阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险评估试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学和基因检测
技术领域：
，尤其涉及一种阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险评估试剂盒及其应用。
背景技术：
：阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructivesleepapnea，osa)是睡眠期间周期性上呼吸道阻塞致呼吸暂停和低通气，引起反复的低氧血症，其临床表现为睡眠过程中频繁出现呼吸暂停并伴随响亮鼾声。目前认识到osa是一种全身性疾病。2008年美国心脏协会(aha)发表科学声明指出，osa是高血压、冠心病、心力衰竭、心律失常、卒中等心脑血管病新认识到的、可干预的独立危险因素。2015esc室性心律失常管理和心脏性猝死预防指南指出：睡眠呼吸暂停综合征减少血氧饱和度是心脏病猝死的危险因素。目前，osa已成为一种越来越常见的临床疾患，最新的《睡眠白皮书》显示我国20.4％的成人患有osa，其高度疾病负担与其自身的医疗成本及其作为心血管、代谢、精神疾病(如高血压、中风、糖尿病、抑郁症等)的独立危险因素密切相关，因此，阻塞性睡眠呼吸暂停已成为一个具有全球影响的重大公共卫生问题。在临床实践中，多导睡眠图被公认为是睡眠障碍监测的“金标准”，但是其局限性也相当明显，主要体现为：(1)监测需要在专门的场所进行，患者需要留院，医疗费用较高；(2)患者需要佩戴大量的传感器，易引起患者不适，干扰患者正常睡眠；(3)正规监测需要整夜不少于七小时的睡眠，需配备专人通宵值守，整夜观察监视器，人力成本高；(4)采集数据量大，多导睡眠图得到的结果需要专业人员根据知识经验进行人工校正，实时性不强。上述这些因素限制了多导睡眠图的推广应用，使其无法在家庭使用中得到普及，导致阻塞性睡眠呼吸暂停难以得到充分的早期预测、诊断及治疗。此外，除了上述多导睡眠监测方法外，目前市场上尚未出现专门针对阻塞性睡眠呼吸暂停的基因检测类产品。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种用于评估阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险的基因检测试剂盒。本发明公开了一种阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险评估试剂盒，所述试剂盒中包含下述试剂：(1)对选定基因tnf-α、adipoq、pparγ中的一个或多个单核苷酸多态位点进行核酸质谱检测的聚合酶链反应(pcr)反应试剂；(2)虾碱性磷酸酶(sap)反应试剂；(3)延伸反应试剂。进一步地，上述选定基因tnf-α、adipoq、pparγ中的单核苷酸多态位点如下：(1)tnf-α：rs3093661、rs3093662、rs3093664；(2)adipoq：rs2241766、rs3774262、rs1063537、rs2082940、rs4686803；(3)pparγ：rs1801282。表1阻塞性睡眠呼吸暂停相关的基因和位点进一步地，本发明试剂盒中包含针对所述的选定基因tnf-α、adipoq、pparγ中的单核苷酸多态位点设计的pcr扩增引物和特异性延伸引物，所述pcr扩增引物和特异性延伸引物序列如下：(1)rs3093661位点：正向引物seqidno:1，反向引物seqidno:2，特异性延伸引物seqidno:3；(2)rs3093662位点：正向引物seqidno:4，反向引物seqidno:5，特异性延伸引物seqidno:6；(3)rs3093664位点：正向引物seqidno:7，反向引物seqidno:8，特异性延伸引物seqidno:9；(4)rs2241766位点：正向引物seqidno:10，反向引物seqidno:11，特异性延伸引物seqidno:12；(5)rs3774262位点：正向引物seqidno:13，反向引物seqidno:14，特异性延伸引物seqidno:15；(6)rs1063537位点：正向引物seqidno:16，反向引物seqidno:17，特异性延伸引物seqidno:18；(7)rs2082940位点：正向引物seqidno:19，反向引物seqidno:20，特异性延伸引物seqidno:21；(8)rs4686803位点：正向引物seqidno:22，反向引物seqidno:23，特异性延伸引物seqidno:24；(9)rs1801282位点：正向引物seqidno:25，反向引物seqidno:26，特异性延伸引物seqidno:27。表2引物序列表优选地，本发明试剂盒中包含的pcr反应试剂包括蒸馏水、缓冲液、mgcl2、pcr正向引物、pcr反向引物、dntp、人源基因组dna和dna聚合酶。优选地，本发明试剂盒中包含的sap反应试剂包括蒸馏水、缓冲液和虾碱磷酸酶。优选地，本发明试剂盒中包含的延伸反应试剂包括蒸馏水、缓冲液、延伸引物、终止混合物和单碱基延伸酶。进一步地，本发明还公开了上述试剂盒的使用方法，包含以下步骤：(1)采集样本，提取受检者dna；(2)进行pcr扩增反应；(3)进行sap反应；(4)进行单碱基延伸反应；(5)树脂纯化；(6)芯片点样及质谱检测确定所述单核苷酸多态位点的基因型。进一步地，本发明还公开了上述试剂盒在评估阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险中的应用，包括以下步骤：(1)采用or值评估各个单核苷酸多态位点的基因型与疾病的关联程度；(2)采用grs算法评估多个单核苷酸多态位点联合与疾病遗传风险之间的关系，grs计算公式如下：其中：βi为第i个基因位点对应的权重，gi为第i个基因位点所携带的风险等位基因的个数。本发明的有益效果：本发明选取多个阻塞性睡眠呼吸暂停相关基因进行snp位点检测，建立了一套阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险检测方法，能够从整体上评估阻塞性睡眠呼吸暂停的遗传状况，可针对高危人群进行全面的风险评估和有效的早期防治。另外，本发明试剂盒及方法具有操作简单、准确率高、高通量、检测成本低等优点，改变了目前临床中由于多导睡眠检测仪的使用限制，导致阻塞性睡眠呼吸暂停无法得到及时有效的诊断和治疗的现状。附图说明图1为本发明研究的流程图。图2为多位点联合与疾病之间的关系示意图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
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的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1本发明阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险评估试剂盒的使用步骤一、纳入受试者(附图1显示了本发明研究的流程图)阻塞性睡眠呼吸暂停的诊断根据《国际睡眠障碍疾病分类(第三版)》的规定：纳入标准：经psg检测ahi≥15次/h者或psg检测ahi≥5次/h并且有如下几类症状之一者：(1)嗜睡、疲劳、失眠；(2)睡眠中憋醒；(3)其他观察者发现被观察者有打鼾或呼吸暂停；(4)被诊断为高血压、认知障碍、情感障碍、冠心病、脑卒中、充血性心衰、2型糖尿病、房颤。排除标准包括：上气道阻力综合征，慢阻肺，肥胖低通气综合征，发作性睡病，不宁腿综合征和睡眠中周期性腿动，充血性心力衰竭，妊娠，癌症，急性传染病，肝功能障碍或肾功能异常的患者。共纳入183例对照，874例osa患者，两组除在总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血糖、吸烟、饮酒情况方面差异无统计学意义外(allp＞0.05)，在性别分布、年龄、bmi、收缩压、舒张压、甘油三酯水平等差异均有统计学意义(allp＜0.05)，见表3。表3研究人群描述项目对照组osa组p-value样本量(n)183874-年龄(y)50.4±14.352.7±12.20.026bmi(kg/m2)24.6±3.927.8±3.9<0.001sbp(mmhg)126.9±19.7131.2±18.70.005dbp(mmhg)78.0±14.381.5±14.00.003hdl-c(mmol/l)1.2±0.31.2±0.80.584ldl-c(mmol/l)2.7±0.82.7±1.00.928tc(mmol/l)4.5±1.14.6±2.30.532tg(mmol/l)1.6±1.22.0±1.80.001glu(mmol/l)5.4±1.76.6±20.40.405男:女60:123136:738<0.001吸烟0.3420112(61.2％)501(57.4％)171(38.8％)372(42.6％)饮酒0.0660113(61.7％)472(54.3％)170(38.3％)397(45.7％)步骤二、采集受试者dna样本样本dna的提取：参照核酸提取试剂盒厂家的说明书，对病例组和对照组的全血进行dna的提取。步骤三、pcr反应以步骤(二)提取得到的dna样本为模板，使用试剂盒中的pcr反应组件，进行pcr扩增，获得靶标位点的pcr产物，每个反应体系总体积为5.0μl。包括：2.5-50ng/μldna2.0μl、5u/μltaqdna聚合酶0.2μl、0.5μmol/l引物混合物1.0μl、25mmol/ldntp混合物0.1μl、25mmol/lmgcl20.4μl、10×pcrbuffer0.5μl、去离子水0.8μl。反应条件为：95℃2min→(95℃30s→56℃30s→72℃60s，45循环)→72℃5min→4℃保持。步骤四、pcr产物纯化在pcr反应结束后，使用本试剂盒中的sap反应液对pcr产物进行纯化，消除步骤(三)反应体系中剩余dntp，每个pcr产物纯化反应体系总体积为7.0μl，包括：步骤(三)中终产物5.0μl、1.7u/μl虾碱性磷酸酶(sap)0.3μl、sapbuffer0.17μl、去离子水1.53μl。反应条件为：37℃40min→85℃5min→4℃保持。步骤五、dna测序反应使用本试剂盒中的pcr单碱基延伸反应组件，对步骤(四)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物。每个pcr单碱基延伸反应体系总体积为9.0μl。包括：步骤(四)中终产物7.0μl、iplex酶0.04μl、特异性延伸引物混合物0.94μl、iplex终止液0.2μl、iplexbuffer0.2μl、去离子水0.62μl。反应条件为：95℃30s→(95℃5s→52℃5s→80℃5s，40循环)→72℃3min→4℃保持。步骤六、脱盐树脂纯化延伸产物脱盐，点样到芯片。在样本板的每一个有样本的孔里加入16μl去离子水。加入6mg洁净树脂。用膜把板封好，放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。然后用点样仪点样；步骤七、massarray质谱获取数据将点样处理好的芯片放入质谱仪，进行质谱飞行并根据峰型分析结果，判断基因型。实施例2阻塞性睡眠呼吸暂停遗传易感风险评估分析方法步骤一、采集受试者dna，由专业人员采集受试者血样样本2ml。步骤二、基因分型检测。使用本发明提供的试剂盒，按实施例1中相关步骤，对受试者基因组所携带所述单核苷酸多态位点进行dna测序分析，确定基因型。步骤三、对所述单核苷酸多态位点基因型进行相对风险(or)赋值，部分风险基因位点列表与权重见表4。表4风险基因位点列表与权重基因snp位点riskalleleor(95％ci)p-valueadipoqrs1063537t1.736(1.056-2.853)0.030adipoqrs2082940t1.699(1.043-2.769)0.033adipoqrs4686803t1.830(1.109-3.021)0.018adipoqrs2241766g1.833(1.112-3.021)0.018adipoqrs3774262a1.830(1.109-3.021)0.018tnf-αrs3093661a4.129(1.069-15.952)0.040tnf-αrs3093662g4.457(1.168-17.002)0.029tnf-αrs3093664g4.144(1.074-15.987)0.039pparγrs1801282c2.181(1.052-4.523)0.036步骤四、单个位点的or值得到之后，采用grs算法评估多位点联合与疾病之间的关系，见附图2。步骤五、通过鉴定受试者基因型，出具个体发生阻塞性睡眠呼吸暂停的遗传易感风险分析报告。以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。sequencelisting<110>北京市心肺血管疾病研究所<120>阻塞性睡眠呼吸暂停遗传风险评估试剂盒及其应用<130>2019<160>27<170>patentinversion3.3<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<400>1acgttggatgtcatccactctcccacccaa30<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<400>2acgttggatgatcagcgcacatctttcacc30<210>3<211>17<212>dna<213>人工序列<400>3tctctctccctctcttg17<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列<400>4acgttggatgaagacactcagggaaagagc30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<400>5acgttggatgggtgtctggttttctctctc30<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6ggttttctctctccattcatc21<210>7<211>30<212>dna<213>人工序列<400>7acgttggatgagctctgaggatgtgtcttg30<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<400>8acgttggatgagcgagtccttctcacattg30<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<400>9catcagccgggcttcaa17<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列<400>10acgttggatgagtgcacatgtggattccag30<210>11<211>30<212>dna<213>人工序列<400>11acgttggatgccttgagtcgtggtttcctg30<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12gagtggtttcctggtcatg19<210>13<211>30<212>dna<213>人工序列<400>13acgttggatgattatgggagcctccatgtc30<210>14<211>30<212>dna<213>人工序列<400>14acgttggatgagaaaccaataagagctccc30<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列<400>15gtctgtgggagatatagaagga22<210>16<211>30<212>dna<213>人工序列<400>16acgttggatggttgaggtagttgatggtgg30<210>17<211>30<212>dna<213>人工序列<400>17acgttggatggctatttactctgtttttgc30<210>18<211>21<212>dna<213>人工序列<400>18aacaatgactccagtgatgtt21<210>19<211>29<212>dna<213>人工序列<400>19acgttggatgcagagtaaatagcattctc29<210>20<211>31<212>dna<213>人工序列<400>20acgttggatgccttaatgattagcaatacac31<210>21<211>23<212>dna<213>人工序列<400>21tctttttgcttacagttttaaat23<210>22<211>30<212>dna<213>人工序列<400>22acgttggatgtaagatggagtttccctctg30<210>23<211>30<212>dna<213>人工序列<400>23acgttggatgatggtggtaggcacctgtgg30<210>24<211>19<212>dna<213>人工序列<400>24tacctatgcctcccaggtt19<210>25<211>30<212>dna<213>人工序列<400>25acgttggatgcaaacccctattccatgctg30<210>26<211>30<212>dna<213>人工序列<400>26acgttggatgtgtatcagtgaaggaatcgc30<210>27<211>18<212>dna<213>人工序列<400>27tgaaggaatcgctttctg18当前第1页12