一种线粒体靶向刺激响应性光敏剂的制备及应用的制作方法

本发明涉及一种线粒体靶向光敏剂的制备及应用，属于光动力治疗技术领域。

背景技术：

线粒体作为细胞呼吸必不可少的细胞器，为细胞的新陈代谢提供能量，并在细胞程序性死亡如细胞凋亡中起关键作用。因此线粒体成为临床应用中有希望的治疗靶标。众所周知，光动力疗法是一种新兴的治疗方式，通过有效光源照射光敏剂，产生具有细胞毒性的单线态氧，进而对病患细胞造成不可逆的杀伤。以上二者相结合，线粒体靶向光敏剂应运而生，通过制造线粒体功能障碍，导致病患细胞的死亡，进而达到治疗目的。然而，大多数的线粒体靶向光敏剂不具有开关可控性，并且在生物介质中的应用受到其低水溶性的限制，导致大量聚集体形成，降低单线态氧量子产率。因此设计一个开关可控、生物相容性好的线粒体靶向光敏剂势在必行。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供了一种线粒体靶向刺激响应性光敏剂的制备方法及应用，合成路线如下：

本发明提供的一种线粒体刺激响应性光敏剂，具有如^mito-pnps所示结构的化合物。

优选地，化合物1和没食子酸甲酯的摩尔比为1∶1。

优选地，化合物3和氢氧化钠的摩尔比为1∶10，四氢呋喃和水的体积比为2∶1。

优选地，化合物4和炔丙胺的摩尔比为1∶4，先将二者溶于二氯甲烷，搅拌均匀，再缓慢滴加含有edci和dmap的二氯甲烷混合溶液。

优选地，化合物6与三苯基磷的摩尔比为1∶3，该反应不加任何溶剂，90℃搅拌24h。

优选地，化合物7和^azidepsse-i的摩尔比为1∶1，四氢呋喃和水的体积比为4∶1，室温反应24h。

优选地，化合物^mitops和的摩尔比为1∶2，反应溶剂为n，n-二甲基甲酰胺和乙腈，体积比为1∶1，反应温度为80℃。

^mito-pnps所示结构的化合物在病患细胞线粒体内和线粒体过表达的ros(oono^-)相互作用，通过自降解化学，生成具有光毒性的^mitops所示结构的化合物，实现线粒体靶向光敏剂的开关可控性。

^mito-pnps所示结构的化合物在可见光区无吸收，无光动力能力，和线粒体过表达的ros(oono^-)相互作用后，生成具有光毒性的^mitops所示结构的化合物，在可见光区的吸收恢复，光动力能力也随之恢复。

本发明还提供了一种线粒体靶向激活式光敏剂的通用制备策略，可以在^mitops所示结构的化合物上醚化不同的生物响应性基团，特异性识别不同的生物信号分子，打开光敏性。

本发明所述光敏剂，碘原子的引入，一方面有效降低了光敏剂去磷酸化后酚羟基的pka，使光敏剂更加适应生理ph值；另一方面有利于隙间穿越，提高光动力能力。

附图说明

图1线粒体靶向光敏剂的合成路线。

图2线粒体靶向光敏剂在刺激响应前后的吸收。

图3线粒体靶向光敏剂刺激响应前后的光敏性。

图4线粒体靶向光敏剂在病患细胞中的特异性定位(与商业线粒体探针相比较)。

图5线粒体靶向光敏剂对病患细胞的杀伤(mtt)。

图6线粒体靶向光敏剂的结构式。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和具体实施例对本发明做出进一步的解释和说明，但所举实施例不作为本发明的限定，在没有做出创造性的劳动成果下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例一：合成化合物7，合成路线见附图1

没什子酸甲酯(3.0g，16.3mmol)溶于干燥的dmf(15ml)中，加入碳酸钾(4.5g，32.6mmol)和碘化钾(0.27g，1.63mmol)，80℃搅拌10min，逐滴滴加含有化合物1(5.68g，16.3mmol)的干燥的dmf(5ml)溶液，在该温度下搅拌过夜。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将混合物溶于乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析得到无色油状物化合物2(1.82g，31.0％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)7.63(s，2h)，7.15(s，2h)，4.20-4.14(t，j＝3.2hz，2h)，3.85(s，3h)，3.74(m，8h)，3.69(s，4h)，3.62(t，j＝4.4hz，2h)，3.48-3.38(s，1h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)166.95，149.94，138.14，126.36，109.59，72.88，72.27，70.50，70.43，70.19，70.14，69.89，61.57，52.13.

根据化合物2的合成方法合成化合物3。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)7.30(s，2h)，4.22(m，6h)，3.88(m，7h)，3.84-3.78(t，j＝4.8hz，2h)，3.77-3.70(m，8h)，3.66(m，14h)，3.60(m，2h)，3.57-3.52(m，4h)，3.38(s，6h)，2.80(s，h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)166.54，152.23，142.47，124.93，108.94，72.58，72.41，71.89，70.77，70.64，70.59，70.51，70.47，70.29，69.57，68.79，61.64，58.96，52.13.

化合物3(1.0g，1.53mmol)溶于thf(10ml)，慢慢滴加含有12％naoh的水溶液(5ml)，在室温下搅拌过夜。盐酸调节ph至3，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂。以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行柱层析得到淡黄色油状物化合物4(0.93g，95.0％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)7.34(s，2h)，4.23(m，6h)，3.88(m，4h)，3.84-3.79(t，j＝5.2hz，2h)，3.74(m，8h)，3.67(m，14h)，3.61(t，j＝4.8hz，2h)，3.58-3.53(m，4h)，3.38(s，6h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)169.63，152.21，142.80，124.53，109.36，72.57，72.42，71.90，70.76，70.64，70.58，70.50，70.46，70.27，69.62，68.78，61.61，58.97.

化合物4(1.9g，2.97mmol)和炔丙胺(0.66g，11.98mmol)溶于二氯甲烷(20ml)，搅拌均匀，缓慢滴加含有edcl(0.68g，3.55mmol)和dmap(0.036g，0.295mmol)的二氯甲烷(10ml)，滴加完毕后，室温反应过夜。反应结束后，饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行柱层析得到淡黄色油状物化合物5(1.51g，75.2％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)7.14(s，2h)，6.95(t，j＝5.2hz，1h)，4.21(m，8h)，3.87-3.81(t，j＝4.8hz，4h)，3.81-3.77(t，j＝4.8hz，2h)，3.74-3.58(m，24h)，3.57-3.52(m，4h)，3.36(s，6h)，2.80(t，j＝6.0hz，1h)，2.27(t，j＝2.4hz，1h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)166.66，152.40，141.76，128.85，107.62，79.92，72.50，72.34，71.89，71.39，70.65，70.63，70.61，70.49，70.42，70.37，69.73，69.12，61.71，58.95，29.66.

化合物5(2.0g，2.96mmol)和四溴化碳(1.18g，3.6mmol)溶于二氯甲烷(20ml)，搅拌均匀，在0℃逐滴滴加含有三苯基磷(1.16g，4.42mmol)的二氯甲烷(5ml)，滴加完毕后，继续反应4h。反应结束后，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行柱层析得到淡黄色油状物化合物6(1.83g，83.7％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)7.15(s，2h)，7.09(t，j＝5.2hz，1h)，4.26-4.14(m，8h)，3.87-3.76(m，8h)，3.75-3.61(m，20h)，3.58-3.51(m，4h)，3.47(t，j＝6.4hz，2h)，3.36(s，6h)，2.27(t，j＝2.4hz，1h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)166.61，152.37，141.65，128.86，107.53，79.97，72.35，71.87，71.33，71.15，70.69，70.63，70.60，70.54，70.49，70.40，69.70，69.05，58.91，30.37，29.61.

化合物6(1.3g，1.76mmol)和三苯基磷(1.5g，5.72mmol)加入到50ml的圆底烧瓶中，直接加热至90℃，三苯基磷融化，在该温度下搅拌24h。反应结束后，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行柱层析得到淡黄色油状物化合物7(1.58g，97.5％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.37(t，j＝5.6hz，1h)，7.79-7.60(m，15h)，7.33(s，2h)，4.29-4.14(m，8h)，3.97-3.79(m，8h)，3.78-3.73(t，j＝4.8hz，2h)，3.69(m，4h)，3.67-3.55(m，10h)，3.52(m，4h)，3.42-3.36(m，2h)，3.34(s，6h)，3.33-3.28(m，2h)，3.27-3.22(m，2h)，2.15(t，j＝2.4hz，1h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)166.46，151.89，140.51，134.74，134.72，133.80，133.70，130.11，129.99，128.97，119.00，118.14，107.14，80.85，77.54，72.22，71.75，70.66，70.45，70.40，70.29，70.26，70.16，70.07，69.58，68.78，63.82，63.74，58.85，29.18，25.49，24.96.hrms(maldi)：m/z[m]calcdforc50h67no13p⁺920.4345；found920.4348.

实施例二：合成^mito-pnps，合成路线见附图1

化合物7(129mg，0.14mmol)、^azidepsse-i(100mg，0.14mmol)、抗坏血酸钠(2.8mg，0.014mmol)和无水硫酸铜(2.2mg，0.0014mmol)溶解在四氢呋喃/水(4ml/1ml)的混合溶液中，室温反应24h。反应结束后，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行柱层析得到黑绿色固体化合物^mitops(0.15g，65.6％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.99(s，1h)，8.17(s，1h)，8.08(s，1h)，7.81-7.56(m，18h)，7.53-7.41(m，2h)，7.34(s，2h)，7.13(d，j＝8.8hz，1h)，6.75(d，j＝15.6hz，1h)，6.64(d，j＝16.0hz，1h)，4.86-4.66(m，4h)，4.45(s，2h)，4.15(m，6h)，3.92-3.71(m，10h)，3.66(m，4h)，3.64-3.53(m，10h)，3.50(m，4h)，3.38-3.30(m，8h)，3.26(m，2h)，3.21(m，2h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)166.76，158.70，157.36，157.29，151.96，138.39，149.90，145.88，140.51，138.39，134.76，134.74，134.49，133.88，133.78，130.47，130.17，130.04，129.35，128.79，127.21，125.76，124.80，124.44，122.66，122.06，119.19，118.33，117.70，116.19，112.28，107.15，86.12，77.27，72.31，71.88，70.95，70.56，70.50，70.42，70.37，70.20，70.10，69.70，68.75，66.71，63.90，63.83，58.98，49.36，35.64，29.69，25.31，24.78.hrms(maldi)：m/z[m]calcdforc72h80i2n6o15sep⁺1633.2668；found1633.2675.

化合物^mitops(0.15g，91.8μmol)和碳酸钾(0.051g，0.37mmol)依次加入到干燥的dmf/ch3cn(2ml/2ml)中，80℃搅拌10min，缓慢滴加含有(54mg，0.18mmol)的dmf/ch3cn(0.5ml/0.5ml)混合溶液，滴加完毕后，继续反应4h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行柱层析得到红色固体化合物5(0.158g，93.0％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.46(t，j＝6.0hz，1h)，8.15(d，j＝2.4hz，1h)，8.05(s，1h)，7.98(s，2h)，7.90-7.84(d，j＝8.0hz，2h)，7.79-7.68(m，9h)，7.68-7.59(m，10h)，7.30(m，2h)，7.25(dd，j＝8.8，2.4hz，1h)，7.13-7.07(d，j＝16.0hz，1h)，6.94-6.87(d，j＝16.0hz，1h)，5.04(s，2h)，4.80-4.68(m，4h)，4.46(t，j＝4.8hz，2h)，4.27-4.19(t，j＝4.8hz，4h)，4.17(t，j＝5.2hz，2h)，3.95-3.84(m，4h)，3.81(t，j＝4.4hz，4h)，3.78-3.72(t，j＝4.8hz，2h)，3.68(m，5h)，3.67-3.56(m，10h)，3.55-3.48(m，4h)，3.41-3.32(m，8h)，3.29(m，2h)，3.23(m，2h)，1.36(s，12h).¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ(ppm)166.65，158.44，157.92，157.58，152.03，148.85，145.84，140.61，138.79，138.73，134.92，134.75，134.72，133.94，133.84，133.52，130.81，130.15，130.02，129.29，128.75，127.51，127.31，126.02，124.19，122.38，119.18，118.32，117.10，115.50，112.40，107.04，91.79，83.86，77.32，74.52，72.32，72.03，71.86，70.85，70.55，70.51，70.42，70.39，70.15，69.66，68.83，66.91，63.93，63.85，59.00，49.31，35.38，29.69，25.49，24.96，24.88.hrms(maldi)：m/z[m]calcdforc85h97bl2n6o17sep⁺1849.3990；found1849.4009.

为了进一步探究线粒体靶向光敏剂定位至病患细胞线粒体的能力，我们使用商业的线粒体探针进行对比，结果二者荧光高度重合，皮尔森系数高达95％，说明^mito-pnps的线粒体靶向性非常好。

为了进一步探究线粒体靶向光敏剂在刺激响应前后的光动力，使用9，10-二甲基蒽(dma)作为单线态氧探针对其进行定量测试。测试条件为氙灯光源490-700nm，功率为5mw/cm²，溶液中含有dma(60μm)，^mito-pnps(2.5μm)，dmf(5％)，f127(0.3％)，ph为7.4，刺激响应前后光动力能力如附图3所示，刺激响应前dma的变化量和对照组(无光敏剂)几乎一致，刺激响应后，dma的变化量骤然增加，这标志着刺激响应前光动力完全被抑制，刺激响应后光动力的恢复。

为了更进一步探究光敏剂对病患细胞的杀伤作用，利用mtt法研究了^mito-pnps在光照条件下对raw264.7细胞的毒性，结果如附图5所示，^mito-pnps在与线粒体中过表达的oono^-相互作用后生成具有光毒性的^mitops，在光照条件下杀死病患细胞。

以上所述仅为本发明的优选实施例，凡依照本发明做出的等同于替代或变换(例如，以^mitops为底物，分别醚化不同的响应基团)，均在本发明的保护范围之内。