云斑蛛牵引丝性能及其丝蛋白基因序列的制作方法

本发明涉及云斑蛛牵引丝及其丝蛋白基因序列。

背景技术：

蜘蛛丝是自然界强度优异、阻尼性良好并且弹性突出的一类天然丝纤维，被誉为“生物钢”，是一类极具应用潜力的生物质材料。尤其在军工、医药等领域。但目前丝蛋白新材料研发领域仍相对落后，缺乏自主知识产权资源。蜘蛛丝是自然界中一类极具应用潜力的生物质材料，蜘蛛丝的种类、数目繁多，结构特征各异，而目前的研究主要集中在个别物种，对蛛丝蛋白结构与性能的认识仍不深入。目前的困境一方面是蛛丝蛋白资源非常有限，另一方面缺乏有效的分子设计思路。

由于蜘蛛特殊的生物学特性，人工饲养蜘蛛已获得大量蛛丝蛋白并不可行。蜘蛛丝的种类、数目繁多，结构特征各异，相应的，蜘蛛丝蛋白的种类也很丰富，远比于另一类泌丝昆虫鳞翅目昆虫的丝蛋白更为复杂。然而目前可获得的蛛丝蛋白基因资源非常有限，尤其是更具有深入分析意义的长序列资源。此外，目前已有的探讨结构域功能的研究主要集中在极少数几个物种，研究相对零星，迫切不断发掘新的优秀蜘蛛及蜘蛛丝蛋白资源。

技术实现要素：

本发明在结网性能较好的一大类——圆网蜘蛛类型中较为系统的搜寻蜘蛛物种，结合蛛丝蛋白性能评估，并利用第三代测序技术，进行代表全长转录组测序分析，发掘到蜘蛛丝性能优的云斑蛛蛛丝蛋白masp的序列。

本发明的目的在于提供云斑蛛牵引丝蛋白序列和基因序列及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种蛋白质，其氨基酸序列为seqidno:1或/和seqidno:2所示，或者其氨基酸序列为将seqidno:1或/和seqidno:2所述的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的且具有等同力学性能的氨基酸序列。

一种蛋白质，其由seqidno:1所示的蛋白质和seqidno:2所示的蛋白质组成。

一种蛋白质，其由蛋白质a和蛋白质b组成，其中编码蛋白质a的核苷酸序列如seqidno:3所示，编码蛋白质b的核苷酸序列如seqidno:4所示，所述力学性能包适延伸性、强度和/或韧性。

编码上述所述蛋白质的核酸。

编码上述所述蛋白质的核酸，其核苷酸序列为seqidno:3或/和seqidno:4所示。

含有上述所述核酸的重组载体。

用上述所述的重组载体转化或转染的宿主细胞。

上述所述蛋白质的制备方法，其包括用上述所述的宿主细胞表达上述所述的蛋白质，然后分离上述所述的蛋白质。

seqidno:1所示的蛋白质或/和seqidno:2所示的蛋白质在人造材料中的应用

一种人造材料，其含有seqidno:1所示的蛋白质或/和seqidno:2所示的蛋白质。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现了云斑蛛牵引丝蛋白masp1和masp2的蛋白序列和基因序列，并发现云斑蛛牵引丝的力学性能非常出色，其强度很高、延伸性也较高，具有很好的韧性，显著优于其他种蜘蛛的牵引丝韧性。本发明为后续深入理解不同物种、不同性能蛛丝蛋白进化格局的奠定了基础，为开发超级蛛丝蛋白奠定了重要的理论。

附图说明

图1为masp1重复区基序(motif)的氨基酸组成分析；

图2为masp2重复区基序(motif)的氨基酸组成分析；

图3为不同蜘蛛牵引丝的力学性能测试不同颜色的曲线代表不同的生物学重复数据；横坐标为延伸率(0-30％)，纵坐标为拉伸强度(0-1400mpa)，拉伸应力-应变曲线所围成的面积代表韧性；从图中可以清楚的看出，云斑蛛牵引丝的曲线面积高于其他物种，即韧性最大。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明首先在采集了进化地位有差异的几种愿望蜘蛛物种，进行丝性能评估，结果显示圆蛛科云斑蛛牵引丝masp性能优越。进一步选择了3种代表性物种(云斑蛛、大腹园蛛、络新妇一种)进行了全长或普通转录组测序，结合系统搜集已发表蛛丝蛋白序列，着重在3种全长转录组测序的物种中发掘到一批蛛丝蛋白基因资源。对三种蜘蛛的主壶腹腺丝蛋白序列比较，发现云斑蛛牵引丝masp存在较为独特的基序。结合已发表序列，对所有丝蛋白c端进行进化分析发现，种间masp和次壶腹腺丝蛋白misp高度亲缘，其他类型丝蛋白关系尚待进一步明确。深入分析各类丝蛋白序列特征，发现就丝蛋白重复区而言，综合性能最优的masp和高弹性的横丝即鞭毛状腺丝(flag)的非多聚a的基序具有一定相似性；而两类胶状丝蛋白(聚合状腺丝蛋白agsp及梨状腺丝蛋白pysp)的重复区序列差异较大，与其不同的黏胶特性相关。本发明首次发现了云斑蛛牵引丝masp1和masp2的蛋白序列和基因序列，并发现云斑蛛牵引丝的力学性能非常出色，其韧性非常强，显著优于其他几种广泛被认为有较优丝性能的蜘蛛的牵引丝韧性。本发明为后续深入理解不同物种、不同性能蛛丝蛋白进化格局的奠定了基础，为开发超级蛛丝蛋白奠定了重要的理论及技术平台。

实施例1云斑蛛牵引丝masp的蛋白序列和基因序列

masp(majorampullatesilk，主壶腹腺丝)又称牵引丝，由masp1和masp2组成，masp1不含有脯氨酸，主要功能用于逃逸，织网，编织网框，构成网骨架的框丝，具有很高的强度。目前，该蛋白序列在云斑蛛属(圆蛛科)里只发表了一种masp1(439个aa)，还有金珠属的横纹金珠的masp1(945个aa)，masp2(3360)，其他亲缘物种的物种如肖峭科的络新妇蜘蛛masp2(2466个aa)，黑寡妇蜘蛛的masp1(3123个aa)，masp2(3779个aa)，其他序列由于长度过低，无法评估其基因特征。

我们通过测序发掘到了云斑蛛牵引丝中的masp1氨基酸序列如seqidno:1所示，一共938个氨基酸，masp2的氨基酸序列如seqidno:2所示，一共642个氨基酸。从结构上来看，本发明获得的masp1(seqidno:1)和masp2(seqidno:2)有n端和c端，是完整的序列。本发明获得的masp1的核苷酸序列如seqidno:3所示，masp2的核苷酸序列如seqidno:4所示。我们通过与其他物种的比对，与亲缘物种相比，我们保证了序列的可靠性，同时又有一定的差异，而差异性显现了其蜘蛛的结网差别，揭示了蜘蛛物种进化关系(如图1所示)。

masp1氨基酸序列(seqidno:1)：

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masp2氨基酸序列(seqidno:2)：

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masp1的核苷酸序列(seqidno:3)：

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masp2的核苷酸序列(seqidno:4)：

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通过三种蜘蛛(大腹园蛛，络新妇，云斑蛛)的三代全长转录组数据的分析，我们目前完成了masp的进一步序列确认。我们对三种masp蛋白重复区的氨基酸序列基序进行了种间分析，发现的确存在间的共性和差异(图1和图2)。

首先，masp重复区基序(motif)，共性是，c端均存在多个丙氨酸(a)序列，masp1与masp2最大的差异是，masp2有多个gpggx的结构，而在masp1中却几乎不存在脯氨酸p,在masp1中，大腹园蛛在每个基序的n端有着丝氨酸，云斑蛛有着gaaga的结构，同时云斑蛛的polya的长度也更长，然而在masp2中，络新妇masp在基序的n端多出ga序列，大腹园蛛则在基序的种间有两段明显的氨基酸序列插入；云斑蛛则在基序的第一对其区和第二对其区上与其他两种的氨基酸序列有所差异(见图1和图2)。种间的重复区基序与丝纤维的性能有关。

蜘蛛丝蛋白的c端参与丝蛋白的纤维化调节及成丝过程。有文献报道，丝蛋白的c末端区域的序列分析显示了两个不常见的氨基酸(精氨酸和谷氨酸)，这两个氨基酸与“盐桥”的形成有关，而盐桥是蛋白质组装所必须的功能键，从而驱动丝纤维的组装。我们对不同种类蜘蛛丝蛋白的c端进行了系统发育树分析。不同蜘蛛的同一个腺体的c端是高度保守的，同时发现种间的主壶腹腺丝蛋白masp和和次壶腹腺丝蛋白misp是高度近缘的。

上述分析结果进一步说明，与近缘物种相比，本专利发现的云斑蛛牵引丝masp1和masp2的序列具有准确性，同时又有一定的差异，而差异性显现了其蜘蛛的结网性能差别，为进一步设计超级蛛丝蛋白奠定了基础。

实施例2云斑蛛牵引丝的力学性能分析

方法：采用instron拉力机对各种蜘蛛(金珠、络新妇、云斑蛛、棘腹蛛)的牵引丝进行了力学性能测试,测试条件:温度：24-26℃，湿度：75-90％,抽丝速度为10.57cm/s。同时用扫描电镜(s48001.0kv6.6mm×9.00kse(u))测量蜘蛛丝直径，根据应力＝p/a,应变＝l-l0/l0(p为载荷,a为蜘蛛丝的初始截面积),对于每一蜘蛛丝试样测试多次，数据的统计处理主要使用origin2018软件完成,最终得到在不同拉伸强度下的蜘蛛丝的力学数据。

我们总共对圆网蜘蛛(金珠、络新妇、云斑蛛、棘腹蛛)进行了力学性能测试，保持其他因素不变的情况下，最终得到拉伸应力-应变曲线如下图3所示。

从力学性能检测结果数据和如图3曲线结果可以看出，云斑蛛牵引丝的强度很高(1376.189±166.958mpa)，金蛛与其较为接近(1220.564±268.868mpa)，但明显高于其他物种(络新妇：1069.019±98.197mpa；棘腹蛛：242.609±41.250mpa)。同样云斑蛛延伸性也较高(24.498±4.593％)，仅次于络新妇(27.023±3.440％)，高于其他物种(金蛛:16.677±3.677％；棘腹蛛：20.009±3.010％)。从图中的拉伸应力-应变曲线格局也可以看出，云斑蛛的曲线面积高于其他物种，与之相关联的韧性最强。综上所述，云斑蛛牵引丝的综合力学性能优于其他圆网蜘蛛种类。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>华南师范大学

<120>云斑蛛牵引丝性能及其丝蛋白基因序列

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<213>云斑蛛

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