2000mm³时，处死小鼠，眼眶取血，剥离肿瘤组织，并且取出正常组织，于多聚甲醛溶液(4％)中固定。

根据肿瘤体积测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume,rtv)，计算公式为：rtv＝vt/v0，其中v0为每一组在分笼给药时(即d0)测量所得tv，vt为该组每一次测量时的tv。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率t/c(％)，计算公式如下：

trtv指治疗组相对肿瘤体积；crtv指生理盐水对照组相对肿瘤体积。

2.4h&e染色

(1)组织取出后，浸泡于4％多聚甲醛中固定。

(2)固定至少24h后，将其切成厚度不超过5mm，冲水过夜。

(3)脱水：75％乙醇1小时；85％乙醇1小时；95％乙醇1小时，共3次；100％乙醇1小时，共3次。

(4)透明：二甲苯2次，1小时。

(5)浸蜡：65℃石蜡浸泡3次，共2小时。

(6)包埋：将组织包埋于石蜡中，石蜡冷却硬化后修蜡块。

(7)切片：5μm切片，待切片完全展开后，用玻片捞起于65℃烘烤2小时。

(8)石蜡切片脱蜡至水：石蜡切片染色前应于60℃放置1小时→二甲苯ι、ii脱蜡，各10分钟→梯度酒精水化：100％乙醇，2分钟→95％乙醇，2分钟→80％乙醇，2分钟→70％乙醇，2分钟→蒸馏水洗，5分钟，2次(置于摇床)。

(9)苏木素滴染细胞核，室温，1分钟。

(10)自来水冲洗返蓝10分钟，在显微镜下观察适时终止。

(11)依红浸染细胞质，室温，1秒，自来水洗去多余颜色，在显微镜下观察适时终止。

(12)梯度酒精脱水：80％乙醇，2分钟；95％乙醇，2分钟；100％乙醇，5分钟/次，共2次；透明：二甲苯i，ii，各5分钟。(此步亦可直接空气放置晾干即可)

(13)封片：中性树胶封片，晾干。

2.5cd31染色

实验步骤：

(1)肿瘤组织取出后用otc胶包裹置于-80℃冰箱冻存，一个月内进行免疫染色效果最佳。

(2)切取一部分组织块用于冰冻组织切片，剩余继续放在-80度冰箱冻存；切片厚度为3-5mm。

(3)将切片置于冰丙酮中固定5-10分钟，取出自然晾干，置于4℃冰箱保存(最好1-2天内进行后续试验)。

(4)同免疫组化实验2-5步。

(5)一抗孵育：用滤纸吸去封闭血清，不洗，直接滴加稀释好的一抗(1:100)，4℃过夜。

(6)二抗孵育：pbs洗2次，每次5分钟，滴加二抗工作液，放于湿盒，37度，30-40分钟；pbs洗2次，每次5分钟。

(7)蒸馏水洗净，晾干；抗淬灭剂封片，显微镜下观察拍照。

肿瘤微血管密度(mvd)计数参照李娟等的方法，先在低倍镜下(40倍)确定肿瘤内新生血管最密集区作为“热点”，然后在高倍镜视野(200倍)计数5个视野，每个视野的血管平均数为该切片的mvd值。

2.6生化指标测定

眼眶取血，血液静置后离心(3000rpm，4℃，15min)取上清液，采用生化测定仪直接测定。

2.7本发明含药脂质体对p-gp酶的抑制作用

通过promaga公司的p-gp-glotm试剂盒对tbfgf-peg-ve对p-gp酶的抑制作用进行了实验。由于荧光强度和atp酶的活性成正比，因此通过测定荧光强度可以知道atp酶的活性，将普通脂质体(lps)、含mpeg-ve的脂质体(peg-lps)、含tbfgf-peg-ve的脂质体(tbfgf-peg-lps)和na3vo4(选择性的p-gp抑制剂，basal)与人源p-gp膜37℃孵育5min。用mgatp作引发剂37℃孵育5min。然后加入atp检测试剂测定荧光强度，计算△rlu。脂质体的制备方法同实施例2，只是脂质体中不载药。

2.8统计学方法

所有数据采用excel软件进行分析。多组数据之间比较采用单因素方差分析(anova)dunnett法，两组之间比较采用students’t-test分析；所有统计学分析均以p<0.05和p<0.01为注明差异显著性水平；实验数据以平均值和±标准偏差表示

3结果与讨论

3.1dtx脂质体对黑色素瘤生长的抑制作用

实验结束后，处死小鼠，从小鼠背部剥离出肿瘤组织，照相并称量各组瘤重，根据瘤重计算抑瘤率(％)，肿瘤照片见图22，具体瘤重和抑瘤率(％)见表1-11：

表1-11dtx脂质体治疗b16黑色素瘤的瘤重及抑瘤率(％)

*p<0.05，**p<0.01vscontrol

抑瘤率(％)＝(模型组瘤重-治疗组瘤重)/模型组瘤重*100％

给药期间的小鼠体重变化如图23所示，游离药物组和普通脂质体组小鼠体重下降较为明显，而dtx-peg-lps组和dtx-tbfgf-lps组小鼠体重几乎无下降，说明dtx-peg-lps和dtx-tbfgf-lps减小了多西他赛的毒性作用。给药期间的肿瘤体积变化如图24所示，随着时间的增加生理盐水组和空白脂质体组肿瘤体积逐渐增大，dtx给药组肿瘤体积变化趋于平缓，且明显低于生理盐水组和空白脂质体组。

肿瘤体积(v)、相对肿瘤体积(rtv)、相对肿瘤增殖率(t/c％)结果见表1-12和表1-13：

表1-12dtx脂质体对b16皮下移植瘤肿瘤体积(mm³),rtv和t/c(％)变化的影响

trtv指治疗组相对肿瘤体积；crtv指生理盐水对照组相对肿瘤体积

表1-13dtx脂质体对b16皮下移植瘤肿瘤体积(mm³),rtv,t/c(％)变化的影响

和对照组比较，游离的dtx和dtx脂质体均抑制b16细胞系c57小鼠皮下移植瘤的生长，治疗各时间点肿瘤体积(v)、相对肿瘤体积(rtv)、相对肿瘤增殖率(t/c％)和对照组比较均明显减少。治疗终点时，游离多西他赛组(freedtx)显示出了良好的抑瘤效果，抑瘤率46.12％,t/c值为29.36％；dtx-lps组抑瘤率为53.76％，t/c值为24.10％；dtx-peg-lps组抑瘤率54.59％，t/c值为21.55％；dtx-tbfgf-lps组抑瘤率66.69％，t/c值为19.15％，且均具有统计学意义(p<0.05)。

3.2he染色观察dtx脂质体对肿瘤组织的影响

各组小鼠处死后，取出内脏和肿瘤组织进行h&e染色观察治疗剂量下对正常组织的毒性作用和对肿瘤组织的影响，肿瘤组织he染色结果见图25。

如图25所示，freedtx和dtx脂质体均严重破坏了肿瘤组织的正常结构，抑制肿瘤细胞的正常生长。

3.3he染色观察dtx脂质体对正常组织的影响

对正常组织(心、肝、脾、肺和肾)的he染色结果如图26表明，生理盐水组和空白脂质体组均体现了不同程度的正常组织结构破坏，尤其是肝组织和肾小球的结构破坏，但是游离的dtx和各dtx脂质体治疗均减缓了小鼠的脏器损坏，其中dtx-peg-lps和dtx-tbfgf-lps治疗组小鼠组织结构最完整。

3.3cd31染色观察dtx脂质体的血管生成抑制作用

文献报道多西他赛在低于细胞毒性剂量作用下具有很强的抗血管作用，结合脂质体的血管靶向作用，我们对肿瘤组织进行了cd31染色和mvd计数，结果如图27和图28：

结果表明，游离dtx和各dtx脂质体给药组cd31阳性表达细胞数均显著减少，且脂质体组减少比游离组多，dtx-tbfgf-lps减少最多，表现出很好的血管生成抑制作用。

3.4生化指标测定结果

不同组的dtx治疗后alt、ua、ast、ck、hdl和ldl有所下降，但dtx-tbfgf-lps组下降程度较其他组小，其它生化指标无明显变化。具体结果见图29和表1-14和表1-15：

表1-14不同多西他赛脂质体治疗后的小鼠血清生化指标结果

表1-15不同多西他赛脂质体治疗后的小鼠血清生化指标结果

3.5本发明含药脂质体对p-gp酶的抑制作用

各组脂质体的△rlu结果如图30所示。由图30可知，lps的△rlu和basal的△rlu无显著差别(p>0.05)，而peg-lps和tbfgf-peg-lps的△rlu均比basal的△rlu小，并且有统计学差异(p<0.05，p<0.01)，说明含peg-ve和tbfgf-peg-ve的脂质体对p-gp酶有抑制作用。

p-gp酶是atp结合盒转运体家族中重要的外排转运体。诱导作用可上调细胞外排转运体的表达并增强其功能，从而减少外源性有害异物造成的伤害，对维持细胞内环境稳态有重要作用。在肿瘤细胞中p-gp酶的产生会导致肿瘤细胞产生多药耐药性。

本发明制备的脂质体可以对p-gp酶具有抑制作用，因此，作为药物运载体时，可以减少肿瘤细胞的多药耐药性。

4小结

多西他赛脂质体(10mg/kg)对c57小鼠b16黑色素瘤模型显示了良好的抗肿瘤效果，freedtx组抑瘤率为46.12％，t/c值为29.36％；dtx-lps组抑瘤率为53.76％，t/c值为24.10％；dtx-peg-lps组抑瘤率54.59％，t/c值为21.55％；dtx-tbfgf-lps组抑瘤率66.69％，t/c值为19.15％，且均具有统计学意义(p<0.05)。其中，dtx-peg-lps组和dtx-tbfgf-lps组对小鼠体重几乎无影响。从肿瘤组织的he染色和cd31染色来看各dtx脂质体组均体现了良好的破坏肿瘤组织正常结构和抑制血管生成的作用。从正常组织的he染色观察，dtx-peg-lps组和dtx-tbfgf-lps组的小鼠正常组织结构较为完好，副作用较小。生化指标分析结果显示dtx降低了部分生化指标，但dtx-tbfgf-lps组下降程度较其他组小，良好的降低了dtx的副作用。同时，本发明脂质体作为药物载体，可以减少肿瘤细胞的多药耐药性。

综上，本发明成功合成了hooc-peg2000-ve，将它与tbfgf短肽偶联制备了tbfgf-peg2000-ve，并制备了不同的dtx脂质体dtx-lps、dtx-peg-lps和dtx-tbfgf-lps，与dtx-lps脂质体相比，dtx-peg-lps脂质体具有良好的外观、粒径和电位以及稳定性。体外释放实验表明，dtx-peg-lps和dtx-tbfgf-lps释放速率比dtx-lps慢。稳定性考察结果显示制成冻干粉以后明显提高了脂质体的稳定性。mtt实验表明dtx-tbfgf-lps对b16细胞抑制效果最好，freedtx最差。体外b16摄取实验表明细胞对c6的摄取从强到弱依次为c6-tbfgf-lps、c6-lps、c6-peg-lps、freec6。体内抑瘤实验表明靶向脂质体组效果优于其他组，且dtx-tbfgf-lps明显减少了dtx对正常组织的副作用。同时，本发明脂质体作为药物载体，可以减少肿瘤细胞的多药耐药性。

由此可知，本发明采用peg-ve以及tbfgf-peg-ve修饰脂质体，使得脂质体的性能得到了明显的提升，一方面降低了脂质体的粒径，使其容易被机体吸收，第二方面提高了脂质体的稳定性，另外还使得脂质体的缓释作用增强，与未经修饰的脂质体相比，本发明修饰后的脂质体的药物释放速度明显降低，有利于药物的吸收和利用；采用多西他赛作为药物进行了验证，本发明修饰后的脂质体的抗肿瘤作用明显优于未经修饰的脂质体，而且副作用降低，本发明脂质体作为药物载体，还可以减少肿瘤细胞的多药耐药性。临床应用前景良好。

sequencelisting

<110>四川大学华西医院

四川大学

<120>一种包含tbfgf的新材料及其用途

<130>gykh1344-2019p017171cc

<150>201810587671.0

<151>2018-06-08

<160>1

<170>patentinversion3.5

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<213>人类（homosapiens）

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151015

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leuglnleuglnalaglugluargglyvalvalserilelysglyval

354045

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505560

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85