本发明涉及一种猪肺炎支原体nj株新型灭活方法。
背景技术：
：在灭活疫苗生产中，通常要用到微生物灭活剂使活疫苗失去感染能力，同时保持其抗原性。常见的灭活剂有甲醛和硫柳汞。甲醛是比较传统的灭活剂，其灭活病毒能达到很好的效果，但是甲醛灭活不仅灭活了病毒也破坏了病原体的免疫原性，并且甲醛灭活时间比较长，易受温度、ph值、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生应激性反应。硫柳汞作为防腐剂，常用作支原体的灭活，硫柳汞本身毒性较大，操作过程中需注意对使用人员的自身保护。目前尚没有一种灭活效果好、对免疫原性无害且对人体毒性小的猪肺炎支原体灭活方法。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种猪肺炎支原体灭活方法。本发明的技术方案包括：一种猪肺炎支原体灭活方法，它是将终浓度3mm的二乙烯亚胺与猪肺炎支原体菌液混合，37℃下孵育24h，再使用硫代硫酸钠中和二乙烯亚胺。一种猪肺炎支原体灭活方法，所述支原体为nj株。一种猪肺炎支原体灭活疫苗的制备方法，它是使用前述方法对猪肺炎支原体灭活后，用道达尔a130乳化，即得。前述制备方法所得到的猪肺炎支原体灭活疫苗。本发明的二乙烯亚胺可以对猪肺炎支原体起到有效的灭活作用，并能维持较高的免疫原性，特别适合于灭活疫苗生产。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。具体实施方式实施例1二乙烯亚胺(bei)的制备预先配置100ml0.2mnaoh溶液，称取2.05gbea，将bea粉末加入100ml0.2mnaoh溶液中，然后密闭容器，空腔体积不能过大(建议不要超过1/2)。37℃搅拌环化1h，ph应该由12.5降低到8.5，环化完成。调节ph到7.5～7.6(尽量靠近7.6)，0.22μm无菌过滤保存。此时bei的浓度为0.1m。实施例2猪肺炎支原体灭活(一)方法1.菌液灭活取三批猪肺炎支原体菌液各50ml，第一批按照终浓度为3mmbei灭活猪肺炎支原体，添加灭活剂母液1.5ml；第二批按照终浓度为0.15％甲醛溶液灭活猪肺炎支原体，添加灭活剂母液75ul。第三批按照终浓度为0.005％硫柳汞灭活猪肺炎支原体，添加灭活剂2.5ug。三批同时放置于37℃恒温摇床，24h后取样，第一批灭活完成后使用硫代硫酸钠中和bei，硫代硫酸钠的浓度为1m，添加量为bei添加量的10％(体积比)。样品中和后，分别取样进行灭活检验。2.灭活疫苗的制备及效力检测三批猪肺炎支原体菌液经过检验均灭活彻底，使用道达尔a130乳化三批疫苗。疫苗检测合格，开展效力实验，将25头健康易感仔猪随机分成5组，每组5头。第1～3组为疫苗免疫组，第4组为攻毒对照组，第5组为空白对照组。试验的分组及设计如下表：首免后35日，连同攻毒对照猪5头，用生理盐水稀释的猪肺炎支原体js株组织强毒，经气管内注射攻毒，每头5ml。空白对照组不攻毒，攻毒28日后，剖检所有试验猪，观察肺病变，按猪支原体肺炎肺病变指数记分标准判定。攻毒对照组肺病变指数算术平均值不小于10，判为试验成立；按猪支原体肺炎疫苗免疫组猪肺病变指数减少率计算，疫苗免疫组猪肺病变指数减少率不低于60％，判为疫苗合格。(二)结果1.猪肺炎支原体灭活检验三批灭活液分别取1ml接种于装有50mldb-124培养液的t75细胞瓶中，观察5日，未发现颜色改变；同时从两批t75细胞瓶中取0.5ml接种于4.5ml的db-124培养液中，连续观察10，三组支原体灭活液颜色均未改变，灭活彻底。具体见下表：组别灭活方法灭活剂浓度灭活温度灭活时间/24h第一组bei3mmol/l终浓度37℃-第二组甲醛0.15％37℃-第三组硫柳汞0.005％37℃-*+：为灭活失败-：为灭活成功2.猪肺炎支原体效力检验结果攻毒后28天剖检所有试验猪，观察肺病变，并进行评分，结果如下表：攻毒对照组猪肺病变指数算术平均值＝22第一组免疫攻毒组算数平均值＝6.8第二组免疫攻毒组算数平均值＝14.2第三组免疫攻毒组算数平均值＝12.2第一免疫组猪肺病变指数减少率＝69.1％，大于60％，因此bei灭活的猪肺炎支原体灭活疫苗达到保护效果。第二免疫组猪肺病变指数减少率＝35.5％，小于60％，因此甲醛灭活的猪肺炎支原体灭活疫苗未能达到保护效果。第三免疫组猪肺病变指数减少率＝44.5％，小于60％，因此硫柳汞灭活的猪肺炎支原体灭活疫苗未能达到保护效果。(三)结论三种方法均能达到灭活的目的，但bei灭活的猪肺炎支原体灭活疫苗能最大程度维持免疫原性，达到最佳的保护效果。综上，本发明的灭活剂可以有效灭活猪肺炎支原体，并维持其免疫原性，可用于相关灭活疫苗的制备，具有良好的应用前景。当前第1页12