流动池的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月29日提交的美国临时申请系列号62/692,511和2018年10月9日提交的美国临时申请系列号62/743,373的权益，所述临时申请的每一项的内容通过引用以其整体并入本文。

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本申请涉及流动池，包含流动池的试剂盒和用于制备流动池的方法。

背景

用于对核酸测序的一些可用的平台利用合成测序方法。利用该方法，合成新生链，并且以光学上和/或电学方式检测每种单体(例如核苷酸)向生长的链的添加。因为模板链指导新生链的合成，技术人员可以从在合成期间添加到生长的链的一系列核苷酸单体推断出模板dna的序列。在一些实例中，可以使用配对末端测序，其中正向链被测序和去除，并且然后反向链被构建和测序。

引言

本文公开的第一方面是流动池，所述流动池包括：基底；第一引物组，其被附接至基底上的第一区域，所述第一引物组包括不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物；和第二引物组，其被附接至基底上的第二区域，所述第二引物组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物。

在第一方面的实例中，第一区域包含具有第一官能团的材料；并且第二区域包含具有不同于第一官能团的第二官能团的材料。

在第一方面的实例中，流动池还包括分隔第一引物组与第二引物组的空隙(gap)。

在第一方面的实例中，基底包括由间隙区域分隔的凹陷(depression)；并且各个凹陷包括：位于第一部分的第一区域；和位于第二部分的第二区域。在该实例的一个版本中，流动池还可以包括分隔第一区域与第二区域的空隙。在该实例的另一个版本中，第一区域和第二区域部分地重叠。在该实例的仍另一个版本中，第一部分和第二部分具有不同的深度。在该实例的另外的版本中，第一区域和第二区域是嵌段共聚物的不同嵌段。

在第一方面的实例中，基底包括由间隙区域分隔的凹陷；各个凹陷包括第一区域；并且第二区域位于至少一些间隙区域上。

在第一方面的实例中，第一区域包含第一聚合物，并且第一引物组被接枝到第一聚合物；并且第二区域包含第二聚合物，并且第二引物组被接枝到第二聚合物。在该实例的一个版本中，流动池还包括在第一引物组和在第一聚合物上的保护涂层。在该实例的另一个版本中，第一聚合物是基底上的第一层；第二聚合物是第一层上的第二层；所述流动池还包括：第二层上的钝化树脂；以及在钝化树脂、第二聚合物和第一聚合物中限定的特征；并且第一引物组和第二引物组各自暴露在各个特征处。

在第一方面的实例中，基底包括由间隙区域分隔的凹陷；各个凹陷包括：第一区域位于的第一部分；和第二部分；并且流动池还包括位于第二部分中的珠，其中第二区域在珠的表面。

在第一方面的实例中，可裂解的第一引物包括第一裂解位点，可裂解的第二引物包括第二裂解位点，并且第一裂解位点和第二裂解位点是相同类型的。在该实例的一个版本中，不可裂解的第一引物、可裂解的第二引物、可裂解的第一引物和可裂解的第二引物各自包括相应的接头；第一可裂解的引物的第一裂解位点沿其接头定位；并且第二可裂解的引物的第二裂解位点沿其接头定位。

在第一方面的实例中，可裂解的第一引物包括第一裂解位点，可裂解的第二引物包括第二裂解位点，并且第一裂解位点和第二裂解位点是不同类型的。在该实例的一个版本中，不可裂解的第一引物、可裂解的第二引物、可裂解的第一引物和可裂解的第二引物各自包括相应的接头；第一可裂解引物的第一裂解位点沿其接头定位；并且第二可裂解引物的第二裂解位点沿其接头定位。

在第一方面的实例中，第一引物组被附接至第一支撑结构；第一区域是被附接至第一支撑结构的第一捕获位点；第二引物组被附接至不同于第一支撑结构的第二支撑结构；并且第二区域是被附接至第二支撑结构的第二捕获位点。

应当理解，本文公开的第一方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。

本文公开的第二方面是一种流动池，所述流动池包括：第一基底；被附接至第一基底的第一引物组，所述第一引物组包括不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物；与第一基底相对的第二基底；和被附接至第二基底的第二引物组，所述第二引物组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物。

应当理解，第二方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第三方面是一种试剂盒，所述试剂盒包括流动池和引发流体，所述流动池包括：基底，所述基底包括由间隙区域分隔的凹陷；在各个凹陷中的第一聚合物层，其中第一聚合物层的一些官能团被封端；第一引物组，其被附接至各个凹陷中的第一聚合物层的其他官能团；和间隙区域上的第二聚合物层；所述引发流体包括：流体载体；和不同于第一引物组的第二引物组。

在第三方面的实例中，第一引物组包括不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物；并且第二引物组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物。

应当理解，第三方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第三方面和/或第二方面和/或第一方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第四方面是一种方法，所述方法包括将模板流体引入流动池，所述流动池包括：基底，所述基底包括由间隙区域分隔的凹陷；在各个凹陷中的第一聚合物层，其中第一聚合物层的暴露的官能团被封端；被附接至各个凹陷中的第一聚合物层的第一引物组，所述第一引物组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物；和间隙区域上的第二聚合物层；由此来自模板流体的模板被扩增以在至少一些凹陷中形成簇；将包含不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物的引发流体引入流动池，由此不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到第二聚合物层；以及启动从簇到不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物的桥扩增，从而在至少一些间隙区域上形成第二簇。

应当理解，第四方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第四方面和/或第三方面和/或第二方面和/或第一方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第五方面是一种方法，所述方法包括：将模板流体引入流动池，所述流动池包括：基底，所述基底包括由间隙区域分隔的凹陷；各个凹陷中的第一聚合物层；被附接至第一聚合物层的第一引物组，所述第一引物组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物；第一聚合物层和第一引物组上的任选的保护涂层；间隙区域上的第二聚合物层；和被附接至第二聚合物层的第二引物组，所述第二引物组包括不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物；由此来自模板流体的模板被扩增以在至少一些凹陷中和在至少一些间隙区域上形成簇；以及裂解可裂解的第一引物和可裂解的第二引物。

应当理解，第五方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第五方面和/或第三方面和/或第二方面和/或第一方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第六方面是一种流动池，所述流动池包括：支撑物；支撑物上的图案化树脂，所述图案化树脂包括由间隙区域分隔的第一凹陷和第二凹陷，第一凹陷具有比第二凹陷更小的开口尺寸；被附接在至少一些第一凹陷中的第一引物组；以及分别位于至少一些第二凹陷中的官能化珠，所述官能化珠包括被附接在核心结构的表面的第二引物组，其中第二引物组不同于第一引物组。

在第六方面的实例中，官能化珠的核心结构选自由二氧化硅、超顺磁性材料、聚苯乙烯和丙烯酸酯组成的组。

在第六方面的实例中，图案化树脂选自由以下组成的组：笼状聚倍半硅氧烷树脂(polyhedraloligomericsilsesquioxaneresin，poss)基树脂、环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂及其组合。

在第六方面的实例中，所述流动池还在第一凹陷和第二凹陷中包括聚合物，并且其中第一引物组被附接至在至少一些第一凹陷中的聚合物。在该实例的一个版本中，官能化珠位于至少一些第二凹陷中的聚合物上。在该实例的另一个版本中，第一引物组也被附接至至少一些第二凹陷中的聚合物；并且官能化珠位于至少一些第二凹陷中的第一引物组上。

在第六方面的实例中，第一引物组包括第一引物和尿嘧啶修饰的第二引物；并且第二引物组包括尿嘧啶修饰的第一引物和第二引物。

应当理解，本文公开的第六方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。

本文公开的第七方面是一种流动池，所述流动池包括：支撑物；支撑物上的图案化树脂，所述图案化树脂包括由间隙区域分隔的凹陷；被附接至至少一些凹陷的第一引物组；被放置在所述至少一些凹陷中使得所述第一引物组的至少一些引物被暴露的官能化珠，所述官能化珠包括被附接在核心结构的表面的第二引物组，其中第二引物组不同于第一引物组。

在第七方面的实例中，各个凹陷包括第一部分和第二部分，所述第一部分具有大于或等于官能化珠的直径的第一开口尺寸，所述第二部分具有小于官能化珠的直径的第二开口尺寸；并且官能化珠位于至少一些凹陷中的各个凹陷的第一部分。

在第七方面的实例中，官能化珠的核心结构选自由二氧化硅、超顺磁性材料、聚苯乙烯和丙烯酸酯组成的组。

在第七方面的实例中，图案化树脂选自由以下组成的组：笼状聚倍半硅氧烷树脂(poss)基树脂、环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂及其组合。

在第七方面的实例中，所述流动池还在凹陷中包括聚合物。在该方面的一个版本中，第一引物组被附接至未被官能化珠占据的聚合物的部分。在该版本的一个实例中，第一引物组被附接至凹陷中的聚合物；并且官能化珠位于第一引物组的一些其他引物上。

应当理解，本文公开的第七方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。

本文公开的第八方面是一种方法，所述方法包括：选择性地将聚合物施加于支撑物上的图案化树脂的凹陷中；将第一引物组接枝到在至少一些凹陷中的聚合物；以及在接枝第一引物组之前或之后，将官能化珠沉积在i)至少一些凹陷中的各个凹陷的一部分中，或沉积在ii)具有比至少一些凹陷的开口尺寸更大的开口尺寸的第二凹陷中，所述官能化珠包括被附接在核心结构的表面的第二引物组，其中第一引物组和第二引物组不同。

在第八方面的实例中，其中在沉积官能化珠之前，所述方法还包括通过将第二引物组附接至核心结构来形成官能化珠。

在第八方面的实例中，至少一些凹陷中的各个凹陷的所述部分具有大于或等于各个官能化珠的直径的开口尺寸；所述至少一些凹陷包括与所述部分互连的第二部分，其中第二部分具有小于各个官能化珠的直径的第二开口尺寸；并且官能化珠通过尺寸排阻自组装到至少一些凹陷的各个凹陷的所述部分中。

在第八方面的实例中，其中在选择性地施加聚合物之前，所述方法还包括通过以下在支撑物上形成图案化树脂：将树脂沉积在支撑物上；和使用纳米压印光刻术使树脂图案化。

应当理解，第八方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第八方面和/或第七方面和/或第六方面和/或第一方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第九方面是一种流动池，所述流动池包括：支撑物；支撑物上的图案化树脂，所述图案化树脂包括由间隙区域分隔的凹陷；凹陷中的图案化树脂上的嵌段共聚物，嵌段共聚物的各个嵌段具有不同于嵌段共聚物的各个其他嵌段的嵌段特异性官能团的嵌段特异性官能团；和引物，所述引物被附接至至少一个所述嵌段的嵌段特异性官能团。

在第九方面的实例中，图案化树脂选自由以下组成的组：笼状聚倍半硅氧烷树脂(poss)基树脂、环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂及其组合。在该实例的一个版本中，图案化树脂是poss基树脂，并且其中poss基树脂是交联的环氧poss树脂。在该实例的另一个版本中，嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有氨基基团作为其嵌段特异性官能团的丙烯酰胺单体；和第二嵌段，所述第二嵌段包括具有叠氮基基团作为其嵌段特异性官能团的叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体。在该其他版本的实例中，嵌段共聚物是：

其中r是氢或聚合物引发物质端基，n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。在该实例的仍另一个版本中，嵌段共聚物是：

其中n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。

在第九方面的实例中，图案化树脂是无定形的氟聚合物。在该实例的一个版本中，嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有三氟甲基基团作为其嵌段特异性官能团的单体；和第二嵌段，所述第二嵌段包括具有引物接枝官能团作为其嵌段特异性官能团的单体。

在第九方面的实例中，嵌段共聚物包含：第一嵌段，所述第一嵌段包括具有引物接枝官能团作为其嵌段特异性官能团的单体；和第二嵌段，所述第二嵌段包括调节相互作用参数以驱动第一嵌段和第二嵌段的相分离的单体。在该实例的一个版本中，引物接枝官能团是叠氮基基团；并且第二嵌段的单体的嵌段特异性官能团选自由以下组成的组：氨基基团、醇基团、芳基基团和带电基团。

在第九方面的实例中，嵌段共聚物是包含第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段的三元共聚物；第一嵌段的嵌段特异性官能团被附接至图案化树脂；第二嵌段的嵌段特异性官能团被附接至引物；并且第三嵌段的嵌段特异性官能团被附接至不同于引物的另一种引物或被附接至酶。

在第九方面的实例中，嵌段共聚物是包含第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段的三元共聚物；第一嵌段的嵌段特异性官能团被附接至图案化树脂；第二嵌段的嵌段特异性官能团被附接至引物；并且第三嵌段的嵌段特异性官能团影响嵌段共聚物的表面自由能或影响嵌段共聚物的稳定性。

在第九方面的实例中，其中凹陷选自由井和沟槽组成的组。

在第九方面的实例中，图案化树脂和嵌段共聚物各自具有从约25mn/m至约50mn/m的范围内的表面自由能。

应当理解，本文公开的第九方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第九方面和/或第一方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十方面是一种流动池，所述流动池包括：支撑物；支撑物上的图案化笼状聚倍半硅氧烷树脂(poss)基树脂，所述图案化poss基树脂包括由间隙区域分隔的凹陷；在凹陷中的图案化poss基树脂上的分离的嵌段共聚物，其中分离的嵌段共聚物的一个嵌段具有被附接至图案化poss基树脂的官能团，并且分离的嵌段共聚物的另一个嵌段具有另一个官能团；和被附接至另一个官能团的引物。

在第十方面的实例中，分离的嵌段共聚物选自由以下组成的组：

其中n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内；和

其中r是氢或聚合物引发物质端基，n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。

应当理解，本文公开的第十方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十方面和/或第九方面和/或第一方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十一方面是一种方法，所述方法包括：使树脂图案化以形成包括由间隙区域分隔的凹陷的图案化树脂；将包含嵌段共聚物的溶液引入图案化树脂，嵌段共聚物的各个嵌段具有不同于嵌段共聚物的各个其他嵌段的嵌段特异性官能团的嵌段特异性官能团；将溶液暴露于溶剂蒸气退火，由此嵌段共聚物在凹陷中相分离且自组装；和将引物接枝到至少一个所述嵌段的嵌段特异性官能团。

在第十一方面的实例中，使树脂图案化包括纳米压印光刻术。

在第十一方面的实例中，包含嵌段共聚物的溶液具有从约0.04至约0.30的范围内的flory-huggins相互作用参数。

在第十一方面的实例中，其中在接枝之前，所述方法还包括将图案化树脂暴露于固化工艺，所述图案化树脂包括凹陷中的相分离且自组装的嵌段共聚物。

应当理解，本文公开的第十一方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十一方面和/或第十方面和/或第九方面和/或第一方面的特征的任何组合可以一起被使用和/或可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十二方面是一种方法，所述方法包括：将第一官能化层施加于基底；使第一官能化层图案化，从而形成被光致抗蚀剂覆盖的第一官能化区域；将第二官能化层施加于光致抗蚀剂和基底的部分；剥离光致抗蚀剂和其上的任何第二官能化层；去除第二官能化层的一部分，从而形成邻近第一官能化区域的第二官能化区域；和将第一引物组附接至第一官能化层或第一官能化区域，并且将第二引物组附接至第二官能化层或第二官能化区域，其中第一引物组不同于第二引物组。

在第十二方面的实例中，第一引物组的附接包括在施加第一官能化层之前将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物预接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在施加第二官能化层之前将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物预接枝到第二官能化层。

在第十二方面的实例中，第一引物组的附接包括在第一官能化层施加之后将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在第二官能化层施加之后将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物接枝到第二官能化层。

在第十二方面的实例中，所述方法还包括：分别将第一自组装单层沉积在第一官能化区域上并且将第二自组装单层沉积在第二官能化区域上；其中第一引物组的附接包括将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到第一自组装单层；并且其中第二引物组的附接包括将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物接枝到第二自组装单层。

在第十二方面的实例中，其中去除包括：将第二光致抗蚀剂施加于第一官能化区域和将成为第二官能化区域的第二官能化层的第二部分；和蚀刻第二官能化层的部分。

在第十二方面的实例中，基底包括支撑物上的树脂；树脂包括由间隙区域分隔的凹陷；第一官能化区域在各个凹陷的第一部分上；第二官能化层在各个凹陷的第二部分和间隙区域上；并且所述去除包括从间隙区域抛光第二官能化层。

在第十二方面的实例中，基底包括支撑物上的树脂；树脂包括由间隙区域分隔的多级凹陷；第一官能化区域在各个多级凹陷的第一级；并且在施加第二官能化层之前，所述方法还包括：将牺牲层施加于光致抗蚀剂和树脂的部分；从树脂的部分去除牺牲层；和从多级凹陷去除树脂的区域以产生邻近第一官能化区域的地区；并且将第二官能化层施加于光致抗蚀剂上的牺牲层、施加于所述地区和施加于间隙区域。

应当理解，本文公开的第十二方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十二方面和/或第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十三方面是一种方法，所述方法包括：将第一光致抗蚀剂施加于基底，使得第一基底部分暴露；将第一官能化层施加于光致抗蚀剂和第一基底部分；剥离光致抗蚀剂和其上的任何第一官能化层，从而在第一基底部分上形成第一官能化区域；将第二光致抗蚀剂施加于第一官能化区域和基底，使得邻近第一官能化区域的第二基底部分暴露；将第二官能化层施加于第二光致抗蚀剂和第二基底部分；剥离第二光致抗蚀剂和其上的任何第二官能化层，从而形成邻近第一官能化区域的第二官能化区域；以及将第一引物组附接至第一官能化层或第一官能化区域，并且将第二引物组附接至第二官能化层或第二官能化区域，其中第一引物组不同于第二引物组。

在第十三方面的实例中，第一引物组的附接包括在施加第一官能化层之前将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物预接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在施加第二官能化层之前将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物预接枝到第二官能化层。

在第十三方面的实例中，第一引物组的附接包括在第一官能化层施加之后将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在第二官能化层施加之后将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物接枝到第二官能化层。

在第十三方面的实例中，所述方法还包括分别将第一自组装单层沉积在第一官能化区域上并且将第二自组装单层沉积在第二官能化区域上；其中第一引物组的附接包括将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到第一自组装单层；并且其中第二引物组的附接包括将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物接枝到第二自组装单层。

应当理解，本文公开的第十三方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十三方面和/或第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十四方面是一种方法，所述方法包括：将第一官能化层施加于基底，所述基底包括由间隙区域分隔的沟槽和各个沟槽的第一部分中的牺牲材料区域；使第一官能化层图案化，从而在各个沟槽的第二部分中形成被光致抗蚀剂覆盖的第一官能化区域；去除牺牲材料区域以暴露各个沟槽的第一部分；将第二官能化层施加于间隙区域、第一部分和光致抗蚀剂；剥离光致抗蚀剂和其上的任何第二官能化层；从间隙区域去除任何第二官能化层，由此第二官能化区域保持在各个沟槽的第一部分中；以至少基本上垂直于沟槽的空间上分隔的条带的图案施加第二光致抗蚀剂；去除暴露在空间上分隔的条带之间的第一官能化区域和第二官能化区域的部分；去除第二光致抗蚀剂；和将第一引物组附接至第一官能化层或第一官能化区域，并且将第二引物组附接至第二官能化层或第二官能化区域，其中第一引物组不同于第二引物组。

在第十四方面的实例中，第一引物组的附接包括在施加第一官能化层之前将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物预接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在施加第二官能化层之前将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物预接枝到第二官能化层。

在第十四方面的实例中，第一引物组的附接包括在第一官能化层施加之后将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在第二官能化层施加之后将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物接枝到第二官能化层。

在第十四方面的实例中，基底包括在各个沟槽的第二部分中的第二牺牲材料区域；基底、牺牲材料区域和第二牺牲材料区域具有不同的蚀刻速率；并且在施加第一官能化层之前，所述方法还包括从各个沟槽的第二部分去除第二牺牲材料区域。在该实例的一个版本中，其中在去除第二牺牲材料区域之前，所述方法还包括通过以下形成牺牲材料区域和第二牺牲材料区域：将牺牲材料施加于基底，所述基底包括由间隙区域分隔的沟槽；去除牺牲材料的一部分，使得牺牲材料的区域保持直接邻接各个沟槽的各侧壁；将第二牺牲材料施加于基底和牺牲材料区域；去除第二牺牲材料的一部分，使得第二牺牲材料的区域保持直接邻近各个牺牲材料区域；和施加材料以填充第二牺牲材料区域之间的任何空间。在该版本的一个实例中，基底是多层基底；沟槽被限定在多层基底的最外层中；并且材料和最外层是相同的。

应当理解，本文公开的第十四方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十四方面和/或第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十五方面是一种方法，所述方法包括：将牺牲材料施加于包括由第一间隙区域分隔的凹陷的基底，其中各个凹陷包括由阶梯部分限定的深部分和浅部分，并且其中牺牲层部分地填充深部分；顺序地去除牺牲层的一部分和基底的一部分以形成至少基本上与牺牲层的剩余部分齐平的第二间隙区域，并且去除阶梯部分以形成与牺牲层的剩余部分相邻的地区；将第一官能化层施加于第二间隙区域、牺牲层的剩余部分、和所述地区；将光致抗蚀剂施加于第一官能化层；去除光致抗蚀剂的一部分和第一官能化层的下面部分，使得牺牲层的剩余部分和第二间隙区域暴露，并且其上具有光致抗蚀剂的第二部分的第一官能化层的部分保持在所述地区；去除牺牲层的剩余部分以形成与第一官能化区域的部分相邻的第二地区；将第二官能化层施加于所述地区，从而形成第二官能化区域；剥离光致抗蚀剂的第二部分，从而形成第一官能化区域；以及将第一引物组附接至第一官能化层或第一官能化区域，并且将第二引物组附接至第二官能化层或第二官能化区域，其中第一引物组不同于第二引物组。

在第十五方面的实例中，还将第二官能化层施加于光致抗蚀剂的第二部分和第二间隙区域；用光致抗蚀剂的第二部分去除第二官能化层的第一部分；并且所述方法还包括从第二间隙区域抛光第二官能化层。

在第十五方面的实例中，第一引物组的附接包括在施加第一官能化层之前将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物预接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在施加第二官能化层之前将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物预接枝到第二官能化层。

在第十五方面的实例中，第一引物组的附接包括在第一官能化层施加之后将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在第二官能化层施加之后将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物接枝到第二官能化层。

应当理解，本文公开的第十五方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十五方面和/或第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十六方面是一种方法，所述方法包括：压印多层基底，所述多层基底包括：支撑物；支撑物上的第一官能化层；第一官能化层上的第二官能化层；和第二官能化层上的钝化层；从而形成由钝化层的间隙区域分隔的特征，其中第一官能化层和第二官能化层各自的区域在各个特征处暴露；将第一引物组附接至第一官能化层或第一官能化区域，并且将第二引物组附接至第二官能化层或第二官能化区域，其中第一引物组不同于第二引物组。

在第十六方面的一个实例中，第一引物组的附接包括在第一官能化层被并入多层基底之前将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物预接枝到第一官能化层；并且第二引物组的附接包括在第二官能化层被并入多层基底之前将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物预接枝到第二官能化层。

在第十六方面的一个实例中，第一引物组的附接包括将不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物接枝到各个凹陷中的第一官能化区域；并且第二引物组的附接包括将可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物接枝到各个凹陷中的第二官能化区域。

应当理解，本文公开的第十六方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十六方面和/或第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十七方面是一种方法，所述方法包括：压印第一树脂以形成凹陷，所述凹陷包括由阶梯部分限定的深部分和浅部分，其中第一树脂位于牺牲层上，所述牺牲层位于第二树脂上；蚀刻第一树脂的第一部分和牺牲层的深部分下面的一部分，从而暴露第二树脂的一部分；蚀刻阶梯部分，从而暴露牺牲层的第二部分；将第一官能化层施加于第二树脂的部分以形成第一官能化区域；去除牺牲层的第二部分，从而暴露第二树脂的第二部分；将第二官能化层施加于第二树脂的第二部分以形成第二官能化区域；以及将第一引物组附接至第一官能化层或第一官能化区域，并且将第二引物组附接至第二官能化层或第二官能化区域，其中第一引物组不同于第二引物组。

在第十七方面的实例中，在施加第二官能化层期间，第二官能化层被沉积在凹陷周围的间隙区域上，而不沉积在第一官能化区域上；并且所述方法还包括从间隙区域抛光第二官能化层。

应当理解，本文公开的第十七方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十七方面和/或第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以与本文公开的任何实例组合。

本文公开的第十八方面是一种方法，所述方法包括：将第一引物组附接至第一支撑结构；将第二引物组附接至第二支撑结构，其中第二引物组和第二支撑结构不同于第一引物组和第一支撑结构；以及将第一支撑结构和第二支撑结构加载在基底表面上，所述基底表面具有选择性地附接至第一支撑结构的多于一个(apluralityof)的第一捕获位点和选择性地附接至第二支撑结构的多于一个的第二捕获位点。

应当理解，本文公开的第十八方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。此外，应当理解，第十八方面和/或第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以与本文公开的任何实例组合。

附图简述

通过参考以下详细描述和附图，本公开内容的实例的特征将变得明显，其中相似的参考数字对应于相似的尽管可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的参考数字或特征可以结合或可以不结合其中它们出现的其他附图来描述。

图1a至图1d是被附接至基底上的第一区域和第二区域的第一引物组和第二引物组的不同实例的示意图；

图2是基底表面上的第一区域和第二区域的实例的示意性横截面图；

图3a和图3b分别是凹陷中的第一区域和第二区域的实例的示意性横截面图和俯视图；

图4a至图4c是凹陷中的第一区域和第二区域的不同实例的示意性横截面图；

图5是凹陷中的第一区域和基底表面上的第二区域的实例的示意性横截面图；

图6a和图6b分别是凹陷中的第一区域和基底表面上的第二区域的实例的示意性横截面图和示意性俯视图；

图7a至图7g是一起描绘了用于制造示例性流动池的方法的实例的示意性横截面图，该示例性流动池包括凹陷中的第一区域和基底表面上的第二区域的实例；

图8a至图8f是一起描绘了用于制造另一种示例性流动池的方法的另一个实例的示意性横截面图，该示例性流动池包括凹陷中的第一区域和基底表面上的第二区域的实例；

图9是凹陷中的第一区域和作为位于凹陷中的珠的部分的第二区域的实例的示意性横截面图；

图10是被附接至分开的基底的第一引物组和第二引物组的实例的示意性横截面图；

图11a至图11c是一起描绘了在支撑物上形成图案化树脂的一个实例的示意性透视图；

图11a、图11b和图11d是一起描绘了在支撑物上形成图案化树脂的另一个实例的示意性透视图；

图12是图示出本文公开的方法的一个实例的流程图；

图13a至图13d是一起描绘了使用图11c的图案化基底的本文公开的方法的实例的示意性透视图；

图14是沿图13d的线4-4截取的横截面图；

图15a至图15d是一起描绘了使用图11c的图案化基底的本文公开的方法的另一个实例的示意性透视图；

图16是沿图15d的线6-6截取的横截面图；

图17a至图17d是一起描绘了使用图11d的图案化基底的本文公开的方法的实例的示意性透视图；

图18是沿图17d的线8-8截取的横截面图；

图19a至图19d是一起描绘了使用图11d的图案化基底的本文公开的方法的另一个实例的示意性透视图；

图20是沿图19d的线10-10截取的横截面图；

图21是图示出本文公开的方法的另一个实例的流程图；

图22a至图22e是一起描绘了本文公开的其他方法的实例的示意性透视图；

图22f是图22e示出的流动池的实例的凹陷的放大图，其中凹陷包括嵌段共聚物和接枝到一个嵌段的引物；

图23a和图23b是凹陷和周围的间隙区域的实例的示意性俯视图，其中嵌段共聚物的不同实例在凹陷中自组装并相分离，其中各图示出了嵌段的不同图案；

图24描绘了本文公开的流动池的实例的示意性透视图；

图25a和图25b是描述本文公开的包括三嵌段共聚物的流动池的不同实例的示意性横截面图；

图26a至图26h是一起图示出用于形成图2中示出的示例性区域的示例性方法的示意图；

图27a至图27f是一起图示出用于形成图2中示出的示例性区域的另一示例性方法的示意图；

图28a至图28g是一起图示出用于形成图3a和图3b中示出的示例性区域的示例性方法的示意图；

图29a至图29h是一起图示出用于形成图3a和图3b中示出的示例性区域的另一示例性方法的示意图；

图30a至图30f是一起图示出用于形成图3a和图3b中示出的示例性区域的又一示例性方法的示意图；

图31a至图31i是一起图示出用于形成图3a和图3b中示出的示例性区域的示例性方法的示意图；

图32a至图32f是一起图示出用于形成图4c中示出的示例性区域的示例性方法的示意图；

图33a是用于形成本文公开的区域的另一个实例的示例性方法的示意图；

图33b是图示出了区域的图33a的凹陷之一的俯视图；

图34a至图34s是一起图示出用于形成沟槽中的示例性区域的示例性方法的示意图；和

图35示意性地图示出了官能化的支撑结构的实例；

图36a和图36b是一起图示出用于使用图35的官能化的支撑结构形成示例性区域的示例性方法的示意图；

图37a和图37b是一起图示出用于使用图35的官能化的支撑结构形成示例性区域的示例性方法的示意图；

图38a和图38b是一起图示出涉及嵌段共聚物的另一个实例的示例性方法的示意图；

图39a是流动池基底的扫描电子显微术(sem)图像，该流动池基底具有由间隙区域分隔的50μm直径凹陷，其上沉积有预接枝的聚合物层；

图39b是图39a的流动池基底的sem图像，其中保护层沉积在预接枝的聚合物层上；

图39c是图39b的流动池基底在蚀刻从间隙区域去除保护层后的sem图像；

图40a和图40b描绘了用于同时配对末端读段(图40a)和顺序配对末端读段(图40b)的数据分析；

图41a至图41g是一起图示出用于形成图2中示出的示例性区域的另一示例性方法的示意图；和

图42a至图42h是一起图示出用于形成图2中示出的示例性区域的又另一示例性方法的示意图。

详细描述

本文公开的流动池的实例可以用于核酸测序。

一些流动池包括被附接至流动池基底的不同区域的不同引物组。在这些实例中，可以控制引物组，使得裂解(线性化)化学在不同区域是正交的。正交裂解化学可以通过被附接至不同组中的不同引物的相同裂解位点来实现，或者通过被附接至不同组中的不同引物的不同裂解位点来实现。这使得能够在基底的一个区域中产生一簇正向链且在基底的另一个区域中产生一簇反向链。在一个实例中，区域彼此直接相邻。在另一个实例中，区域之间的任何空间足够小，使得聚簇可以跨越两个区域。对于本文公开的一些流动池配置，正向链和反向链在空间上分离，这分离来自两个读段的荧光信号，同时允许各个读段的同时碱基调用。因此，本文公开的流动池的一些实例使得能够获得同时配对末端读段。

流动池的其他实例可以用于获得同时配对末端读段；或者可以用于获得顺序配对末端读段，其中正向链被测序并去除，并且然后反向链被测序并去除。在这些其他实例中，流动池支撑物上的图案化树脂用嵌段共聚物涂覆，该嵌段共聚物在图案化树脂的凹陷中经历定向自组装。图案化树脂用作嵌段共聚物的布置的指南。在受控条件下，嵌段共聚物自组装成特定的结构域。在本文公开的一些实例中，结构域的功能被控制成正交的，使得一个或更多个结构域可以与图案化树脂反应，并且一个或更多个其他结构域可以接枝引物。在一些实例中，可以控制结构域的功能来改变该结构域的特性。这些示例性流动池可以适合用于光学或非光学检测方法。

定义

应当理解，除非另外说明，否则本文使用的术语将采用它们在相关领域中的普通含义。下文阐述了本文使用的若干术语和它们的含义。

除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。

术语包含(comprising)、包括(including)、含有(containing)和这些术语的各种形式彼此同义，并且意指同样广泛。

术语顶、底、下部、上部、上等在本文中用于描述流动池和/或流动池的各种部件。应当理解，这些方向术语并不意指暗示特定的方向，而是用于指示部件之间的相对方向。方向术语的使用不应被解释为将本文公开的实例限制于任何特定的方向。

“丙烯酰胺单体”是具有结构的单体或包括具有该结构的丙烯酰胺基团的单体。包含丙烯酰胺基团的单体的实例包括叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺：和n-异丙基丙烯酰胺：可以使用其他丙烯酰胺单体。

如本文使用的，醛是含有具有结构-cho的官能团的有机化合物，该官能团包括羰基中心(即与氧双键键合的碳)，碳原子也与氢和r基团诸如烷基或其他侧链键合。醛的一般结构是：

如本文使用的，“烷基”指的是完全饱和(即，不包含双键或三键)的直链或支链的烃链。烷基基团可以具有1个至20个碳原子。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基及类似基团。作为实例，名称“c1-4烷基”指示在烷基链中存在一个至四个碳原子，即该烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

如本文使用的，“烯基”指的是包含一个或更多个双键的直链或支链的烃链。烯基基团可以具有2个至20个碳原子。示例性的烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及类似基团。

如本文使用的，“炔烃”或“炔基”指的是包含一个或更多个三键的直链或支链的烃链。炔基基团可以具有2个至20个碳原子。

如本文使用的，“芳基”指的是在环骨架中仅包含碳的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻的碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基是环体系时，在该体系中的每一个环是芳香族的。芳基基团可以具有6个至18个碳原子。芳基基团的实例包括苯基、萘基、薁基以及蒽基。

“氨基”官能团指的是-nrarb基团，其中ra和rb各自独立地选自氢(例如，)、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基以及5-10元杂环基，如本文定义的。

如本文使用的，术语“附接”指的是两个事物彼此直接地或间接地接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，被附接至凹陷的珠在物理上可以被截留在凹陷中。对于另一个实例，核酸可以通过共价键或非共价键被附接至官能化聚合物。共价键的特征在于共享原子之间的电子对。非共价键是不涉及电子对的共享的物理键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。对于仍另一个实例，引物可以通过支撑结构被附接至基底上的区域。

“叠氮化物”或“叠氮基”官能团指的是-n3。

术语官能化珠的“珠”或“核心结构”指的是由刚性材料或半刚性材料制成的小的主体。主体可以具有特征为例如球体、椭圆形、微球体或其他公认的颗粒形状的形状，无论其具有规则尺寸还是不规则尺寸。可用于珠/核心结构的示例性材料包括但不限于玻璃；塑料，诸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一种材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(来自chemours)；多糖或交联的多糖，诸如琼脂糖(agarose)或琼脂糖(sepharose)；尼龙；硝化纤维素；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性的硅；碳纤维、金属；无机玻璃；光学纤维束或各种其他聚合物。珠/核心结构的实例包括可控孔度玻璃珠、顺磁性珠、二氧化钍溶胶、琼脂糖珠、纳米晶体和本领域已知的其他物质，如例如在来自bangslaboratories,fishersind的microspheredetectionguide中描述的。珠还可以用聚合物涂覆，该聚合物具有可以附接至引物的官能团。

“嵌段共聚物”是当两种或更多种单体聚集在一起并形成重复单元的嵌段时形成的共聚物。各个嵌段应具有至少一个特征和/或至少一个在相邻嵌段中不存在的嵌段特异性官能团。在本文公开的实例中，当暴露于特定的退火条件时，嵌段共聚物能够通过成分聚合物嵌段的微相分离以纳米级尺寸自组装成有序的结构域。嵌段共聚物的具体实例将在下文进一步描述。

“嵌段特异性官能团”指的是在嵌段聚合物的特定嵌段内具有特定功能的原子和/或键的部分，所述特定功能诸如与图案化树脂反应、附接引物、调节相互作用参数以驱动微相分离、改变嵌段共聚物的特性等。在本文公开的一些实例中，各个嵌段包括不同的嵌段特异性官能团。各个嵌段特异性官能团的具体实例将在下文进一步描述。

如本文使用的，“结合区域”指的是支撑物上将与另一种材料结合的区域，该另一种材料例如可以是间隔层、盖、另一种基底等、或其组合(例如，间隔层和盖)。在结合区域形成的键可以是化学键(如上文描述的)，或者机械结合(例如，使用紧固件等)。

如本文使用的“捕获位点”指的是流动池表面已经被物理地修饰和/或用允许官能化的支撑结构定位的化学性质修饰的部分。在一个实例中，捕获位点可以包括化学捕获剂。

如本文使用的，“碳环基”意指在环体系骨架中仅包含碳原子的非芳香族环或非芳香族环体系。当碳环基是环体系时，两个或更多个环可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式连接在一起。碳环基可以具有任何饱和度，条件是在环体系中的至少一个环不是芳香族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基以及环炔基。碳环基基团可以具有3个至20个碳原子。碳环基环的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基以及螺[4.4]壬基。

如本文使用的，术语“羧酸”或“羧基”指的是-cooh。

“化学捕获剂”是能够附接、保留或结合靶分子(例如官能化的支撑结构)的材料、分子或部分。一种示例性化学捕获剂包括捕获核酸(例如，捕获寡核苷酸)，其与靶分子的靶核酸的至少一部分互补或与被附接至靶分子的靶核酸的至少一部分互补。仍另一种示例性化学捕获剂包括受体-配体结合对的成员(例如，亲和素、链霉亲和素、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)，其能够结合靶分子(或结合被附接至靶分子的连接部分)。化学捕获剂的又另一个实例是能够与靶分子形成静电相互作用、氢键或共价键(例如硫醇-二硫化物交换、点击化学、diels-alder等)的化学试剂。

如本文使用的，“亚环烷基”意指经由两个附接点附接至分子的剩余部分的完全饱和的碳环基环或碳环基环体系。

如本文使用的，“环烯基”或“环烯烃”意指具有至少一个双键的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。实例包括环己烯基或环己烯和降冰片烯基或降冰片烯。也如本文使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指具有至少一个双键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。

如本文使用的，“环炔基”或“环炔烃”意指具有至少一个三键的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。实例是环辛炔。另一个实例是双环壬炔。也如本文使用的，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指具有至少一个三键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。

如本文使用的术语“沉积”指的是任何合适的施加技术，其可以是手动的或自动的，并且在一些情况下导致表面性质的改变。通常，沉积可以使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术或类似技术来进行。一些具体的实例包括化学气相沉积(cvd)、喷涂(例如超声喷涂)、旋涂、浸泡或浸涂、刮刀涂布、水坑分配(puddledispensing)、流过涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷或类似技术。

如本文使用的，术语“凹陷”指的是基底或图案化树脂中的离散凹形特征，其具有至少部分被基底或图案化树脂的间隙区域包围的表面开口。凹陷可以在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，作为实例包括圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数目的顶点)等。与表面正交地截取的凹陷的横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、锥形的、角形的(angular)等。作为实例，凹陷可以是井或两个互连的井。凹陷也可以具有更复杂的结构，诸如脊、阶梯特征等。

当提及项目的集合使用时，术语“各个(each)”意图识别集合中的单个项目，但不一定指的是集合中的每个项目。如果明确披露或上下文另外明确规定，则可能存在例外。

如本文使用的术语“环氧基”(也被称为缩水甘油基基团或环氧乙烷基团)指的是

如本文使用的，术语“流动池”意图意指容器，该容器具有可以进行反应的腔室(即流动通道)、用于将试剂输送至腔室的入口、和用于从腔室去除试剂的出口。在一些实例中，腔室使得能够检测在腔室中发生的反应。例如，腔室/流动通道可以包括一个或更多个透明表面，允许对凹陷处的阵列、光学标记的分子或类似物的光学检测。

如本文使用的，“流动通道”可以是被限定在两个结合的部件之间的地区，其可以选择性地接纳液体样品。在一些实例中，流动通道可以被限定在图案化树脂和盖之间，并且因此可以与在图案化树脂中限定的一个或更多个凹陷流体连通。

“官能化的支撑结构”指的是由刚性材料或半刚性材料制成的小的主体，其具有附接至其表面的本文公开的引物组之一。主体可以具有特征为例如球体、椭圆形、微球体或其他公认的颗粒形状的形状，无论其具有规则尺寸还是不规则尺寸。可用于主体的示例性材料包括但不限于玻璃；塑料，诸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一种材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(来自chemours)；多糖或交联的多糖，诸如琼脂糖(agarose)或琼脂糖(sepharose)；尼龙；硝化纤维素；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性的硅；碳纤维、金属；无机玻璃；光学纤维束或各种其他聚合物。

如本文使用的，“杂芳基”指的是在环骨架中包含一个或更多个杂原子(即，不同于碳的元素，包括但不限于氮、氧以及硫)的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环体系时，在该体系中的每一个环是芳香族的。杂芳基基团可以具有5个-18个环成员。

如本文使用的，“杂环基”意指在环骨架中包含至少一个杂原子的非芳香族环或非芳香族环体系。杂环基可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式连接在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是在环体系中的至少一个环不是芳香族的。在环体系中，杂原子可以存在于非芳香族环或芳香族环中。杂环基基团可以具有3个至20个环成员(即，构成环骨架的原子的数目，包括碳原子和杂原子)。在一些实例中，杂原子是o、n或s。

如本文使用的，术语“肼”或“肼基”指的是-nhnh2基团。

如本文使用的，术语“腙”或“腙基”指的是基团，其中ra和rb各自独立地选自氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基以及5-10元杂环基，如本文定义的。

如本文使用的，“氢氧基”或“羟基”指的是-oh基团。

如本文使用的，术语“间隙区域”指的是例如基底、图案化树脂或其他支撑物的分隔凹陷的区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个凹陷与阵列的另一个凹陷分隔。彼此分隔的两个区域可以是离散的，即，彼此缺乏物理接触。在许多实例中，间隙区域是连续的，而凹陷是离散的，例如，如在另外连续的表面中限定的多于一个的凹陷的情况。在其他实例中，间隙区域和特征是离散的，例如，如由相应的间隙区域分隔的多于一个沟槽的情况。由间隙区域提供的分隔可以是部分的或完全的分隔。间隙区域可以具有与在表面中限定的凹陷的表面材料不同的表面材料。例如，凹陷可以具有聚合物和其中的第一引物组，并且间隙区域可以具有聚合物和其上的第二引物组。对于另一个实例，阵列的凹陷可以在其中具有珠，而间隙区域在其上不具有珠。

如本文使用的“腈氧化物”意指“rac≡n⁺o^-”基团，其中ra在本文中定义。制备腈氧化物的实例包括通过用氯酰胺-t处理或通过碱对亚胺酰氯[rc(cl)＝noh]的作用从醛肟原位生成或从羟胺和醛之间的反应原位生成。

如本文使用的“硝酮”意指基团，其中r1、r2和r3可以是本文中定义的ra基团和rb基团中的任一种。

如本文使用的，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或更多个磷酸酯基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在rna中，糖是核糖，并且在dna中糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的2’位处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的c-1原子结合至嘧啶的n-1或嘌呤的n-9。核酸类似物可以具有改变的磷酸酯主链、糖或核碱基中的任何改变。核酸类似物的实例包括，例如，通用碱基或磷酸酯-糖骨架类似物，诸如肽核酸(pna)。

“图案化树脂”指的是可以具有本文限定的凹陷的任何聚合物。树脂的具体实例和用于使树脂图案化的技术将在下文进一步描述。在本文公开的一些实例中，图案化树脂可以用作用于嵌段共聚物在其上自组装的指导模板。使聚合物为“指导模板”的特性的具体实例将在下文进一步描述。

如本文使用的，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链dna或单链rna)。一些引物，在本文中被称为扩增引物，用作用于模板扩增和簇生成的起点。其他引物，在本文中被称为测序引物，用作用于dna或rna合成的起点。引物的5’末端可以被修饰以允许与聚合物的官能团或与珠表面偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长的并且可以包括多种非天然的核苷酸。在一个实例中，测序引物是在从10个至60个碱基或从20个至40个碱基的范围内的短链。

如本文使用的“间隔层”指的是将两种组分结合在一起的材料。在一些实例中，间隔层可以是有助于结合的辐射吸收材料，或者可以与有助于结合的辐射吸收材料接触。

“溶剂退火”或“溶剂蒸气退火”包括将聚合物(例如，呈膜或层的形式)暴露于密封的外壳中的过量的溶剂，以在聚合物上方产生饱和蒸气(即，溶剂气氛)。聚合物膜或层可以被保持在室温(例如，从约18℃至约25℃)或升高的温度，这导致聚合物膨胀，并增加其链迁移率。

术语“基底”指的是流动池的各种部件(例如聚合物、引物等)可以被添加至其上的结构。基底可以是晶片、面板(panel)、矩形片、管芯(die)或任何其他合适的配置。基底通常是刚性的，并且不溶于水性液体。基底对用于修饰凹陷或存在于凹陷中的化学物质可以是惰性的。例如，基底对用于形成聚合物、附接引物等的化学物质可以是惰性的。基底可以是单层结构，或多层结构(例如，包括支撑物和支撑物上的图案化树脂)。合适的基底的实例将在下文进一步描述。

“硫醇”官能团指的是-sh。

如本文使用的，术语“四嗪”和“四嗪基”指的是包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可以是任选地被取代的。

如本文使用的“四唑”指的是包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可以是任选地被取代的。

用于同时配对末端读段测序的流动池

本文公开的流动池的实例包括：基底；第一引物组，其被附接至基底上的第一区域，所述第一引物组包括不可裂解的第一引物和可裂解的第二引物；和第二引物组，其被附接至基底上的第二区域，所述第二引物组包括可裂解的第一引物和不可裂解的第二引物。

合适的基底的实例包括环氧硅氧烷、玻璃和修饰的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如来自chemours的)、环烯烃/环烯烃聚合物(cop)(诸如来自zeon的)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(si3n4)、氧化硅(sio2)、五氧化二钽(ta2o5)或其他钽氧化物(taox)、氧化铪(hao2)、碳、金属、无机玻璃或类似物。基底也可以是多层结构。多层结构的一些实例包括玻璃或硅，在表面处具有钽氧化物或另一种陶瓷氧化物的涂层。多层结构的其他实例包括其上具有图案化树脂的下层支撑物(例如玻璃或硅)。多层基底的仍其他实例可以包括绝缘体上硅(silicon-on-insulator,soi)基底。

在一个实例中，基底可以具有从约2mm至约300mm的范围内的直径，或者具有最大尺寸多达约10英尺(～3米)的矩形片或面板。在一个实例中，基底是具有从约200mm至约300mm的范围内的直径的晶片。在另一个实例中，基底是具有从约0.1mm至约10mm的范围内的宽度的管芯(die)。虽然已经提供了示例性的尺寸，但是应当理解，可以使用具有任何合适的尺寸的基底。对于另一个实例，可以使用为矩形支撑物的面板，其具有比300mm圆形晶片更大的表面积。

在流动池的一些实例中，第一引物组被附接至基底上的第一区域，并且第二引物组被附接至基底上的第二区域。图1a至图1d描绘了被附接至不同区域14、16的引物组12a、12a’、12b、12b’、12c、12c’和12d、12d’的不同配置。

第一引物组12a、12b、12c和12d中的每一个包括不可裂解的第一引物18或18’和可裂解的第二引物20或20’；并且第二引物组12a’、12b’、12c’和12d’中的每一个包括可裂解的第一引物19和不可裂解的第二引物21。

不可裂解的第一引物18或18’和可裂解的第二引物20或20’是寡核苷酸对，例如，其中不可裂解的第一引物18或18’是正向扩增引物且可裂解的第二引物20或20’是反向扩增引物，或者其中可裂解的第二引物20或20’是正向扩增引物且不可裂解的第一引物18或18’是反向扩增引物。在第一引物组12a、12b、12c和12d的各个实例中，可裂解的第二引物20或20’包括裂解位点22，而不可裂解的第一引物18或18’不包括裂解位点22。

可裂解的第一引物19或19’和不可裂解的第二引物21或21’也是寡核苷酸对，例如，其中可裂解的第一引物19或19’是正向扩增引物且不可裂解的第二引物21或21’是反向扩增引物，或者其中不可裂解的第二引物21或21’是正向扩增引物且可裂解的第一引物19或19’是反向扩增引物。在第二引物组12a’、12b’、12c’和12d’的各个实例中，可裂解的第一引物19或19’包括裂解位点22’或23，而不可裂解的第二引物21或21’不包括裂解位点22’或23。

应当理解，第一引物组12a、12b、12c、12d的不可裂解的第一引物18或18’和第二引物组12a’、12b’、12c’和12d’的可裂解的第一引物19或19’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是正向扩增引物)，除了可裂解的第一引物19或19’包括整合到核苷酸序列或附接至核苷酸序列的接头24’中的裂解位点22’或23。类似地，第一引物组12a、12b、12c、12d的可裂解的第二引物20或20’和第二引物组12a’、12b’、12c’和12d’的不可裂解的第二引物21或21’具有相同的核苷酸序列(例如，两者都是反向扩增引物)，除了可裂解的第二引物20或20’包括整合到核苷酸序列或附接至核苷酸序列的接头24中的裂解位点22之外。

应当理解，当第一引物18和19或18’和19’是正向扩增引物时，第二引物20和21或20’和21’是反向引物，并且反之亦然。

不可裂解的引物18、21或18’、21’的实例包括p5引物和p7引物，其实例用于在由illuminainc.出售的商业流动池的表面上用于例如在hiseq^tm、hiseqx^tm、miseq^tm、miseqdx^tm、miniseq^tm、nextseq^tm、nextseqdx^tm、novaseq^tm、iseq^tm、genomeanalyzer^tm和其他仪器平台上测序。p5引物和p7引物具有用于捕获和/或扩增目的的通用序列。在一个实例中，p5引物和p7引物包括以下：

p5：5’→3’

aatgatacggcgaccaccga(seq.id.no.1)

p7：5’→3’

caagcagaagacggcatacga(seq.id.no.2)

p5引物和p7引物是不可裂解的引物18、21或18’、21’，因为它们不包括裂解位点22、22’、23。应当理解，任何合适的通用序列可以用作不可裂解的引物18、21或18’、21’。

可裂解的引物19、20或19’、20’的实例包括p5和p7(或其他通用序列)引物，裂解位点22、22’、23被分别掺入到相应的核酸序列中(例如，图1a和图1c)，或被掺入到将可裂解的引物19、20或19’、20’分别附接至区域16、14的接头24’、24中(图1b和图1d)。合适的裂解位点22、22’、23的实例包括酶可裂解的核碱基或化学可裂解的核碱基、修饰的核碱基或接头(例如，在核碱基之间)。酶可裂解的核碱基可能容易通过与糖基化酶和内切核酸酶或与核酸外切酶的反应来裂解。可裂解的核碱基的一个具体实例是脱氧尿嘧啶(du)，其可以被user酶靶向。在一个实例中，尿嘧啶碱基可以被掺入在p5引物(p5u)或p7引物(p7u)的3’末端的第7个碱基位置。其他无碱基位点还可以被使用。化学可裂解的核碱基、修饰的核碱基或接头的实例包括邻位二醇、二硫化物、硅烷、偶氮苯、可光裂解的基团、烯丙基t(具有烯丙基官能团的胸腺嘧啶核苷酸类似物)、烯丙基醚或叠氮基官能醚。

各个引物组12a和12a’或12b和12b’或12c和12c’或12d和12d’被分别附接至基底上的区域14或16。在一些实例中，区域14、16具有相同的表面化学性，并且本文阐述的任何技术可以用于将一组引物18、20或18’、20’接枝到区域14，并将另一组引物19、21或19’、21’接枝到区域16。在其他实例中，区域14或16包括不同的表面化学物质(例如官能团)，其可以选择性地分别与引物18、20或18’、20’或19、21或19’、21’反应。在这些其他实例中，第一区域14具有第一官能团，并且第二区域16具有不同于第一官能团的第二官能团。

如所提及的，图1a至图1d描绘了被附接至不同区域14、16的引物组12a、12a’、12b、12b’、12c、12c’和12d、12d’的不同配置。更具体地，图1a至图1d描绘了可以使用的引物18、20和19、21或18’、20’和19’、21’的不同配置。

在图1a中示出的实例中，引物组12a和12a’的引物18、20和19、21被直接附接至区域14和16，例如，没有接头24、24’。区域14可以具有可以在引物18、20的5’末端固定末端基团的表面官能团。类似地，区域16可以具有可以在引物19、21的5’末端固定末端基团的表面官能团。在一个实例中，区域14和引物18、20之间的固定化学以及区域16和引物19、21之间的固定化学可以不同，使得引物18、20或19、21选择性地附接至期望的区域14或16。在另一个实例中，对于区域14、16和分别相应的引物18、20或19、21，固定化学可以是相同的，并且可以使用图案化技术一次接枝一个引物组12a、12a’。在仍另一个实例中，被应用来形成区域14、16的材料可以分别具有预接枝到其上的引物18、20或19、21，并且因此固定化学可以相同或不同。

在该实例中，固定可以通过单点共价分别附接至引物18和20或19和21的5’末端的相应区域14或16。本领域已知的任何合适的共价附接手段可以在区域14、16使用。可以使用的封端的引物的实例包括炔烃封端的引物、四嗪封端的引物、叠氮基封端的引物、氨基封端的引物、环氧基或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸酯封端的引物、硫醇封端的引物、醛封端的引物、肼封端的引物、亚磷酰胺封端的引物和三唑啉二酮封端的引物。在一些具体的实例中，琥珀酰亚胺(nhs)酯封端的引物可以在区域14和/或16的表面处与胺反应，醛封端的引物可以在区域14和/或16的表面处与肼反应，或者炔烃封端的引物可以在区域14和/或16的表面处与叠氮化物反应，或者叠氮化物封端的引物可以在区域14和/或16的表面处与炔烃或dbco(二苯并环辛炔)反应，或者氨基封端的引物可以在区域14和/或16的表面处与活化的羧酸酯基团或nhs酯反应，或者硫醇封端的引物可以在区域14和/或16的表面处与烷基化反应物(例如，碘代乙酰胺或马来酰亚胺)反应，亚磷酰胺封端的引物可以在区域14和/或16的表面处与硫醚反应，或者生物素修饰的引物可以在区域14和/或16的表面处与链霉亲和素反应。

同样在图1a中示出的实例中，每种可裂解的引物20、19的裂解位点22、22’被掺入到引物20、19的序列。在该实例中，在分别为引物组12a、12a’的可裂解的引物20、19中使用相同类型的裂解位点22、22’。作为实例，裂解位点22、22’是尿嘧啶碱基，并且可裂解的引物20、19是p5u和p7u。在该实例中，寡核苷酸对18、20的不可裂解的引物18可以是p7，并且寡核苷酸对19、21的不可裂解的引物21可以是p5。因此，在该实例中，第一引物组12a包括p7、p5u，并且第二引物组12a’包括p5、p7u。引物组12a、12a’具有相反的线性化学性，在扩增、聚簇生成和线性化之后，其使得能够在一个区域14或16上形成正向模板链，并且在另一个区域16或14上形成反向链。

在图1b中示出的实例中，引物组12b和12b’的引物18’、20’和19’、21’通过例如接头24、24’被附接至区域14和16。区域14可以具有可以在引物18’、20’的5’末端固定接头24的表面官能团。类似地，区域16可以具有可以在引物19’、21’的5’末端固定接头24的表面官能团。在一个实例中，区域14和接头24的固定化学以及区域16和接头24’的固定化学可以不同，使得引物18’、20’或19’、21’选择性地接枝到期望的区域14或16。在另一个实例中，区域14、16和接头24、24’的固定化学可以是相同的，并且本文公开的任何合适的技术可以用于一次接枝一个引物组12b、12b’。在仍另一个实例中，应用于形成区域14、16的材料可以分别具有预接枝到其上的引物18’、20’和19’、21’，并且因此固定化学可以相同或不同。合适的接头24、24’的实例可以包括核酸接头(例如，10个核苷酸或更少)或非核酸接头，诸如聚乙二醇链、烷基基团或碳链、具有邻位二醇的脂肪族接头、肽接头等。核酸接头的实例是polyt间隔子，尽管也可以使用其他核苷酸。在一个实例中，间隔子是6t至10t的间隔子。以下是核苷酸的一些实例，包括非核酸接头(其中b是核碱基，并且“寡核苷酸”是引物)：

在图1b中示出的实例中，引物18’、19’具有相同的序列和相同的或不同的接头24、24’。引物18’是不可裂解的，而引物19’包括被掺入到接头24’中的裂解位点22’。同样在该实例中，引物20’、21’具有相同的序列(例如p7)和相同的或不同的接头24、24’。引物21’是不可裂解的，并且引物20’包括被掺入到接头24的裂解位点22。在各可裂解的引物20’、19’的接头24、24’中使用相同类型的裂解位点22、22’。作为实例，裂解位点22、22’可以是被掺入到核酸接头24、24’的尿嘧啶碱基。引物组12b、12b’具有相反的线性化学性，在扩增、聚簇生成和线性化之后，其使得能够在一个区域14或16上形成正向模板链，并且在另一个区域16或14上形成反向链。

图1c中示出的实例类似于图1a中示出的实例，除了分别在引物组12c、12c’的可裂解的引物20、19中使用不同类型的裂解位点22、23。作为实例，可以使用两个不同的酶裂解位点，可以使用两个不同的化学裂解位点，或者可以使用一个酶裂解位点和一个化学裂解位点。可以分别用于可裂解的引物20、19的不同裂解位点22、23的实例包括邻位二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤的任何组合。

图1d中示出的实例类似于图1b示出的实例，除了在被分别附接至引物组12d、12d’的可裂解的引物20’、19’的接头24、24’中使用不同类型的裂解位点22、23。可以用于分别被附接至可裂解的引物20、19的接头24、24’的不同裂解位点22、23的实例包括邻位二醇、尿嘧啶、烯丙基醚、二硫化物、限制性酶位点和8-氧代鸟嘌呤的任何组合。

在图1a至图1d中示出的任何实例中，引物18、20和19、21或18’、20’和19’、21’与区域14、16的附接使得引物18、20和19、21或18’、20’和19’、21’的模板特异性部分自由退火至其同源模板，并且3’羟基基团自由用于引物延伸。

区域14、16表示基底上的不同地区，所述基底具有附接至其的不同的引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’。区域14、16可以包括具有不同官能团的材料。在一些情况下，不同的官能团是基底的表面官能团或已经被引入基底表面的官能团，或者可以是被沉积在基底上的另一组分(例如聚合物层、珠等)的官能团。

在一些实例中，区域14、16在化学上是相同的，并且本文公开的任何技术可以用于分别将分别为组12a和12a’、或12b和12b’、或12c和12c’、或12d和12d’的引物18、20和19、21或18’、20’和19’、21’顺序附接至区域14、16。

在区域14、16化学上相同的一个实例中，两个区域14、16包括相同的聚合物层。聚合物层可以是对液体和气体可渗透的半刚性聚合物材料。聚合物层的实例包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(n-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺，pazam。pazam和丙烯酰胺共聚物的一些其他形式由以下结构(i)表示：

其中：

r^a选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；

r^b是h或任选地被取代的烷基；

r^c、r^d和r^e各自独立地选自由h和任选地被取代的烷基组成的组；

各个-(ch2)p-可以任选地被取代；

p是在1至50的范围内的整数；

n是在1至50,000的范围内的整数；且

m是在1至100,000的范围内的整数。

本领域普通技术人员将认识到，结构(i)中重复的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚基可以以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，随机的、嵌段的、图案化的或其组合)。

pazam的分子量可以在从约10kda至约1500kda的范围内，或者在具体的实例中，可以是约312kda。

在一些实例中，pazam是线性聚合物。在一些其他实例中，pazam是轻度交联的聚合物。

在其他实例中，聚合物26可以是结构(i)的变型。在一个实例中，丙烯酰胺单元可以用n,n-二甲基丙烯酰胺()置换。在该实例中，结构(i)中的丙烯酰胺单元可以用置换，其中r^d、r^e和r^f各自为h，并且r^g和r^h各自为甲基基团(代替如丙烯酰胺的情况中的h)。在该实例中，q可以是在1至100,000的范围内的整数。在另一个实例中，除了丙烯酰胺单元之外，可以使用n,n-二甲基丙烯酰胺。在该实例中，除了重复的“n”和“m”特征之外，结构(i)可以包括其中r^d、r^e和r^f各自为h，并且r^g和r^h各自为甲基基团。在该实例中，q可以是在1至100,000的范围内的整数。

作为另一种示例性聚合物，结构(i)中重复的“n”特征可以用包含具有结构(ii)的杂环叠氮基基团的单体置换：

其中r¹是h或c1-c4烷基；r²是h或c1-c4烷基；l是接头，其包含具有2个至20个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中碳和任何氮原子上的10个任选的取代基的线性链；e是线性链，其包含1个至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子，以及链中碳和任何氮原子上的任选的取代基；a是n取代的酰胺，其中h或c1-c4烷基被附接至n；并且z是含氮杂环。z的实例包括以单环结构或稠合结构存在的5个至10个环成员。

作为仍另一个实例，聚合物可以包含结构(iii)和结构(iv)中的每一个的重复单元：

其中r^1a、r^2a、r^1b和r^2b中的每一个独立地选自氢、任选地被取代的烷基或任选地被取代的苯基；r^3a和r^3b各自独立地选自氢、任选地被取代的烷基、任选地被取代的苯基或任选地被取代的c7-14芳烷基；并且l¹和l²各自独立地选自任选地被取代的亚烷基接头或任选地被取代的亚杂烷基接头。

应当理解，其他分子可以用于形成聚合物层，只要它们被官能化以与第一引物组和第二引物组12a、12a’或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’相互作用。合适的聚合物层的其他实例包括具有胶体结构的那些，诸如琼脂糖；或聚合物网状结构，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、无硅烷丙烯酰胺(sfa)或叠氮化形式的sfa。合适的聚丙烯酰胺聚合物的实例可以从丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或者从形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物层的仍其他实例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。还可以使用支链聚合物，诸如星形聚合物(starpolymer)、星形或星形嵌段聚合物(star-shapedorstar-blockpolymer)、树状聚合物及类似物。

在其他实例中，区域14、16在化学上是不同的。例如，区域14可以具有可以固定第一引物组12a、12b、12c、12d的引物18、20或18’、20’的表面官能团，并且区域16可以具有可以固定第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’的引物19、21或19’、21’的不同表面官能团。

在其中区域14、16在化学上不同的一个实例中，使用嵌段共聚物。在该实例中，嵌段共聚物包含两个不同的嵌段，一个嵌段具有可以附接至第一引物组12a、12b、12c、12d的引物18、20或18’、20’的引物接枝官能团，并且另一个嵌段具有可以附接至第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’的引物19、21或19’、21’的引物接枝官能团。引物接枝官能团的实例选自由以下组成的组：叠氮化物/叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、醛、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫醇及其组合。

化学上不同的区域14、16的其他实例包括金和pazam、金和铝、具有两个不同表面官能团(例如叠氮化物和胺)的硅烷、金上的硫醇自组装单层和铝或氧化铪上的膦酸酯自组装单层、sio2和ta2o5、环氧树脂和ta2o5、包含叠氮化物基团的第一聚合物和包含胺基基团的第二聚合物、sio2和铜、或环氧树脂和铜。虽然已经提供了若干实例，但是应当理解，可以使用化学上不同的区域14、16的其他组合。

区域14、16也可以具有不同的物理配置。图2至图6b图示出了这些配置的不同实例。在这些实例中，基底26示出为单层/材料，诸如玻璃、硅等。然而，应当理解，多层基底可以与这些示例性配置中的任一种一起使用。例如，这些实例中的任一种可以包括支撑物和在支撑物上形成的图案化树脂。

图2图示出了区域14、16位于基底26的表面s的不同地区的实例。

用于制造图2中示出的实例的一种示例性方法在图26a至图26h中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。

如图26a示出的，第一官能化层60被施加于基底26。第一官能化层60可以是聚合物(pazam)、硅烷、金属(金、铝等)或任何其他具有可以附接至第一引物组12a、12b、12c、12d的官能团的材料。第一官能化层60可以使用本文描述的任何技术来沉积。

取决于所使用的第一官能化层60，基底26可以使用硅烷化或等离子体灰化来活化，以产生可以与第一官能化层60反应的表面基团。硅烷化和等离子体灰化的实例参考图13a更详细地描述。然后，第一官能化层60可以使用本文描述的任何技术来沉积。取决于所使用的材料，第一官能化层60也可以被固化。

在图26b和图26c中，第一官能化层60然后被图案化以形成被光致抗蚀剂62覆盖的第一官能化区域(区域14)。在一个实例中，光致抗蚀剂62是负性光致抗蚀剂(暴露的区域变得不可溶)。合适的负性光致抗蚀剂的实例包括基于环氧基的su-8光致抗蚀剂(从microchemicals可获得)。光致抗蚀剂62被施加至第一官能化层60，选择性地暴露于某些波长的光以形成不溶性区域(62处示出的)，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分。在另一个实例中，光致抗蚀剂62是正性光致抗蚀剂(暴露的区域变得可溶)。合适的正性光致抗蚀剂的实例包括s1800系列或1500系列，这两个系列均从microchemicals可获得。光致抗蚀剂62被施加至基底26，选择性地暴露于某些波长的光以形成可溶性区域，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分，留下不溶性部分(62处示出的)。在其他实例中，光致抗蚀剂62可以用纳米压印光刻术树脂替代，该纳米压印光刻术树脂被图案化以形成区域(例如，62)。

如图26c中示出的，第一官能化层60的暴露的部分(例如，未被光致抗蚀剂62覆盖的部分)然后可以例如经由蚀刻或另一种合适的技术来去除。

如图26d中示出的，然后使用任何合适的沉积技术，在光致抗蚀剂62和基底26的部分(例如，暴露的表面s)上施加第二官能化层64。取决于所使用的材料，第二官能化层64也可以被固化。

如图26e中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂62，这也去除了其上的任何第二官能化层64。

在图26f和图26g中，第二官能化层64的一部分被去除。为了去除该部分，施加、暴露和显影第二光致抗蚀剂62’，使得不溶性区域(62’处示出的)覆盖第一官能化区域14和第二官能化层64的期望部分，该第二官能化层64的期望部分i)邻接第一官能化区域14并且ii)将成为第二官能化区域16。一旦形成光致抗蚀剂62’，第二官能化层64的暴露的部分(例如，未被光致抗蚀剂62’覆盖的部分)然后可以例如经由蚀刻或另一种合适的技术来去除。

如图26h中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂62’，这暴露了第一官能化区域14和第二官能化区域16。

在一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图26a至图26h中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图26a至图26h中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图26a)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图26h)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图26d)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图26h)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以通过流过沉积(例如，使用临时结合的盖)、浸泡涂布、喷涂、水坑分配来完成，或者通过将引物18、20或18’、20’附接至区域14或将引物19、21或19’、21’附接至区域16的另一种合适的方法来完成。这些示例性技术中的每一种可以利用引物溶液或混合物，其可以包含引物18、20或18’、20’、19、21或19’、21’、水、缓冲液和催化剂。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对基底26不具有亲和力。

虽然在图26a至图26h中未示出，但是该示例性方法还可以包括在第一官能化区域14上沉积第一自组装单层(sam)，并且在第二官能化区域16上沉积第二自组装单层(sam)。在一个实例中，区域14是金，并且第一sam包含可以附接至金的硫醇基团和可以附接至引物18、20或18’、20’的叠氮化物基团。在另一个实例中，区域16是氧化铪或氧化铝，并且第二sam包含可以附接至氧化铪或氧化铝的膦酸酯基团和可以附接至引物19、21或19’、21’的胺基团。在使用自组装的单层的实例中，在sams形成之后，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’被接枝。

用于制造图2中示出的实例的另一种示例性方法在图27a至图27f中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。

如图27a示出的，第一光致抗蚀剂62被施加于基底26，使得第一基底部分66保持暴露。在该实例中，光致抗蚀剂62可以是正性光致抗蚀剂(暴露的区域变得可溶)或负性光致抗蚀剂(暴露的区域变得不可溶)。光致抗蚀剂62还可以用纳米压印光刻术树脂替代，该纳米压印光刻术树脂被图案化以形成区域(例如，62)。

如图27b示出的，第一官能化层60可以使用本文描述的任何技术沉积在光致抗蚀剂62和第一基底部分66上。在一些情况下，第一官能化层60也可以被固化。

如图27c中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂62，这也去除了其上的任何第一官能化层60。这留下了在基底表面s上形成的区域14。

施加、暴露和显影第二光致抗蚀剂62’，使得不溶性区域(62’处示出的)覆盖除了邻接第一官能化区域14的第二基底部分68以外的第一官能化区域14和基底26。

如图27e中示出的，然后使将第二官能化层64用任何合适的沉积技术施加，并且在一些情况下固化在光致抗蚀剂62’和第二基底部分68上。

如图27f中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂62’，这去除了其上的任何第二官能化层64。这暴露了第一官能化区域14和第二官能化区域16。

在一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图27a至图27f中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图27a至图27f中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图27b或图27c)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图27f)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图27e)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图27f)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何接枝技术来完成。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对基底26不具有亲和力。

虽然在图27a至图27f中未示出，但是该示例性方法还可以包括在第一官能化区域14上沉积第一自组装单层(sam)，并且在第二官能化区域16上沉积第二自组装单层(sam)。在使用自组装的单层的实例中，在sams形成之后，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’被接枝。

用于制造图2中示出的实例的又另一种示例性方法在图41a至图41g中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。

基底26可以是本文公开的基底的任何实例。虽然未示出，但是应当理解，基底也可以是多层基底，其包括在支撑物上的未图案化树脂(例如，在玻璃支撑物上的纳米压印光刻术树脂，或者本文描述的树脂54和支撑物52的任何其他实例，参见“基于珠的流动池”部分)。

如图41a中示出的，在该实例中，牺牲金属层98被施加在基底26上。在一个实例中，多层基底的纳米压印光刻术树脂/抗蚀剂可以暴露于氧等离子体，并且然后可以使用任何合适的金属沉积技术沉积牺牲金属层98。在一个实例中，使用溅射沉积牺牲金属层98。牺牲金属层98的实例包括铝或铜，并且层98可以具有从约10nm至约100nm的范围内的厚度。

如图41b中示出的，抗蚀剂被施加至牺牲金属层98，并且被图案化以在其中限定多级或多深度凹陷。图案化树脂以参考标记54’示出。在该实例中，树脂可以是任何纳米压印光刻术树脂。在一个实例中，树脂被旋涂和软烘烤，并且然后被压印和固化(例如，使用紫外固化)以限定多级或多深度凹陷，该凹陷包括被图案化树脂54’的阶梯部分74部分地限定的深部分70和浅部分72。

然后，可以使用湿蚀刻或干蚀刻以暴露在深部分70下面的基底26的部分100(例如，多层基底的未图案化树脂或玻璃的部分)和在浅部分72下面的牺牲金属层98的部分102。暴露的部分在图41c中示出。在湿蚀刻的实例中，fecl3可以用于去除铜牺牲金属层98。在湿蚀刻的另一个实例中，koh可以用于去除铝牺牲金属层98。在干蚀刻的实例中，氧等离子体可以首先用于去除图案化树脂54’的残留物，并且然后cl2和bcl3等离子体的组合可以用于蚀刻铝牺牲金属层98。氧等离子体可以再次用于清洁暴露的部分100和102。在该实例中，深度d1(例如，浅部分72的深度)和d2(例如，从深部分70的底部到阶梯部分74的顶部)，以及牺牲金属层98的厚度d3可以相同或相似(例如，在彼此的一纳米内)，使得在蚀刻期间去除材料54’和98各自的期望的厚度，以便暴露部分100和102。

如图41d中示出的，第一官能化层60可以沉积在剩余的图案化树脂54’上、沉积在基底26的暴露的部分100上以及沉积在牺牲金属层98的暴露的部分102上。第一官能化层60可以是任何实例，并且可以使用本文描述的任何技术来沉积。在一些情况下，第一官能化层60也被固化。

在图41e中，湿蚀刻用于选择性地去除第一官能化层60的一部分和牺牲金属层98的另一部分，以便暴露基底26的另一部分104。湿蚀刻可以如本文描述的进行。所使用的蚀刻剂可以蚀刻牺牲金属层98，从而剥离第一官能化层60。

如图41f中示出的，然后第二官能化层64被施加在暴露的部分104和第一官能化层60上。任何合适的沉积技术可以用于第二官能化层64。在本文公开的任何示例性方法中，当在高离子强度下(例如，在10xpbs、nacl、kcl等存在下)进行沉积时，第二官能化层64不沉积或粘附到第一官能化层60。因此，第二官能化层64不会污染第一官能化层60，留下区域16。

如图41g中示出的，然后可以剥离剩余的图案化树脂54，这去除了其上的任何第一官能化层60。该剥离过程可以在二甲基亚砜(dmso)中使用声处理，或者在丙酮中，或者使用基于nmp(n-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离器进行。然后暴露剩余的牺牲金属层98，并且可以使用如本文描述的湿蚀刻去除。在湿蚀刻后，区域14、16在基底表面上保持完整，部分是因为牺牲金属层98不存在于区域14、16的下方。

在一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图41a至图41g中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图41a至图41g中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图41d)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图41g)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图41f)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图41g)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以通过流过沉积(例如，使用临时结合的盖)、浸泡涂布、喷涂、水坑分配来完成，或者通过将引物18、20或18’、20’附接至区域14或将引物19、21或19’、21’附接至区域16的另一种合适的方法来完成。这些示例性技术各自可以利用引物溶液或混合物，其可以包含引物18、20或18’、20’、19、21或19’、21’、水、缓冲液和催化剂。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对基底26不具有亲和力。

用于制造图2中示出的实例的仍另一种示例性方法在图42a至图42h中示出。同样，虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。

基底26可以是本文公开的基底的任何实例。类似于图41a至图41g中描述的实例，基底也可以是包括在支撑物上的未图案化树脂的多层基底。

如图42a中示出的，在该实例中，牺牲金属层98被施加在基底26上。牺牲金属层98可以是任何示例性材料，并且可以通过参考图41a描述的任何实例来沉积。

如图42b中示出的，抗蚀剂被施加至牺牲金属层98，并且被图案化以在其中限定多级或多深度凹陷。图案化树脂以参考标记54’示出。在该实例中，树脂可以是任何纳米压印光刻术树脂。在一个实例中，树脂被旋涂和软烘烤，并且然后被压印和固化(例如，使用紫外固化)以限定多级或多深度凹陷，该凹陷包括被图案化树脂54’的阶梯部分74部分地限定的深部分70和浅部分72。

然后，可以使用湿蚀刻或干蚀刻以暴露在深部分70下面的基底26的部分100(例如，多层基底的未图案化树脂的部分)和在浅部分72下面的牺牲金属层98的部分102。暴露的部分100和102在图42c中示出。湿蚀刻或干蚀刻可以参考图41c描述的进行。

如图42d中示出的，第一官能化层60可以沉积在剩余的图案化树脂54’上、沉积在基底26的暴露的部分100上以及沉积在牺牲金属层98的暴露的部分102上。第一官能化层60可以是任何实例，并且可以使用本文描述的任何技术来沉积。在一些情况下，第一官能化层60也可以被固化。

在图42e和图42f中，第一官能化层60然后被图案化以形成被光致抗蚀剂62覆盖的第一官能化区域(区域14)。在该实例中，光致抗蚀剂62是负性光致抗蚀剂。光致抗蚀剂62可以被施加至第一官能化层60，选择性地暴露于某些波长的光以形成不溶性区域，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分。剩余的光致抗蚀剂62位于第一官能化层60的在深部分70中的部分100上的部分上。

如图42f中示出的，第一官能化层60的暴露的部分(例如，未被光致抗蚀剂62覆盖的部分)然后可以例如经由蚀刻或另一种合适的技术来去除。该蚀刻过程(例如氧等离子体)还去除了一些图案化树脂54’和一些光致抗蚀剂62。在单独的蚀刻过程中，去除浅部分72(参见图42b)下方的牺牲金属层98。在该实例中，可以使用参考图41c描述的湿蚀刻或干蚀刻。该过程暴露了基底26的另一部分104。

如图42g中示出的，然后使用任何合适的沉积技术，在树脂54’的暴露的部分、光致抗蚀剂62和基底26的暴露的部分104上施加第二官能化层64。在一个实例中，第二官能化层64可以沉积在光致抗蚀剂62上，但是当光致抗蚀剂62被剥离时，可以与光致抗蚀剂62一起去除。

如图42h中示出的，然后可以剥离剩余的图案化树脂54’和光致抗蚀剂62，这去除了其上的任何第二官能化层64。该剥离过程可以在二甲基亚砜(dmso)中使用声处理，或者在丙酮中，或者使用基于nmp(n-甲基-2-吡咯烷酮)的剥离器进行。然后暴露剩余的牺牲金属层98，并且可以使用如本文描述的湿蚀刻去除。在湿蚀刻后，区域14、16在基底表面上保持完整，部分是因为牺牲金属层98不存在于区域14、16的下方。

在一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图42a至图42h中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图42a至图42h中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图42d)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图42h)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图42g)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图42h)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以通过流过沉积(例如，使用临时结合的盖)、浸泡涂布、喷涂、水坑分配来完成，或者通过将引物18、20或18’、20’附接至区域14或将引物19、21或19’、21’附接至区域16的另一种合适的方法来完成。这些示例性技术中的每一种可以利用引物溶液或混合物，其可以包含引物18、20或18’、20’、19、21或19’、21’、水、缓冲液和催化剂。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对基底26不具有亲和力。

图2中示出的示例性区域14、16也可以使用微接触印刷或直接印刷技术，诸如喷墨印刷来形成。当期望产生微米级诸如约1μm至约50μm的区域时，这些方法可以是特别合适的。

在图2中示出的实例中，应当理解，多组分离的区域14、16可以在基底表面s上以阵列形成。许多不同的布局可以用于阵列，只要分离的组内的区域14、16彼此相邻即可。

图3a至图6b图示出了不同的实例，其中区域14、16中的至少一个位于在基底26中限定的凹陷28中。凹陷28可以形成在单层基底(例如，基底26)中，或者可以形成在多层基底的最外层中。

凹陷28可以使用任何合适的技术形成，诸如光刻术、纳米压印光刻术(nil)、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术等。

虽然在图3a至图6b的每一个中示出了单个凹陷28，但是应当理解，流动池可以包括由间隙区域30分隔的多于一个的凹陷28，其中各个凹陷28包括位于第一部分的第一区域14和位于第二部分的第二区域16。仍然进一步地，本文公开的一些实例包括具有不同尺寸的凹陷28a和28b(参见例如图11c)，或包括互连的但具有不同尺寸的两个部分34、34’的凹陷28c(参见例如图11d)。应当理解，以下关于凹陷28的讨论可以适用于本文公开的凹陷28、28a、28b、28c的任何实例。

可以设想凹陷28的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个实例中，凹陷28被设置成六边形网格用于紧密填充和改进的密度。其他布局可以包括例如直线(即矩形)布局(参见图24)、三角形布局及类似布局。在一些实例中，布局或图案可以是以行和列的凹陷28的x-y格式。在一些其他实例中，布局或图案可以是凹陷28和/或间隙区域30的重复布置。在仍其他实例中，布局或图案可以是凹陷28和/或间隙区域30的随机布置。图案可以包括条带、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格(check)、方格(plaid)、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。

布局或图案可以相对于在所限定的地区中的凹陷28的密度(即，凹陷28的数目)来表征。例如，凹陷28可以以每mm²约200万的密度存在。密度可以被调节到不同的密度，包括例如每mm²至少约100、每mm²至少约1,000、每mm²至少约10万、每mm²至少约100万、每mm²至少约200万、每mm²至少约500万、每mm²至少约1000万、每mm²至少约5000万或更大的密度。可选择地或另外地，密度可以被调节为每mm²不大于约5000万、每mm²不大于约1000万、每mm²不大于约500万、每mm²不大于约200万、每mm²不大于约100万、每mm²不大于约10万、每mm²不大于约1,000、每mm²不大于约100或更小。还应当理解，凹陷28的密度可以在选自上文的范围的较低值之一和较高值之一之间。作为实例，高密度阵列可以被表征为具有被分隔开小于约100nm的凹陷28，中等密度阵列可以被表征为具有被分隔开约400nm至约1μm的凹陷28，并且低密度阵列可以被表征为具有被分隔开大于约1μm的凹陷28。虽然已经提供了示例性密度，但是应当理解，可以使用具有任何合适的密度的基底。

凹陷28的布局或图案可以也或可选择地在平均间距，即从凹陷28的中心到相邻凹陷28的中心的间距(中心到中心的间距)或从一个凹陷28的边缘到相邻凹陷28的边缘的间距(边缘到边缘的间距)方面来表征。图案可以是规则的，使得关于平均间距的变化系数小，或者图案可以是不规则的，在这种情况下，变化系数可以是相对大的。在任一情况下，平均间距可以是例如至少约10nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，平均间距可以是例如至多约100μm、约10μm、约5μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小。凹陷28的特定图案的平均间距可以在选自上文的范围的较低值之一和较高值之一之间。在一个实例中，凹陷28具有约1.5μm的间距(中心到中心的间距)。虽然已经提供了示例性的平均间距值，但是应当理解，也可以使用其他平均间距值。

在图3a至图6b中示出的实例中，凹陷28是井。井可以是微井或纳米井。各个井的尺寸可以通过其体积、井开口面积、深度和/或直径来表征。

各个井可以具有能够限制液体的任何体积。最小体积或最大体积可以被选择，例如以适应对流动池的下游使用所预期的吞吐量(例如，多重性)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以是至少约1×10^-3μm³、至少约1×10^-2μm³、至少约0.1μm³、至少约1μm³、至少约10μm³、至少约100μm³或更大。可选择地或另外地，体积可以是至多约1×10⁴μm³、至多约1×10³μm³、至多约100μm³、至多约10μm³、至多约1μm³、至多约0.1μm³或更小。应当理解，区域14、16可以填充井的全部或部分体积。在单独的井中的例如聚合物层的体积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。

可以基于与上文关于井体积阐述的标准相似的标准来选择由表面上的各个井开口占据的面积。例如，用于表面上的各个井开口的面积可以是至少约1×10^-3μm²、至少约1×10^-2μm²、至少约0.1μm²、至少约1μm²、至少约10μm²、至少约100μm²或更大。可选择地或另外地，面积可以是至多约1×10³μm²、至多约100μm³、至多约10μm²、至多约1μm²、至多约0.1μm²、约1×10^-2μm²或更小。由各个井开口占据的面积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。

各个井(或任何其他类型的凹陷28)的深度可以是至少约0.1μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。可选择地或另外地，深度可以是至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.1μm或更小。各个井(或其他凹陷28)的深度可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。

在一些情况下，各个井(或其他凹陷28)的直径可以是至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。可选择地或另外地，直径可以是至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。各个井(或其他凹陷28)的直径可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。

当凹陷28是沟槽时(参见例如图34h)，沟槽和间隙区域两者可以具有直线配置。各个沟槽的深度可以是至少约0.02μm(20nm)、至少约0.1μm(100nm)、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。可选择地或另外地，深度可以是至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.1μm或更小。各个沟槽的深度可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。

在一些情况下，各个沟槽的宽度可以是至少约0.02μm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。可选择地或另外地，宽度可以是至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。各个沟槽的宽度可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。

图3a和图3b分别描绘了区域14、16位于凹陷28的不同地区的一个实例的横截面图和俯视图。在该实例中，区域14、16在凹陷28内彼此直接相邻。

用于制造图3a和图3b中示出的实例的一种示例性方法在图28a至图28g中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。此外，图3a和图3b描绘了限定在单层基底26中的凹陷28，而示例性方法描绘了限定在多层基底的支撑物52上的图案化树脂54’中的凹陷28。应当理解，该方法可以用于单层基底。

在该实例中，多层基底包括支撑物52上的(图案化)树脂54’。可以使用树脂54(例如，参见“基于珠的流动池”部分)、支撑物52和用于使本文描述的树脂54图案化的方法的任何实例。

如图28a中示出的，图案化树脂54’中限定的凹陷28邻接间隙区域30，间隙区域30分隔彼此相邻的凹陷28。如图28b中示出的，第一官能化层60使用本文描述的任何技术被施加(例如，沉积或沉积和固化)在图案化树脂54’上。

在图28c和图28d中，第一官能化层60然后被图案化以形成被光致抗蚀剂62覆盖的第一官能化区域(区域14)。在该实例中，光致抗蚀剂62可以是负性光致抗蚀剂(暴露的区域变得不可溶)或正性光致抗蚀剂(暴露的区域变得可溶)。光致抗蚀剂62被施加至第一官能化层60，选择性地暴露于某些波长的光以形成不溶性区域或可溶性区域，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分。在其他实例中，光致抗蚀剂62可以用纳米压印光刻术树脂替代。如图28c中示出的，在该实例中，光致抗蚀剂62覆盖在凹陷28的第一部分76上的第一官能化层60的部分(例如，将成为区域14的层60的部分)，并且不覆盖在凹陷28的第二部分78上的第一官能化层60的第二部分。

如图28d中示出的，第一官能化层60的暴露的部分(例如，未被光致抗蚀剂62覆盖的部分)然后可以例如经由蚀刻或另一种合适的技术来去除。这暴露了凹陷28的第二部分78和间隙区域30。

如图28e中示出的，然后使用任何合适的沉积技术(取决于材料，固化或不固化)，将第二官能化层64施加在光致抗蚀剂62和包括凹陷28的第二部分78的基底26的部分(例如，暴露的表面s)，以及间隙区域30上。

如图28f中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂62，这也去除了其上的任何第二官能化层64。

在图28g中，第二官能化层64的一部分被去除。特别地，将第二官能化层64从间隙区域30去除。在该实例中，去除包括从间隙区域30抛光第二官能化层64(和可能存在的任何第一官能化层60)。

抛光工艺可以用温和的化学浆料(包括，例如，研磨剂、缓冲液、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该温和的化学浆料可以从间隙区域30去除第二官能化层64(和可能存在的任何第一官能化层60)，而不有害地影响在这些区域处的下面的基底26或图案化树脂54’。可选择地，抛光可以用不包含研磨颗粒的溶液来进行。

化学浆料可以用于化学机械抛光系统中以抛光间隙区域30的表面。抛光头/衬垫或其他抛光工具能够从间隙区域30抛光第二官能化层64(和可能存在的任何第一官能化层60)，同时将区域14、16留在凹陷28中，至少大体上保持完整。作为实例，抛光头可以是strasbaughviprrii抛光头。

清洁和干燥过程可以在抛光后进行。清洁过程可以利用水浴和声处理。水浴可以被保持在从约22℃至约30℃的范围内的相对低的温度。干燥过程可以包括旋转干燥，或经由另一种合适的技术的干燥。

在一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图28a至图28g中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图28a至图28g中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图28b)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图28g)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图28e)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图28g)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何接枝技术来完成。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对图案化树脂54’不具有亲和力。

虽然在图28a至图28g中未示出，但是该示例性方法还可以包括在第一官能化区域14上沉积第一自组装单层(sam)，并且在第二官能化区域16上沉积第二自组装单层(sam)。在使用自组装的单层的实例中，在sams形成之后，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’被接枝。

用于制造图3a和图3b中示出的实例的另一种示例性方法在图29a至图29h中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。此外，图3a和图3b描绘了限定在单层基底26中的凹陷28，而示例性方法描绘了限定在多层基底的支撑物52上的图案化树脂54’中的凹陷28。应当理解，该方法可以用于单层基底。

在该实例中，多层基底包括支撑物52上的(图案化)树脂54’。如图29a中示出的，图案化树脂54’中限定的凹陷28’邻接间隙区域30，间隙区域30分隔彼此相邻的凹陷28’。凹陷28’是多级或多深度凹陷，其包括部分地由图案化树脂54’的阶梯部分74限定的深部分70和浅部分72。

在该实例中，牺牲层被施加在图案化树脂54’上，使得牺牲层至少部分地填充凹陷28’中的深部分70。示例性牺牲层76是具有不同于该方法中使用的树脂54’和光致抗蚀剂62的蚀刻速率的任何材料。合适的牺牲层材料76的实例包括硅、铝、负性光致抗蚀剂或正性光致抗蚀剂、铜等。这些材料可以使用本文公开的任何合适的技术来沉积。虽然未示出，但是应当理解，除了沉积在深部分70的至少一部分中，牺牲层也可以沉积在间隙区域30和阶梯部分74上，或者完全填充凹陷28’。

然后顺序地去除牺牲层的一部分和树脂54’的一部分。牺牲层可以首先被回蚀刻，使得它从间隙区域30和阶梯部分74去除，并且使得牺牲层在深部分70中的剩余部分(在图29b中以参考标记80示出)基本上与阶梯部分74齐平。如图29b中示出的，树脂54’的若干部分被去除。例如，树脂54’的部分被去除以形成新的(被称为第二)间隙区域30’，该间隙区域30’基本上与牺牲层80的剩余部分齐平，并且树脂54’被去除以除去阶梯部分74。阶梯部分74的去除形成了与牺牲层80的剩余部分相邻的凹陷28’的地区/部分76。

如图29c中示出的，第一官能化层60被施加在牺牲层80的剩余部分、地区/部分76和(第二)间隙区域30’上。如图29d中示出的，然后光致抗蚀剂62被施加在第一官能化层60上。

光致抗蚀剂62的部分和下面的第一官能化层60然后可以被去除，以暴露牺牲层80的剩余部分和间隙区域30’。这在图29e中示出。该去除过程可以通过用蚀刻剂蚀刻来完成，该蚀刻剂选择性地去除光致抗蚀剂62的部分和下面的第一官能化层60，但是不去除牺牲层80的剩余部分。在该实例中，湿蚀刻可以用碱性ph显影剂溶液诸如naoh、koh或tmah(四甲基氢氧化铵)进行，或者干蚀刻可以用氧等离子体进行。在该实例中，当牺牲层80的剩余部分暴露时，蚀刻停止。这留下了在地区/部分76处第一官能化层60上具有光致抗蚀剂的第二部分62”的第一官能化层60的第二部分(例如，区域14)。

如图29f示出的，然后牺牲层80的剩余部分被去除以暴露与第一官能化层60的第二部分(例如，区域14)相邻的第二地区/部分78。该去除过程可以通过用蚀刻剂蚀刻来完成，该蚀刻剂选择性地去除剩余的牺牲层76，但是不去除其上具有光致抗蚀剂的第二部分62”的第一官能化层60的第二部分(例如，区域14)。作为实例，铝牺牲层80可以在酸性条件或碱性条件下去除，铜牺牲层80可以使用fecl3来去除，光致抗蚀剂牺牲层80可以使用有机溶剂诸如丙酮来去除，或者在碱性(ph)条件下去除；并且硅牺牲层80可以在碱性(ph)条件下去除。

如图29g中示出的，然后使用任何合适的沉积(以及如果适用的话，固化)技术，将第二官能化层64施加至地区/部分78。这形成了第二官能化区域16。如图29g中示出的，第二官能化层64还可以被施加在光致抗蚀剂的第二部分62”和间隙区域30上。

如图29g中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂的第二部分62”，这也去除了其上的任何第二官能化层64。这形成了第一官能化区域14。还可以进行抛光以从间隙区域30’去除第二官能化层64。

虽然图29a至29h中示出的实例包括光致抗蚀剂62，但是应当理解，如果第二官能化层64未粘附到第一官能化层60，则光致抗蚀剂62可以被省略。此外，如果牺牲层80是第一官能化层60不粘附的透明材料，则牺牲层80可以不被去除，并且区域16可以在牺牲层80上形成。

在一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图29a至图29h中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图29a至图29h中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图29c)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图29h)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图29g)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图29h)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何接枝技术来完成。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对图案化树脂54’不具有亲和力。

虽然在图29a至图29h中未示出，但是该示例性方法还可以包括在第一官能化区域14上沉积第一自组装单层(sam)，并且在第二官能化区域16上沉积第二自组装单层(sam)。在使用自组装的单层的实例中，在sams形成之后，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’被接枝。

用于制造图3a和图3b中示出的实例的仍另一种示例性方法在图30a至图30f中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。此外，图3a和图3b描绘了限定在单层基底26中的凹陷28’，而示例性方法描绘了限定在多层基底的支撑物52上的图案化树脂54’中的凹陷28’。应当理解，该方法可以用于单层基底。

如图30a中示出的，在该实例中，多层基底包括支撑物52上的未图案化树脂54和树脂54上的牺牲层80。可以使用树脂54、支撑物52和牺牲层80的任何实例。

如图30b中示出的，另外的树脂被施加至牺牲层80，并且被图案化以在其中限定凹陷28’。另外的树脂可以与树脂54相同或不同。凹陷28’是多级或多深度凹陷，其包括部分地由图案化树脂54’的阶梯部分74限定的深部分70和浅部分72。

如图30c中示出的，蚀刻图案化树脂54’的第一部分(邻接深部分70)和牺牲层80在深部分70下面的一部分。这暴露了树脂54的部分82。在一个实例中，图案化树脂54’可以使用各向异性氧等离子体来蚀刻，以暴露牺牲层80的下面部分，并且然后可以使用例如bcl3和cl2等离子体去除牺牲层80的部分。

如图30d中示出的，图案化树脂54’的阶梯部分74被使用例如氧等离子体蚀刻掉。这暴露了在阶梯部分74下面的牺牲层80。所使用的蚀刻剂可以蚀刻树脂54’，但不可以蚀刻牺牲层80。因此，牺牲层80充当蚀刻停止层，并且因此牺牲层80的部分102’被暴露。

应当理解，当蚀刻树脂54’时，初始间隙区域30可以缩短。因此，形成间隙区域30’。

同样如图30d中示出的，可以沉积第一官能化层60(并且在一些情况下固化)。第一官能化层60可以不粘附到牺牲层80的暴露的部分102’，但是将粘附到树脂54的部分82和凹陷28’周围的间隙区域30’。

然后可以蚀刻掉牺牲层80的暴露的部分102’(例如，取决于材料，使用碱性溶液或fecl3)，并且可以沉积第二官能化层64(并且取决于材料来固化)。如图30e中示出的，第二官能化层64被施加至树脂54的新暴露的部分(此处部分102’已经被去除)。在一个实例中，第一官能化层60对第二官能化层64不具有亲和力，并且因此第二官能化层64不沉积在第一官能化层60上。在方法的该实例中，如图30f中示出的，可以进行抛光以从间隙区域30’去除第一官能化层60。

在图30a至图30f的方法的一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图30a至图30f中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图30a-图30f中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图30a或图30d)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图30f)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图30e)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图30f)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何接枝技术来完成。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对图案化树脂54’不具有亲和力。

虽然在图30a至图30f中未示出，但是该示例性方法还可以包括在第一官能化区域14上沉积第一自组装单层(sam)，并且在第二官能化区域16上沉积第二自组装单层(sam)。在使用自组装的单层的实例中，在sams形成之后，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’被接枝。

用于制造图3a和图3b中示出的实例的仍另一种示例性方法在图31a至图31i中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。此外，图3a和图3b描绘了限定在单层基底26中的凹陷28’，而示例性方法描绘了限定在多层基底的支撑物52上的图案化树脂54’中的凹陷28’。应当理解，该方法可以用于单层基底。

如图31a示出的，多层基底包括支撑物52上的(图案化)树脂54’。图案化树脂54’中限定的凹陷28’邻接间隙区域30，间隙区域30分隔彼此相邻的凹陷28’。凹陷28’是多级或多深度凹陷，其包括部分地由图案化树脂54’的阶梯部分74限定的深部分70和浅部分72。

如图31b中示出的，第一官能化层60被施加在图案化树脂54’上。第一官能化层60可以是本文公开的任何实例，并且可以使用本文描述的任何技术来沉积。

在图31c和图31d中，第一官能化层60然后被图案化以形成被光致抗蚀剂62覆盖的第一官能化区域(区域14)。在该实例中，光致抗蚀剂62是负性光致抗蚀剂(暴露的区域变得不可溶)。如图31c中示出的，光致抗蚀剂62被施加至第一官能化层60，选择性地暴露于某些波长的光以形成不溶性区域(在图31d中的62处示出的)，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分。如图31d中示出的，第一官能化层60的暴露的部分(例如，未被光致抗蚀剂62覆盖的部分)然后可以例如经由蚀刻或另一种合适的技术来去除。第一官能化层60的剩余部分(例如，区域14)在各个多级凹陷的第一级。在该实例中，第一级在支撑物52上的深部分70中。

在该实例中，牺牲层84被施加在光致抗蚀剂62和树脂54’的部分(例如，间隙区域30、阶梯部分74的表面)上。牺牲层84在图31e中示出。任何材料可以用作相对于树脂54’具有蚀刻差异的牺牲层84。在一个实例中，铝可以用作牺牲层84。

如图31f中示出的，牺牲层84从树脂54’的部分去除。牺牲层84可以首先被回蚀刻，使得它从间隙区域30和阶梯部分74去除，并且使得牺牲层的剩余部分(在图31f中以参考标记84’示出)保持在深部分70中的光致抗蚀剂62上。

然后树脂54’的区域(具体地阶梯区域74)从多层凹陷28’中去除，以产生邻接第一官能化区域14的地区/部分78(例如，第一官能化层60的位于光致抗蚀剂62下方的部分)和牺牲层的剩余部分84’。该过程还可以去除间隙区域30的部分，产生新的间隙区域30’。该去除过程可以通过用蚀刻剂诸如氧等离子体蚀刻来完成，该蚀刻剂选择性地去除树脂54’，但不去除牺牲层的剩余部分84’。

如图31h中示出的，然后使用任何合适的沉积技术将第二官能化层64施加在牺牲层84的剩余部分上、施加在地区/部分78上以及施加在间隙区域30’上。

如图31i中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂62，这也去除了牺牲层的剩余部分84’和其上的任何第二官能化层64。间隙区域30’上的任何第二官能化层64也可以经由抛光去除。

在图31a至图31i的方法的一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图31a至图31i中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图31a至图31i中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图31b)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图31i)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图31h)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图31i)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何接枝技术来完成。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对图案化树脂54’不具有亲和力。

虽然在图31a至图31i中未示出，但是该示例性方法还可以包括在第一官能化区域14上沉积第一自组装单层(sam)，并且在第二官能化区域16上沉积第二自组装单层(sam)。在使用自组装的单层的实例中，在sams形成之后，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’被接枝。

在图31a至图31i中示出的实例中的整个处理中，多级凹陷28’变成单级凹陷28，如图3a中示出的。

图4a至图4c图示出了位于凹陷28的不同部分的区域14、16的不同实例。

在图4a中，区域14、16之间有空隙36。因此，流动池的该实例包括分隔第一引物组12a、12b、12c、12d(在区域14，未在图4a中示出)和第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’(在区域16，未在图4b中示出)的空隙36。在一个实例中，空隙36是其中形成区域14、16的各个聚合物部分之间的空间。图31a至图31i中示出的任何方法可以被修改以形成空隙36。空隙36可以具有大于零的任何可测量的长度。在一个实例中，空隙36大于1nm。在一个实例中，空隙在从约1nm至约10nm的范围内。

在图4b中，区域14、16部分地重叠。重叠区域38是其中引物18、20或18’、20’和引物19、21或19’、21’两者被接枝的地区。在一个实例中，当引物18、20或18’、20’被接枝时以及当引物19、21或19’、21’被接枝时，通过使聚合物层32的相同部分暴露，可以在图案化和接枝过程期间形成该重叠区域38。在另一个实例中，当分别接枝的引物18、20或18’、20’和引物19、21或19’、21’在该过程期间或之后物理重叠或相互扩散时，可以形成该重叠区域38。

在图4c中，其中分别产生区域14、16的凹陷28’的第一部分和第二部分具有不同的深度。可以使用本文描述的任何凹陷深度，只要凹陷28’的一部分比凹陷28’的另一部分深即可。当经由例如纳米压印、蚀刻等形成凹陷28’时，可以产生不同的深度。

用于制造图4c中示出的实例的一种示例性方法在图32a至图32f中示出。虽然在整个说明书中提及了引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’，但是为了清楚起见，没有示出它们。此外，图4c描绘了限定在单层基底26中的凹陷28’，而示例性方法描绘了限定在多层基底的支撑物52上的图案化树脂54’中的凹陷28’。应当理解，该方法可以用于单层基底。

如图32a示出的，多层基底包括支撑物52上的(图案化)树脂54’。图案化树脂54’中限定的凹陷28’邻接间隙区域30，间隙区域30分隔彼此相邻的凹陷28’。凹陷28’是多级或多深度凹陷，其包括部分地由图案化树脂54’的阶梯部分74限定的深部分70和浅部分72。

如图32b中示出的，第一官能化层60被施加在图案化树脂54’上。第一官能化层60可以是本文公开的任何实例，并且可以使用本文描述的任何技术来沉积，并且如果合适的话，还可以被固化。

在图32c和图32d中，第一官能化层60然后被图案化以形成被光致抗蚀剂62覆盖的第一官能化区域(区域14)。在该实例中，光致抗蚀剂62是负性光致抗蚀剂或正性光致抗蚀剂。如图32c中示出的，光致抗蚀剂62被施加至第一官能化层60，选择性地暴露于某些波长的光以形成不溶性区域或可溶性区域(取决于所使用的抗蚀剂)，并且暴露于显影剂溶液以去除可溶性部分。如图32d中示出的，第一官能化层60的暴露的部分(例如，未被光致抗蚀剂62覆盖的部分)然后可以经由例如蚀刻或另一种合适的技术来去除。在该实例中，第一官能化层60和树脂54’可以具有蚀刻差异。第一官能化层60的剩余部分(例如，区域14)在各个多级凹陷的第一级。在该实例中，第一级在树脂54’上的深部分70中。

如图32e中示出的，然后使用任何合适的沉积技术将第二官能化层64施加在树脂54’的暴露的部分上(例如，施加在间隙区域30和阶梯部分74上)。取决于材料，第二官能化层64也可以被固化。在一个实例中，光致抗蚀剂62对第二官能化层64不具有亲和力，并且因此第二官能化层64不沉积在光致抗蚀剂62上。在另一个实例中，第二官能化层64可以沉积在光致抗蚀剂62上，但是当光致抗蚀剂62被剥离时，可以与光致抗蚀剂62一起去除。

如图32f中示出的，然后可以剥离光致抗蚀剂62，这在一些情况下也去除了其上的任何第二官能化层64。间隙区域30上的任何第二官能化层64也可以经由抛光去除。

在图32a至图32f的方法的一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图32a至图32f中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图32a至图32f中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图32b)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图32f)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图32e)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图32f)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何接枝技术来完成。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对图案化树脂54’不具有亲和力。

虽然在图32a至图32f中未示出，但是该示例性方法还可以包括在第一官能化区域14上沉积第一自组装单层(sam)，并且在第二官能化区域16上沉积第二自组装单层(sam)。在使用自组装的单层的实例中，在sams形成之后，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’被接枝。

图5、图6a和图6b图示出了不同实例，其中基底26包括由间隙区域30分隔的凹陷28；各个凹陷包括第一区域14；并且第二区域16位于至少一些间隙区域30上。因此，在这些实例中，一个区域14位于凹陷28中，而另一个区域16位于邻接凹陷28的基底表面s上。在图5中示出的实例中，基底表面s上的区域16紧邻凹陷28。在图6a和图6b中示出的实例中，基底表面s上的区域16围绕凹陷28。现在将参考图7a至图7g和图8a至图8f描述用于制造在基底表面s的至少一部分上的凹陷28中的区域14、16中的一个和区域16、14中的另一个的示例性方法。

用于制造图6a和图6b中示出的实例的一种示例性方法在图7a至图7g中示出。如图7a中示出的，所述方法利用具有由间隙区域30分隔的多于一个的凹陷28的基底26。在该示例性方法中，聚合物层32沉积在基底26上，并且从间隙区域30抛光，如参考图3a和图3b描述的。这将聚合物层32留在凹陷28中，而不留在间隙区域30上。如果期望区域14处于凹陷28中，则引物18、20或18’、20’可以使用本文公开的任何实例来接枝。如果期望区域16处于凹陷28中，则引物19、21或19’、21’可以使用本文公开的任何实例来接枝。在图7b中示出的实例中，引物18、20或18’、20’被接枝到聚合物层32。应当理解，引物18、20或18’、20’将接枝到凹陷28中的聚合物层32，而不会接枝到间隙区域30，如图7b中示出的。

在该方法的一些实例中，基底26(其具有在凹陷28中形成的区域14或16)暴露于封端剂。封端剂包括可与聚合物层32的任何未反应的官能团(例如，没有与引物18、20或18’、20”反应的任何官能团)反应的化学物质，以便使这些官能团在后续处理期间不起作用。该过程可以降低后续沉积的聚合物层32’粘附到区域14的能力。换句话说，聚合物层32和后续沉积的聚合物层32’之间的相互作用降低，使得很少或没有聚合物层32’粘附到聚合物层32。这继而降低了后续沉积的引物(例如19、21或19’、21’)接枝到覆盖区域14的地区的能力。

在聚合物层32包括叠氮化物官能团的实例中，封端剂中的化学物质可以是还原剂，诸如膦。示例性的膦是三(羟丙基)膦。聚合物层32的未反应的叠氮化物将被膦还原，这使它们对于额外的引物接枝不起作用。

如图7c中示出的，所述方法然后包括沉积第二聚合物层32’。聚合物层32’可以是在聚合物层32中使用的相同的聚合物，或者可以是与在聚合物层32中使用的不同类型的聚合物。在一个实例中，第一聚合物32和第二聚合物32’中的每种是丙烯酰胺共聚物，诸如pazam。聚合物层32’可以仅涂覆间隙区域30，或者可以除间隙区域30之外还涂覆至少一些区域14。聚合物层32’是否至少部分地涂覆区域14将取决于在聚合物层32上使用的封端剂。

在该实例中，模板多核苷酸链，包括不可裂解的第一模板链40和可裂解的第二模板链42，可以分别使用引物18或18’和20，20’在区域14中形成。在模板多核苷酸链形成的开始，文库模板可以从任何核酸样品(例如，dna样品或rna样品)制备。核酸样品可以被片段化为单链的、相似大小(例如，<1000bp)的dna或rna片段。在制备期间，衔接子可以被添加至这些片段的末端。通过减少循环扩增，不同基序可以被引入衔接子，诸如测序结合位点、索引(indice)和与区域14中的引物18或18’和20、20’互补的区域。最终的文库模板包括dna或rna片段和在两个末端的衔接子。在一些实例中，来自单个核酸样品的片段具有添加至其的相同的衔接子。

多于一个的文库模板可以被引入基底26。这可以包括将模板流体引入流动池。模板流体可以包括液体载体和多于一个的文库模板。因为基底26包括在凹陷28中的区域14的阵列，所以多个文库模板与例如固定在其中的两种类型的引物18、18’或20、20’中的一种杂交。

然后可以进行簇生成。在簇生成期间，来自模板流体的模板被扩增以在至少一些凹陷28中形成簇。在簇生成的一个实例中，使用高保真的dna聚合酶从杂交的引物18，18’或20，20’通过3’延伸来拷贝文库模板。原始文库模板被变性，使拷贝(copies)固定在区域14中。等温桥扩增可以用于扩增固定的拷贝。例如，经拷贝的模板在相邻的互补引物20、20’或18、18’上成环并且与相邻的互补引物20、20’或18、18’杂交，并且聚合酶拷贝经拷贝的模板以形成双链桥，双链桥被变性以形成两条单链。这两条链在相邻的互补引物20、20’或18、18’上成环并且与相邻的互补引物20、20’或18、18’杂交，并且再次延伸以形成两条新的双链环。通过等温变性和扩增的循环对各个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。每簇双链桥被变性，产生被附接至不可裂解的第一引物18、18’的不可裂解的第一模板链40和被附接至可裂解的第二引物20、20’的可裂解的第二模板链42，如图7d中示出的。应当理解，引物的可裂解性驱动附接至其的模板链的可裂解性。因为被附接至可裂解的第二引物20、20’的第二模板链42包括裂解位点22，所以可裂解的第二模板链42是可裂解的。聚簇的该实例是桥扩增，并且是可以进行的扩增的一个实例。应当理解，可以使用其他扩增技术，诸如排除扩增(examp)工作流程(illuminainc.)。

应当理解，因为第二聚合物层32’不具有接枝至其的引物18、18’或20、20’，所以扩增过程不会延伸超过各个凹陷28。

然后引发流体可以被引入基底26。引发流体包括液体载体和第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’，该第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’不同于已经被引入凹陷28中的第一引物组12a、12b、12c、12d。引发流体中的液体载体可以是任何能够支持点击化学的液体，诸如磷酸盐缓冲盐水(pbs)、盐水柠檬酸钠(ssc)、基于碳酸盐的缓冲液等。在该实例中，引发流体中的引物组包括引物19或19’和21或21’。应当理解，如果引物组12a’、12b’、12c’、12d’(包括引物19或19’和21或21’)被首先接枝以在凹陷28中形成区域16，则引发流体可以包括引物组12a、12b、12c、12d(包括引物18或18’和20或20’)。

引发流体中的引物19或19’和21或21’可以接枝到覆盖间隙区域30的第二聚合物层32’。因为第二聚合物层32’可以不粘附到聚合物层32，因为扩增已经在区域14中进行，并且因为下面的聚合物层32的官能团已经变得不起作用，所以引物19或19’和21或21’可以不接枝到暴露的聚合物层32。

如图7e中示出的，接枝的引物19或19’和21或21’附接至覆盖间隙区域30的第二聚合物层32’，这形成区域16。

然后可以进行另外的扩增。例如，桥扩增可以从簇到接枝的引物19或19’和21或21’启动，以便在至少一些间隙区域上形成第二簇。在该轮扩增期间，不可裂解的第一模板链40在相邻的互补引物21、21’上成环并且与相邻的互补引物21、21’杂交，而可裂解的第二模板链42在相邻的互补引物19、19’上成环并且与相邻的互补引物19、19’杂交。链40、42分别被延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增的循环对各个模板拷贝重复该过程，以产生从凹陷28生长到间隙区域30的密集的克隆簇。另外的每簇双链桥被变性，产生被附接至不可裂解的第二引物21、21’的不可裂解的第二模板链44和被附接至可裂解的第一引物19、19’的可裂解的第一模板链46，如图7f中示出的。因为被附接至可裂解的第一引物19、19’的可裂解的第一模板链46包括裂解位点22’或23，所以可裂解的第一模板链46是可裂解的。

应当理解，当不可裂解的第一模板链40是正向链时，不可裂解的第二模板链44是反向链，并且当不可裂解的第一模板链40是反向链时，不可裂解的第二模板链44是正向链。类似地，当可裂解的第一模板链46是正向链时，可裂解的第二模板链42是反向链，并且当可裂解的第一模板链46是反向链时，可裂解的第二模板链42是正向链。

然后，取决于裂解位点22、22’或22、23，通过引入化学剂或酶促裂解剂，可裂解的第一模板链46和可裂解的第二模板链42可以被去除。如图7g中示出的，在裂解后，不可裂解的第一模板链40保持在凹陷28中的区域14中，并且不可裂解的第二模板链44保持在间隙区域30上的区域16中。在进行裂解后的一个实例中，区域14包括正向链，并且区域16包括反向链。

用于制造图5、图6a和图6b中示出的实例的另一种示例性方法在图8a至图8f中示出。如图8a中示出的，所述方法利用具有由间隙区域30分隔的多于一个的凹陷28的基底26。在该示例性方法中，聚合物层32沉积在基底26上，使得它存在于凹陷28中和间隙区域30上。如果期望区域14处于凹陷28中，则引物18、20或18’、20’可以使用本文公开的任何实例来接枝。如果期望区域16处于凹陷28中，则引物19、21或19’、21’可以使用本文公开的任何实例来接枝。在图8b中示出的实例中，引物18、20或18’、20’被接枝到聚合物层32。应当理解，引物18、20或18’、20’将接枝到整个基底26上的聚合物层32，如图8b中示出的。

在该示例性方法中，如图8c中示出的，然后将保护涂层48沉积在具有接枝至其的引物组12a、12b、12c、12d的聚合物层32上。保护涂层48可以是剥离抗蚀剂。该类型的保护涂层48可以在工艺中在期望的时间旋涂、固化并随后去除。保护涂层48还可以是水溶性涂层。

然后可以进行蚀刻以暴露其中期望产生包括引物组12a’、12b’、12c’、12d’的区域16的间隙区域30。例如，与各个凹陷28相邻的基底表面s的分离的部分可以经由蚀刻来暴露，以形成图5中示出的实例。对于另一个实例，围绕整个凹陷28的基底表面s的部分可以经由蚀刻来暴露，以形成图6a和图6b中示出的实例。图8d图示出了在进行蚀刻以暴露间隙区域30之后的基底26的一个实例。在该实例中，等离子体蚀刻可以用空气或氧气进行。

然后，该示例性方法可以包括将基底表面s的暴露的部分硅烷化。硅烷化将粘附促进剂引入基底表面s，以帮助第二聚合物层32’粘附至其。

然后沉积第二聚合物层32’。如图8e中示出的，第二聚合物层32’可以沉积在基底表面s的暴露的部分上(例如，在间隙区域30处)和沉积在保护涂层48上。在该示例性方法中，聚合物层32’可以是在聚合物层32中使用的相同的聚合物，或者可以是与在聚合物层32中使用的不同类型的聚合物。

如图8f中示出的，第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’的引物19、19’和21、21’然后可以接枝到聚合物层32’以产生区域16。接枝可以使用本文描述的任何方法进行。在另一个实例中，聚合物层32’可以用引物19、19’和21、21’预接枝。

虽然未示出，但是应当理解，该示例性方法然后可以包括去除保护涂层48。作为实例，剥离方法可以用于去除保护涂层48和任何聚合物层32’以及其上的引物19、19’和21、21’。如果保护涂层48是水溶性的，去除可以包括将涂层48溶解在水中，这也将去除任何覆盖的聚合物层32’和引物19、19’和21、21’。保护涂层的去除暴露了区域14处的所有引物18、18’和20、20’，以及区域16处的所有引物19、19’和21、21’。

虽然在图8a至图8f中未示出，但是应当理解，然后可以将多于一个的文库模板引入基底26。因为基底26包括在凹陷28中的区域14的阵列，所以多个(mutiple)文库模板与例如固定在其中的两种类型的引物18、18’或20、20’中的一种杂交。在该实例中，因为基底26还包括在至少一些间隙区域30上的区域16的阵列，所以多个文库模板与例如固定在其中的两种类型的引物19、19’或21、21’中的一种杂交。然后可以如本文描述的进行簇生成。可裂解模板的裂解也可以通过裂解可裂解的第一引物19、19’和可裂解的第二引物20、20’来进行。

图9图示出了位于凹陷28的不同部分的区域14、16的又另一个实例。在该实例中，区域14或16中的一个是位于凹陷28中的珠50的一部分。珠50包括核心结构49和核心结构49表面处的区域16。在该实例中，区域16可以包括固有地存在于核心结构49的表面的官能团，或通过任何合适的官能化技术(例如，化学反应、用含反应性基团的聚合物涂覆核心结构49等)被掺入到核心结构49的表面上的官能团。

虽然图9中示出了单个凹陷28，但是应当理解，在一些实例中，基底26包括由间隙区域30分隔的多于一个的凹陷28；并且各个凹陷包括：第一区域14所位于的第一部分；和第二部分；并且流动池还包括位于第二部分的珠50，其中第二区域16在珠的表面。参考图11a至图20，在本文中在“基于珠的流动池”部分中进一步描述了该实例的若干变型。

图10描绘了区域14、16的仍另一个示例性配置。在该实例中，区域14、16位于分开的基底26、26’上。因此，流动池的该实例包括：第一基底26；被附接至第一基底26的第一引物组12a，所述第一引物组包括不可裂解的第一引物18、18’和可裂解的第二引物20、20’；与第一基底26相对的第二基底26’；和被附接至第二基底26’的第二引物组12a’，所述第二引物组12a’包括可裂解的第一引物19、19’和不可裂解的第二引物21、21’。作为用于制造该流动池的方法的一个实例，基底26、26’各自可以用聚合物层(例如，32，在图10中未示出)涂覆，第一引物组12a(或12b、12c或12d)可以接枝到一个基底26，并且第二引物组12a’(或12b’、12c’或12d’)可以接枝到另一个基底26’。

虽然在相应的基底表面s上示出，但是应当理解，区域14、16可以可选择地分别位于基底26、26’的凹陷28中。在该实例中，聚合物层可以沉积在凹陷28中和间隙区域30上，并且然后可以经由抛光从间隙区域30去除。第一引物组12a(或12b、12c或12d)可以接枝到一个基底26的凹陷28，并且第二引物组12a’(或12b’、12c’或12d’)可以接枝到另一个基底26’的凹陷。

在该实例中，可以期望基底26、26’紧密靠近，使得模板接种和聚簇可以成功地进行。在一个实例中，“紧密靠近”意指两个基底26、26’之间的距离为约100μm或更小。在另一个实例中，两个基底26、26’之间的距离在约10μm至约90μm的范围内。

第一区域14和第二区域16以及引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’可以在基底表面s上宏观分离，或者可以存在于彼此宏观分离的分开的凹陷28中，而不是位于分开的基底26、26’上。宏观分离意指区域14、16彼此分隔至少5μm。在一个实例中，区域14、16彼此分隔从约5μm至约100μm的范围内的距离。

图33a描绘了区域14、16的仍另一个示例性配置。在该实例中，第一官能化层60和第二官能化层64被整合到多层基底的树脂部分中。如图33a中示出的，多层基底的该实例包括支撑物52；支撑物52上的第一官能化层60；第一官能化层60上的第二官能化层64；和第二官能化层64上的钝化层86。

在该实例中，第一官能化层60和第二官能化层64可以是任何纳米压印光刻术树脂，该纳米压印光刻术树脂具有或能够具有引入至其的表面官能团，该表面官能团可以分别附接至引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’。在一个实例中，层60可以用环氧基基团官能化，并且层64可以用胺基团官能化。

如果在形成图33a中示出的多层基底之前，将引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’分别预接枝到层60、64中，则层60、64的树脂可以是相同的。在该方法的这些实例中，在第一官能化层60被掺入到多层基底之前，第一引物组12a、12b、12c、12d(例如，不可裂解的第一引物18、18’和可裂解的第二引物20、20’)可以被预接枝到第一官能化层60；并且在第二官能化层64被掺入到多层基底之前，第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’(例如，可裂解的第一引物19、19’和不可裂解的第二引物21、21’)可以被预接枝到第二官能化层64。

这些层(无论是否预接枝)可以使用本文公开的任何实例来沉积在支撑物52上。

当引物在压印后被接枝时，应当理解，层60、64至少具有可以分别附接至引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’的不同的表面官能团。可以使用本文公开的任何树脂。

钝化层86可以是可以被压印的任何疏水层。作为实例，钝化层86选自由以下组成的组：氟化聚合物、全氟化聚合物、硅聚合物及其混合物。作为实例，钝化层86可以包括无定形的氟聚合物(其商业上可获得的实例包括来自agcchemicals的系列中的那些，它们具有以下末端官能团中的一种：a类型：-cooh，m类型：-conh-si(or)n或s类型：-cf3)、聚四氟乙烯(其商业上可获得的实例是来自chemours的)、聚对二甲苯、氟化烃、氟丙烯酸共聚物(其商业上可获得的实例包括来自cytonix的)。钝化层86可以使用本文公开的任何实例来沉积在支撑物52上。

如图33a中示出的，所述方法的该实例包括压印多层基底，从而形成由钝化层86的间隙区域30分隔的特征(例如凹陷28)，其中第一官能化层和第二官能化层各自的区域14、16分别暴露在各个特征/凹陷28处。单个特征/凹陷28的暴露的区域14、16和钝化层86的周围间隙区域30从图33b中的俯视图示出。对于各个区域14、16，特征/凹陷28具有倾斜的底部或阶梯区域，或从特征/凹陷28的顶部暴露层60的一部分和层64的一部分的几何结构的一些其他变型。

为了压印多层基底，将纳米压印光刻术模具或工作印模56压靠在树脂层54上，以在层60、64、68中产生特征的压印。换句话说，层60、64、68中的每个被工作印模56的突出物凹进或穿孔。然后，层60、64、68可以在工作印模56就位的情况下固化。固化可以通过以下来完成：暴露于光化辐射，诸如可见光辐射或紫外(uv)辐射，或者当使用光致抗蚀剂时暴露于从约240nm至380nm的范围内的波长的辐射；或者当使用可热固化的抗蚀剂时通过暴露于热。固化可以促进聚合和/或交联。作为实例，固化可以包括多个阶段，包括软烘烤(例如，去除溶剂)和硬烘烤。软烘烤可以在从约50℃至约150℃的范围内的较低温度进行。硬烘烤的持续时间可以在从约100℃至约300℃的范围内的温度持续从约5秒至约10分钟。可以用于软烘烤和/或硬烘烤的装置的实例包括热板、烘箱等。

在固化后，释放工作印模56。这在层60、64、68中产生地形特征，即凹陷28。

如提及的，引物18、20或18’、20’(在图33a或图33b中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14；并且引物19、21或19’、21’(在图33a或图33b中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’和/或引物19、21或19’、21’没有被分别预接枝到第一官能化层60和第二官能化层64。在这些实例中，区域14、16具有不同的官能团，并且引物18、20或18’、20’和引物19、21或19’、21’可以在压印后被接枝。

当在压印后进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何接枝技术来完成。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对钝化层86不具有亲和力。

如提及的，凹陷28的一些实例可以呈沟槽的形式。图34s描绘了区域14、16的仍另一个示例性配置(俯视图)，其中它们在沟槽28”中形成。

如图34a示出的，多层基底包括支撑物52上的(图案化)树脂54’。图案化树脂54’(例如，nil树脂、sio2等)中限定的沟槽28”邻接间隙区域30，间隙区域30将相邻的沟槽28”彼此分隔(参见，例如图34h，其图示出了多个沟槽28”的俯视图)。

如图34b中示出的，牺牲层84被施加在树脂54’(例如，间隙区域30和沟槽28”)上。任何材料可以用作相对于树脂54’和相对于所使用的第二牺牲层88具有蚀刻差异的牺牲层84。在一个实例中，牺牲层84是硅、铝或铬。

如图34c中示出的，牺牲层84被从树脂54’的部分去除。在该实例中，牺牲层84可以被蚀刻，使得牺牲材料的区域84”保持直接邻接各个沟槽28”的各侧壁90。在蚀刻后，间隙区域30和各个沟槽28”的底部部分被暴露。

如图34d中示出的，第二牺牲层88被施加在牺牲材料的区域84”和树脂54”的任何暴露的区域(例如间隙区域30和沟槽28”的底部部分)。任何材料可以用作相对于树脂54’和相对于所使用的牺牲层84具有蚀刻差异的第二牺牲层88。例如，如果层84是硅，则层88可以是铝或铬。

牺牲层84、88可以使用本文描述的任何沉积技术来施加。

如图34e中示出的，第二牺牲层88被从牺牲材料的区域84”和树脂54’的部分去除。在该实例中，第二牺牲层88可以被蚀刻，使得第二牺牲材料的区域88”保持直接邻接各个牺牲材料区域84”。在该实例中，在蚀刻后，间隙区域30和各个沟槽28”的另一个(更小)底部部分被暴露。

如图34f中示出的(描绘俯视图)，材料92被沉积以填充第二牺牲材料区域84”之间的任何空间。换句话说，另外的材料92覆盖各个沟槽28”的底部部分，并且完全分隔第二牺牲材料的区域88’。另外的材料92可以是与树脂54’相同的材料。例如，如果二氧化硅用作树脂54’，则另外的材料92可以是二氧化硅。另外的材料92帮助限定小于沟槽28”的新的沟槽28”’(其中区域14、16将被限定)。

在方法的该实例中，如图34g中示出的，可以进行抛光以从间隙区域30’去除另外的材料92。

图34h描绘了用两个牺牲材料/层84”、88’填充的沟槽28”’的俯视图。如所示的，各个牺牲材料/层84”、88’延伸各个沟槽28”’的长度。

图34i描绘了用两个牺牲材料/层84”、88’填充的沟槽28”’中的一个的横截面图。

如图34j中示出的，牺牲材料区域84”从各个沟槽28”’的一部分去除。这暴露了将要形成第一官能化区域14处的地区/部分76。牺牲材料区域84”可以被蚀刻，并且由于不同的蚀刻速率，该蚀刻工艺不影响树脂54’或第二牺牲材料区域88’。

在图34k中，第一官能化层60被施加在间隙区域30、地区76和第二牺牲材料区域88’上。第一官能化层60可以是本文公开的任何实例，并且可以使用本文描述的任何技术来沉积。

在图34k、图34l和图34m中，第一官能化层60然后被图案化以在地区/部分76中形成被光致抗蚀剂62覆盖的第一官能化区域(区域14)。光致抗蚀剂62和下面的第一官能化层60可以被抛光或蚀刻掉，使用间隙区域30和第二牺牲材料区域88’作为蚀刻停止区域。这在沟槽28”’的地区/部分76中形成被光致抗蚀剂62覆盖的第一官能化区域14。

如图34n中示出的，第二牺牲材料区域88’从各个沟槽28”’的一部分去除。这暴露了将要形成第二官能化区域16处的地区/部分78。第二牺牲材料区域88’可以被蚀刻，并且由于不同的蚀刻速率，该蚀刻工艺不影响树脂54’或光致抗蚀剂62。第一官能化层60的暴露的部分可以在该蚀刻工艺期间被去除。

在图34o中，第二官能化层64被施加在间隙区域30、地区78、光致抗蚀剂62和区域14的任何暴露的部分上。第二官能化层64可以是本文公开的任何实例，并且可以使用本文描述的任何技术来沉积。

在图34p中，然后可以剥离光致抗蚀剂62，这去除了其上的任何第二官能化层64。在本文公开的任何实例中，可以进行声处理以改进光致抗蚀剂剥离或剥离工艺的效率。

在图34q中，间隙区域30可以被抛光以去除其上的任何第二官能化层64。如图34q中示出的，区域14、16在沟槽28”’的相应区域中形成。应当理解，区域14、16延伸沟槽28”’的长度(如图34r中示出的)。区域14、16的该配置可以用于使用本文公开的引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’进行同时的配对末端读段测序。

在图34r中，第二光致抗蚀剂62’被施加(并暴露和显影)，以形成至少基本上垂直于沟槽28”’的空间上分隔的条带的图案。该图案留下了第一官能化区域14和第二官能化区域16暴露在空间上分隔的条带之间的部分，如图34r中示出的。第一官能化区域14和第二官能化区域16暴露在空间上分隔的条带之间的部分被去除(例如，经由蚀刻)，并且然后空间上分隔的条带(第二光致抗蚀剂62’)被去除(例如，经由蚀刻)。在去除空间上分隔的条带(第二光致抗蚀剂62’)之后，空间上分隔的条带(第二光致抗蚀剂62’)下面的区域14、16保持完整，如图34s中示出的。在该实例中，各个区域14、16是沿沟槽28”’的隔离对(isolatedpairs)。

在一些实例中，引物18、20或18’、20’(在图34a至图34s中未示出)可以预接枝到第一官能化层60，并且因此被附接至第一官能化区域14。类似地，引物19、21或19’、21’(在图34a至图34s中未示出)可以预接枝到第二官能化层64，并且因此被附接至第二官能化区域16。在这些实例中，不进行另外的引物接枝。

在其他实例中，引物18、20或18’、20’未被预接枝到第一官能化层60。在这些实例中，引物18、20或18’、20’可以在施加第一官能化层60之后接枝(例如，在图34k)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物18、20或18’、20’可以在方法结束时接枝(例如，在图34s)，因为它们将不会接枝到区域16的表面官能团。

类似地，引物19、21或19’、21’可以不预接枝到第二官能化层64。在这些实例中，引物19、21或19’、21’可以在施加第二官能化层64之后接枝(例如，在图34o)。如果区域14、16具有不同的官能团，引物19、21或19’、21’可以在方法结束时接枝(例如，在图34s)，因为它们将不会接枝到区域14的表面官能团。

当在所述方法期间进行接枝时，接枝可以使用本文公开的任何实例来进行。用任何接枝方法，引物18、20或18’、20’与区域14的反应性基团反应，或者引物19、21或19’、21’与区域16的反应性基团反应，并且对树脂54’不具有亲和力。

在流动池的仍另一个实例中，区域14、16可以分别在官能化支撑结构93、94上形成，如图35中示出的。官能化支撑结构93、94具有表面官能团，使得它们可以分别附接本文公开的引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’。本文公开的核心结构49的任何实例可以用于官能化支撑结构93、94。还可以使用本文公开的能够附接不同引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’的任何表面官能团。官能化支撑结构93、94可以例如使用本文公开的用于形成官能化珠50的方法来形成(参见“基于珠的流动池”部分)。

在一些实例中，官能化支撑结构93、94也可以具有不同的形状。在一些实例中，各个形状分别对应于基底(其可以是如本文描述的单层基底或多层基底)的表面s上的或在表面s中限定的捕获位点95、96的形状(图36a、图36b、图37a和图37b中示出的)。例如，官能化支撑结构93、94可以分别具有与井捕获位点95、96相同的形状(下文描述的)。不同的形状将有助于官能化支撑结构93被物理地截留在互补形状的井捕获位点95中，并且有助于官能化支撑结构94被物理地截留在互补形状的井捕获位点96中。

在一些实例中，官能化支撑结构93、94也可以具有不同的捕获化学物质。捕获化学物质是能够使结构93、94附接至基底表面s上的期望位置的化学物质。在一些实例中，官能化支撑结构93、94的捕获化学物质分别对应于将接收相应的官能化支撑结构93、94的捕获位点95、96的捕获化学物质。例如，官能化支撑结构93和捕获位点95各自可以包括一种类型的受体-配体结合对的成员，而官能化支撑结构94和捕获位点96各自可以包括不同类型的受体-配体结合对的成员。不同的化学物质可以帮助确保官能化支撑结构93、94(以及分别对应的区域14、16)被捕获在基底表面s上的期望的区域。

捕获位点95、96能够物理地和/或化学地分别将官能化支撑结构93、94固定在基底26(或多层基底的树脂54’)上。捕获位点95、96可以位于期望具有相邻区域14、16的任何合适的位置。捕获位点95、96在基底26上的位置可以是均匀的(参见图36a和图36b)或者可以是非均匀的。捕获位点95、96可以具有任何合适的形状、几何结构和尺寸，这可以至少部分地取决于捕获位点95、96的配置(例如，贴片、井、突出物等)，以及将由捕获位点95、96捕获的官能化支撑结构93、94的类型。

在一些实例中，捕获位点95、96是被施加在基底表面s的一部分上的不同化学捕获剂。可以使用本文公开的化学捕获剂的任何实例。在一个实例中，相应的化学捕获剂可以使用微接触印刷或另一种合适的技术来沉积在期望的位置。

在其他实例中，捕获位点95、96包括限定在基底26(或树脂54’)的表面s中的相应的井。取决于所使用的基底(例如，单层或多层)，可以使用蚀刻或压印来形成井。井可以具有任何合适的形状和几何结构，诸如本文针对凹陷28所阐述的那些形状和几何结构。

在一些实例中，井不具有被添加至其的另外的化学捕获剂。在这些实例中，开口尺寸使得官能化支撑结构93、94能够分别自组装到相应的井中(例如，基于形状)。在其他实例中，井确实具有被添加至其的相应的化学捕获剂。

捕获位点95、96的其他实例包括井和在其表面上具有化学捕获剂的捕获珠。捕获珠可以被定尺寸以适合放入井中。在一些实例中，捕获珠可以与相邻的间隙区域30、30’共平面或者略微延伸高于相邻的间隙区域30、30’，使得最终附接至其的官能化支撑结构93、94不被限制在井内。在一个实例中，捕获珠选自由二氧化硅、超顺磁性材料、聚苯乙烯和丙烯酸酯组成的组。本文公开的化学捕获剂的任何实例可以用在捕获珠的表面上，并且可以在捕获珠被引入井中之前涂覆在捕获珠上。这些捕获位点95、96的井和珠的配置可以使得官能化支撑结构93、94(当附接时)形成彼此相邻接的区域14、16。

捕获位点95、96井的深度可以取决于是否将要将化学捕获剂引入其中以及是否将要将捕获珠引入其中而变化。深度可以选择成至少容纳这些材料(即，材料被包含在井内)。在一个实例中，井的深度在从约1nm至约5微米的范围内。

作为另一个实例，捕获位点95、96包括限定在基底26(或树脂54’)中的突出物。突出物是从相邻表面向外(向上)延伸的三维结构。突出物可以经由蚀刻、光刻术、压印等产生。

虽然任何合适的三维几何结构可以用于突出物捕获位点95、96，但是具有至少基本平坦的顶表面的几何结构可以是合意的。示例性突出物几何结构包括球体、圆柱体、立方体、多边棱柱形(例如，矩形棱柱形、六边形棱柱形等)或类似形状。

不同的化学捕获剂可以被分别施加突出物捕获位点95、96的顶表面上。可以使用本文公开的化学捕获剂的任何实例，并且可以使用任何沉积技术将化学捕获剂施加至突出物的顶表面。

应当理解，虽然捕获位点95、96已经被描述为都是捕获剂、井等，但捕获位点95、96类型的任何组合可以一起在流动池中使用(例如捕获剂和井)。

在图36a中，表面s上的捕获位点95、96具有不同的形状。当分别具有相应形状的官能化支撑结构93、94被加载到流动池中时(图36b)，官能化支撑结构93、94通过物理挤出和/或通过捕获化学来自组装，使得官能化支撑结构93附接至捕获位点95，且官能化支撑结构94附接至捕获位点96。

在图37a中，表面s上的捕获位点95、96也具有不同的形状，但是与图36a中示出的实例不同地布置。当分别具有相应形状的官能化支撑结构93、94被加载到流动池中时(图37b)，官能化支撑结构93、94通过物理挤出和/或通过捕获化学来自组装，使得官能化支撑结构93附接至捕获位点95，且官能化支撑结构94附接至捕获位点96。

图36b和图37b中示出的两种配置导致区域14、16的阵列处于基底表面s上分离的位置。

图2至图10、图33a、图34s、图36b和图37b图示出了流动池的区域14、16的不同配置，其中没有结合至基底26(或树脂54’)的盖。虽然未示出，但是应当理解，流动池可以具有结合至间隙区域30、30’的至少一部分的盖。在一些实例中，盖可以在引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’接枝之前或之后结合。当在引物接枝之前结合盖时，应当理解，可以使用流通过程以用于接枝。在流通过程中，引物溶液或混合物可以通过相应的输入端口(未示出)被引入流动通道(限定在盖和间隙区域30、30’之间)，可以在流动通道中保持充分的时间(即孵育期)，以用于将引物18、18’、20、20’、19、19’、21、21’分别附接至区域14、16，并且然后可以从相应的输出端口(未示出)去除。在引物18、18’、20、20’、19、19’、21、21’附接之后，另外的流体可以被引导通过流动通道以洗涤现在官能化的凹陷和流动通道。

盖可以位于间隙区域30上，使得它限定单个流动通道或多个流体分离的流动通道。

盖可以是对指向基底26的激发光透明的任何材料。作为实例，盖可以是玻璃(例如硼硅酸盐、熔融二氧化硅等)、塑料或类似物。合适的硼硅酸盐玻璃的商业上可获得的实例是从schottnorthamerica,inc.可获得的d合适的塑料材料，即环烯烃聚合物的商业上可获得的实例是从zeonchemicalsl.p.可获得的产品。

在一些实例中，盖可以与侧壁一体形成，侧壁对应于将与其结合的间隙区域30的部分的形状。例如，凹槽(recess)可以被蚀刻到透明块中，以形成大体上平坦的(例如，顶)部分和从大体上平坦的部分延伸的侧壁。当蚀刻的块被安装至间隙区域30时，凹槽可以成为流动通道。在其他实例中，侧壁和盖可以是彼此耦合的单独部件。例如，盖可以是大体上矩形的块，其具有至少大体上平坦的外表面和至少大体上平坦的内表面，所述块限定流动通道的一部分(例如，顶部部分)(一旦结合至间隙区域30的部分)。该块可以安装到(例如，结合至)侧壁上，该侧壁结合至间隙区域30的部分并形成流动通道的侧壁。在该实例中，侧壁可以包括在本文中关于间隔层(下文描述)阐述的任何材料。

盖可以使用任何合适的技术，诸如激光结合、扩散结合、阳极结合、共晶结合、等离子活化结合、玻璃料结合或本领域中已知的其他方法来结合。在一个实例中，间隔层可以用于将盖结合至间隙区域30的部分。间隔层可以是将至少一些间隙区域30和盖密封在一起的任何材料。

在一个实例中，间隔层可以是吸收在由盖和/或基底26(或，例如基底26的图案化树脂)透射的波长的辐射的辐射吸收材料。所吸收的能量继而在间隔层和盖之间以及在间隔层和基底26之间形成结合。该辐射吸收材料的实例是在约1064nm吸收的来自dupont(usa)的黑色(含炭黑的聚酰亚胺)。应当理解，聚酰亚胺可以在不添加炭黑的情况下使用，除了波长必须被改变为由天然聚酰亚胺材料显著吸收的波长(例如，480nm)。作为另一个实例，当用532nm的光照射时，聚酰亚胺cenjp可以被结合。当间隔层是辐射吸收材料时，间隔层可以位于在盖和间隙区域30的部分之间的界面处，使得间隔层接触期望的结合区域。可以施加压缩(例如，约100psi的压力)，同时将合适波长的激光能量施加至界面(即，辐射吸收材料被照射)。激光能量可以从顶部和底部两者施加至界面，以便实现合适的结合。

在另一个实例中，间隔层可以包括与其接触的辐射吸收材料。辐射吸收材料可以施加在间隔层和盖之间的界面处以及在间隔层和间隙区域30的部分之间的界面处。作为实例，间隔层可以是聚酰亚胺，并且单独的辐射吸收材料可以是炭黑。在该实例中，单独的辐射吸收材料吸收激光能量，该激光能量形成间隔层和盖之间以及间隔层和间隙区域30的部分之间的结合。在该实例中，可以在相应的界面处施加压缩，同时将在合适波长处的激光能量施加至界面(即辐射吸收材料被照射)。

同时配对末端测序方法

包括本文描述的引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’的流动池的任何实例可以用于同时配对末端测序，其中正向链和反向链(例如，链40和44)被同时读取。

一旦在区域14中产生不可裂解的第一模板链40的簇，并且在区域16中产生不可裂解的第二模板链44的簇(参考图7c至图7g描述的)，游离端可以被封闭以防止不期望的引发。应当理解，保持的任何引物的游离端也可以被封闭。

在这些方法中，可以添加掺入混合物，其包括能够分别与不可裂解的第一模板链40和不可裂解的第二模板链44杂交的测序引物。监测测序引物分别沿模板链40、44的延伸，以确定模板链40、44中的核苷酸序列。潜在的化学过程可以是聚合(例如，由聚合酶催化)或连接(例如，由连接酶催化)。在特定的基于聚合酶的过程中，荧光标记的核苷酸以模板依赖模式被添加至相应的测序引物，使得检测添加至相应的测序引物的核苷酸的顺序和类型可以被用来确定模板的序列。例如，为了启动第一个合成测序循环，一个或更多个标记的核苷酸、dna聚合酶等可以被递送至流动池/递送通过流动池，其中测序引物延伸导致标记的核苷酸被掺入分别与模板40、44互补的新生链中。可以通过成像事件串联检测掺入事件，而没有分别在的模板40、44处产生的荧光信号的实质物理重叠。这允许分别在模板40、44处的同时碱基调用。在成像事件期间，照明系统(未示出)可以向流动池提供激发光，并且可以捕获和分析图像。作为实例，照明可以用激光器、发光二极管、平面波导或类似物来实现。

在一些实例中，荧光标记的核苷酸还可以包括可逆终止特性，所述可逆终止特性在核苷酸已被分别添加至模板40、44后终止进一步的引物延伸。例如，具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可以被添加至模板40、44，使得随后的延伸不能发生，直到解封剂被递送以去除该部分。因此，对于使用可逆终止的实例，解封试剂可以被递送至流动池等(在检测发生之后)。

洗涤可以在不同的流体递送步骤之间进行。然后测序循环可以重复n次以将模板延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。

配对末端测序允许用户对片段的两端测序，并产生高质量、可对齐的序列数据。配对末端测序有助于检测基因组重排和重复序列元件，以及基因融合和新的转录物。虽然已经详细描述了一个示例性的配对末端测序方法，但是应当理解，本文描述的流动池可以与其他测序方案一起用于基因分型，或者用于其他化学应用和/或生物应用。在又另一个实例中，本文公开的流动池可以用于细胞上文库产生。

试剂盒

本文描述的流动池的任何实例可以是试剂盒的一部分。

试剂盒的一些实例包括流动池、模板混合物/流体和掺入混合物(incorporationmix)。流动池的这些实例都具有附接至其的引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’。模板混合物/流体包括待测序的模板，并且掺入混合物包括能够分别与不可裂解的第一模板链40和不可裂解的第二模板链44(使用模板形成)杂交的测序引物。

试剂盒的其他实例包括本文描述的流动池和引发流体。流动池的这些实例具有被附接至其的一个引物组12a、12b、12c或12d，并且引发流体可以用于引入另一个引物组12a’、12b’、12c’或12d’。在试剂盒的一个实例中，流动池包括：基底26，其包括由间隙区域30分隔的凹陷28；各个凹陷中的第一聚合物层32，其中第一聚合物层的一些官能团被封端；第一引物组12a、12b、12c或12d，其被附接至各个凹陷28中的第一聚合物层32的其他官能团；以及间隙区域30上的第二聚合物层32’；并且引发流体包括流体载体和不同于第一引物组12a、12b、12c或12d的第二引物组12a’、12b’、12c’或12d’。该示例性试剂盒还可以包括模板混合物和掺入混合物。

基于珠的流动池

图9描绘了流动池的一种配置，其中区域14或16之一是珠50的一部分。本部分描述了该流动池配置的各种实例和方法。

本文公开的该流动池10a(图13d和图14)、流动池10b(图15d和图16)、流动池10c(图17d和图18)、流动池10d(图19d和图20)的实例包括支撑物52和支撑物52上的图案化树脂54’、54”，图案化树脂包括由间隙区域30分隔的凹陷28a、28b或28c。图11a至图11d一起描绘了用于图案化树脂54以形成凹陷28a、28b或28c的方法的实例。更具体地，图11a至图11c描绘了凹陷28a、28b的形成，并且图11a、图11b和图11d描绘了凹陷28c的形成。

图11a描绘了支撑物52，并且图11b描绘了在支撑物52上沉积的树脂54。本文描述的基底12的任何实例可以用于支撑物52。

合适的树脂54的一些实例选自由以下组成的组：笼状聚倍半硅氧烷树脂(poss)基树脂、环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂及其组合。虽然已经提供了若干实例，但是认为可以使用任何可以被固化的树脂。

如本文使用的，术语“笼状聚倍半硅氧烷(poss)”和“poss基树脂”指的是一种化学组合物，其是二氧化硅(sio2)和硅氧烷(r2sio)之间的混合中间体(rsio1.5)。poss的实例可以是在kehagias等人,microelectronicengineering86(2009),第776-778页中描述的，其通过引用以其整体被并入。该组合物是具有化学式[rsio3/2]n的有机硅化合物，其中r基团可以相同或不同的。该组合物可以包含一个或更多个不同的笼或核心结构作为单体单元。在一些情况下，结构包括以下多八面体笼或核心结构。在一些情况下，多面体结构可以是t8结构，诸如：并且由表示。该单体单元通常具有八个官能团臂r1至r8。

单体单元可以具有含有10个硅原子和10个r基团的笼结构，被称为t10，诸如：或者可以具有含有12个硅原子和12个r基团的笼结构，被称为t12，诸如：poss基材料可以包括t6、t14或t16笼结构。平均笼含量可以在合成期间调节，和/或通过纯化方法来控制，并且单体单元的笼尺寸的分布可以用于本文公开的实例。作为实例，任何笼结构可以以所使用的全部poss单体单元的约30％至约100％范围内的量存在。poss基材料可以是笼结构与开放和部分开放笼结构的混合物。因此，poss基树脂前体或树脂可以包括环氧基poss材料，其可以是倍半硅氧烷构型的混合物。例如，本文描述的任何poss材料可以是离散poss笼和非离散倍半硅氧烷结构和/或不完全缩合的离散结构的混合物，诸如聚合物、梯形物(ladder)及类似物。因此，部分缩合的材料将在一些硅顶点包括如本文描述的环氧基r基团，但是一些硅原子不会被r基团取代，而可以被oh基团取代。在一些实例中，poss材料包括各种形式的混合物，诸如：

在本文公开的一些实例中，r1至r8或r10或r12中的至少一个包含环氧基，并且因此poss被称为环氧基poss。在一些实例中，大多数臂，诸如八个、十个或十二个臂或r基团，包括环氧基基团。在其他实例中，r1至r8或r10或r12是相同的，并且因此r1至r8或r10或r12中的每一个包含环氧基基团。在仍其他实例中，r1至r8或r10或r12不相同，并且因此r1至r8或r10或r12中的至少一个包含环氧基，并且r1至r8或r10或r12中的至少另一个是非环氧基官能团。非环氧基官能团可以是(a)与环氧基基团正交反应的反应性基团(即，在不同于环氧基基团的条件下反应)，其用作用于将树脂与扩增引物、聚合物或聚合剂偶联的手柄；或者(b)调节树脂的机械性质或功能性质，例如表面能调节的基团。在一些实例中，非环氧基官能团选自由以下组成的组：叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、氨基、羟基、炔基、酮、醛、酯基团、烷基、芳基、烷氧基和卤代烷基。在一些方面中，选择非环氧基官能团以增加树脂的表面能。在这些其他实例中，环氧基基团与非环氧基基团的比率在从7:1至1:7、或9:1至1:9、或11:1至1:11的范围内。在任何实例中，二取代或单取代(末端)的环氧基基团允许单体单元在使用紫外(uv)光和酸引发时聚合成交联的基质。在一些方面中，环氧基poss包含末端环氧基基团。该类型的poss的实例是具有以下结构的缩水甘油基poss：

环氧基poss也可以是改性的环氧基poss，其包括受控自由基聚合(crp)剂和/或被掺入树脂或核心结构或笼结构中的另一个感兴趣的官能团，作为官能团r1至r8或r10或r12中的一个或更多个。

在本文公开的poss基树脂的其他实例中，r1至r8或r10或r12中的每一个包括任何非环氧基基团，诸如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙二醇或短聚乙二醇链(多达50个重复单元)。可以使用可以自由基聚合的任何非环氧基poss单体。一个实例是具有以下结构的甲基丙烯酰基poss笼混合物：

另一个实例是具有以下结构的peg-poss笼混合物：

在peg-poss实例中，r基团的末端甲基基团(ch3)可以被x替代，其中x是丙烯酰基基团、甲基丙烯酰基基团或另一种合适的端基。

还可以使用其他树脂54。实例包括(非poss)环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(其可以是开环的环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂及其组合。作为实例，可以使用包括环氧基和丙烯酸酯单体的树脂，或者可以使用包括环氧基和乙烯单体的树脂。

合适的树脂54的另一个实例是无定形的氟聚合物。商业上可获得的无定形(非结晶)的氟聚合物的实例是来自bellex的

如图11b中示出的，树脂54沉积在支撑物52上。在一个实例中，树脂54的沉积包括化学气相沉积、浸涂、浸泡涂布、旋涂、喷涂、水坑分配、超声喷涂、刮刀涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷或喷墨印刷。

然后，使用本文提及的任何图案化技术使沉积的树脂54图案化。在图11b中示出的实例中，纳米压印光刻术用于使树脂54图案化。在树脂54沉积后，可以将其软烘烤以去除过量的溶剂。将纳米压印光刻术模具或工作印模56压靠在树脂54层上，以在树脂54上产生压印。换句话说，树脂54被工作印模56的突出物凹进或穿孔。然后，树脂54可以在工作印模56就位的情况下固化。固化可以通过暴露于光化辐射，诸如可见光辐射或紫外(uv)辐射，或者当使用光致抗蚀剂时暴露于从约240nm至380nm的范围内的波长的辐射；或者当使用可热固化的抗蚀剂时通过暴露于热来完成。固化可以促进聚合和/或交联。作为实例，固化可以包括多个阶段，包括软烘烤(例如，以去除溶剂)和硬烘烤。软烘烤可以在从约50℃至约150℃的范围内的较低温度进行。硬烘烤的持续时间可以在从约100℃至约300℃的范围内的温度持续从约5秒至约10分钟。可以用于软烘烤和/或硬烘烤的装置的实例包括热板、烘箱等。

在固化后，释放工作印模56。这在树脂54中产生地形特征，即凹陷28a和28b或28c。如图11c中示出的，具有其中限定的凹陷28a和28b的树脂54被称为图案化树脂54’。如图11d中示出的，具有其中限定的凹陷28c的树脂54被称为图案化树脂54”。图案化树脂54’、54”可以经历进一步的硬烘烤以完成固化并锁定在压印的地形中。在一些实例中，硬烘烤可以在从约60℃至约300℃的范围内的温度进行。

图11c中示出的凹陷28a和28b具有不同的尺寸。在该实例中，“不同尺寸”意指一些凹陷28b具有比一些其他凹陷28a更小的开口尺寸。在该实例中，“开口尺寸”指的是被图案化树脂54’上的各个凹陷开口占据的面积和/或图案化树脂54’上的各个凹陷开口的直径。在图11c中示出的实例中，各个凹陷28b的开口的面积和直径小于各个凹陷28a的开口的面积和直径。较大凹陷28a的开口的面积和直径取决于待引入其中的珠50的颗粒尺寸(例如直径)。较小凹陷28b的开口的面积和直径小于珠50的颗粒尺寸。这些开口尺寸使得珠50能够通过尺寸排阻自组装到凹陷28a，而不是凹陷28b中。

图11d中示出的凹陷28c包括两个互连但具有不同的尺寸的部分34、34’。在该实例中，“不同尺寸”意指各个凹陷28c的部分34’具有比部分34更小的开口尺寸。同样在该实例中，“开口尺寸”指的是被图案化树脂54”上的各个部分开口占据的面积和/或图案化树脂54”上的各个部分开口的直径。在图11d中示出的实例中，各个部分34’的开口的面积和直径小于各个部分34的开口的面积和直径。较大部分34的开口的面积和直径取决于待引入其中的珠50的颗粒尺寸(例如直径)。较小部分34’的开口的面积和直径小于珠50的颗粒尺寸。这些开口尺寸使得珠50能够通过尺寸排阻自组装到部分34，而不是部分34’中。

表面上的各个凹陷开口或部分开口的面积的实例可以是至少约1×10^-3μm²、至少约1×10^-2μm²、至少约0.1μm²、至少约1μm²、至少约10μm²、至少约100μm²或更大。可选择地或另外地，面积可以是至多约1×10³μm²、至多约100μm³、至多约10μm²、至多约1μm²、至多约0.1μm²、至多约1×10^-2μm²或更小。在一些情况下，各个凹陷28a、28b或部分34、34’的直径可以是至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。可选择地或另外地，直径可以是至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。各个凹陷开口或部分开口的面积和直径可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。可以使用任何期望的面积和直径，只要凹陷28a的开口的面积和直径大于凹陷28b的开口的面积和直径，或者只要凹陷28c的部分34的开口的面积和直径大于凹陷28c的部分34’的开口的面积和直径即可。

可以设想凹陷28a和28b或28c的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个实例中，凹陷28a和28b或28c被设置成六边形网格用于紧密填充和改进的密度。其他布局可以包括例如直线(即矩形)布局、三角形布局等，只要凹陷28a或部分34可以容纳官能化珠50(例如，其上形成有区域16的核心结构49，如例如图13c、图14等中示出的)。在一些实例中，布局或图案可以是呈行和列的x-y格式的凹陷28a和28b或28c。在一些其他实例中，布局或图案可以是凹陷28a和28b或28c和/或间隙区域30的重复布置。在仍其他实例中，布局或图案可以是凹陷28a和28b或28c和/或间隙区域30的随机布置。图案可以包括条带、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格、方格、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。

应当理解，凹陷28a和28b或28c的布局或图案可以关于密度和/或平均间距来表征，如本文描述的。

仍进一步地，凹陷28a和28b或28c可以具有任何合适的深度。

用于使用图11c中示出的图案化树脂54’或图11d中示出的图案化树脂54”制造流动池的实例的方法100的实例在图12中被描绘。如图12中示出的，方法100包括选择性地将聚合物32施加在支撑物52上的图案化树脂54’或54”的凹陷28a、28b或28c中(参考标记102)；将第一引物组12a、12b、12c、12d接枝到至少一些凹陷28a、28b或28c中的聚合物32(参考标记104)；以及在接枝第一引物组12a、12b、12c、12d之前或之后，将官能化珠50沉积在i)至少一些凹陷28c中的各个凹陷的一部分中，或沉积在ii)具有比至少一些凹陷28b的开口尺寸更大的开口尺寸的第二凹陷28a中，所述官能化珠50包括被附接在核心结构49的表面的第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’，其中第一引物组和第二引物组12a、12a’或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’不同。涉及凹陷28a、28b的该方法100的不同实例将参考图13a至图13d和图14以及图15a至图15d和图16来进一步描述。涉及凹陷28c的该方法100的不同实例将参考图17a至图17d和图18以及图19a至图19d和图20来进一步描述。

图13a描绘了包括较大凹陷28a和较小凹陷28b的图案化树脂54’。为了清楚起见，省略了凹陷16a和16b的深度。

图13b描绘了将聚合物32选择性地施加到各个凹陷28a和28b中。聚合物32的选择性施加可以包括多个过程，包括间隙区域30和凹陷28a、28b中的暴露的表面的活化，将聚合物32沉积在活化的间隙区域30和凹陷28a、28b中，以及从间隙区域30去除聚合物32。

在一些实例中，活化包括将包括图案化树脂54’的间隙区域30和暴露在凹陷28a、28b中的支撑物52的区域的表面硅烷化。硅烷化可以使用任何硅烷或硅烷衍生物来完成。硅烷或硅烷衍生物的选择可以部分取决于待形成的聚合物32，因为可能期望在硅烷或硅烷衍生物和聚合物32之间形成共价键。用于附接硅烷或硅烷衍生物的方法可以取决于所使用的硅烷或硅烷衍生物而变化。本文阐述了若干实例。

合适的硅烷化方法的实例包括气相沉积(例如，yes方法)、旋涂或其他沉积方法。

在使用yescvd烘箱的实例中，将其上具有图案化树脂54’的支撑物52放置在cvd烘箱中。腔室可以排气，并且然后开始硅烷化循环。在循环期间，硅烷或硅烷衍生物容器可以保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷约120℃)，硅烷或硅烷衍生物蒸气管线保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷约125℃)，并且真空管线保持在合适的温度(例如，约145℃)。

在另一个实例中，硅烷或硅烷衍生物(例如，液体降冰片烯硅烷)可以沉积在玻璃瓶内，并与其上具有图案化树脂54’的支撑物52放置在玻璃真空干燥器内。然后可以将干燥器抽空至从约15mtorr至约30mtorr的范围内的压力，并放置在从约60℃至约125℃的范围内的温度的烘箱内。允许硅烷化进行，并且然后将干燥器从烘箱中取出，冷却并在空气中通风。

气相沉积、yes方法和/或真空干燥器可以与各种硅烷或硅烷衍生物一起使用，所述各种硅烷或硅烷衍生物诸如包括以下的那些硅烷或硅烷衍生物：环烯烃不饱和部分诸如降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，包括氧或氮代替碳原子之一的(杂)降冰片烯)、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、反式环戊烯、反式环庚烯、反式环壬烯、双环[3.3.1]壬-1-烯、双环[4.3.1]癸-1(9)-烯、双环[4.2.1]壬-1(8)-烯以及双环[4.2.1]壬-1-烯。这些环烯烃中的任一种可以例如被r基团诸如氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基(heteroalicyclyl)、芳烷基或(杂脂环基)烷基取代。降冰片烯衍生物的实例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。作为其他实例，当硅烷或硅烷衍生物包括环炔烃不饱和部分诸如环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)时，可以使用这些方法。这些环炔烃可以被本文描述的任何r基团取代。

硅烷或硅烷衍生物的附接在间隙区域30上和凹陷28a、28b中形成活化的表面。

聚合物层32然后可以如本文描述的施加。作为实例，聚合物(例如pazam)可以使用旋涂、或浸渍或浸涂、或官能化分子在正压或负压下的流动、或另一种合适的技术来沉积。沉积形成聚合物层32的聚合物可以存在于混合物中。在一个实例中，混合物包括水中或乙醇和水的混合物中的pazam。

在涂覆后，包含聚合物的混合物也可以暴露于固化过程，以在图案化树脂54’的活化的间隙区域30和凹陷28a、28b中形成聚合物层32。在一个实例中，固化可以在从室温(例如，约25℃)至约95℃的范围内的温度进行持续从约1毫秒至约几天的范围内的时间。在另一个实例中，时间可以在从10秒至至少24小时的范围内。在仍另一个实例中，时间可以在从约5分钟至约2小时的范围内。

聚合物层32与活化(在该实例中硅烷化)的表面的附接可以通过共价键合。共价连接对在各种使用期间在最终形成的流动池的整个寿命期间将至少第一引物组12a、12b、12c、12d保持在凹陷28b中是有帮助的。以下是在活化(例如，硅烷化)的表面和聚合物层32之间可以发生的反应的一些实例。

当硅烷或硅烷衍生物包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作为不饱和部分时，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)经历与pazam的叠氮化物/叠氮基基团的1,3-偶极环加成反应；ii)经历与附接至pazam的四嗪基团的偶联反应；经历与附接至pazam的腙基团的环加成反应；经历与附接至pazam的四唑基团的光点击反应；或者经历与附接至pazam的腈氧化物基团的环加成。

当硅烷或硅烷衍生物包括环辛炔或环辛炔衍生物作为不饱和部分时，环辛炔或环辛炔衍生物可以：i)经历与pazam的叠氮化物/叠氮基的应变(strain)促进的叠氮化物-炔烃1,3-环加成(spaac)反应，或者ii)经历与附接至pazam的腈氧化物基团的应变促进的炔烃-腈氧化物环加成反应。

当硅烷或硅烷衍生物包括双环壬炔(bicyclononyne)作为不饱和部分时，由于双环环体系中的应变，双环壬炔可以经历与附接至pazam的叠氮化物或腈氧化物的类似的spaac炔烃环加成。

在其他实例中，等离子体灰化而不是硅烷化可以用于活化间隙区域30和凹陷28a、28b中的支撑物52的暴露的表面。在等离子体灰化后，包含聚合物的混合物可以直接旋涂(或以其他方式沉积)在等离子体灰化的表面上，并且然后固化以形成聚合物层32。在该实例中，等离子体灰化可以产生表面活化剂(例如羟基基团(c-oh或si-oh)和/或羧基基团)，其可以将聚合物粘附到间隙区域30和凹陷28a、28b中的支撑物52的暴露的表面。在这些实例中，选择聚合物26，使得它与通过等离子体灰化产生的表面基团反应。

无论活化经由硅烷化还是等离子体灰化发生，然后可以进行抛光，以便从活化的间隙区域30去除聚合物层32。抛光可以如本文描述的进行。在一些实例中，抛光还可以去除或还可以不去除邻接间隙区域30的硅烷或硅烷衍生物。当这些硅烷化的部分被完全去除时，应当理解，下面的图案化树脂54’被暴露。

如图13c中示出的，在方法100的该实例中，官能化珠50被沉积到凹陷28a中。各个官能化珠50包括核心结构49和被附接在核心结构49的表面的第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’。第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’不同于如本文描述的第一引物组12a、12b、12c、12d。可以使用引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’的任何实例。

核心结构49可以是本文关于珠/核心结构提及的任何实例。在一个实例中，官能化珠50的核心结构49选自由二氧化硅、超顺磁性材料、聚苯乙烯和丙烯酸酯组成的组。核心结构49可以在其表面上具有用于与第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’共价偶联的反应性基团。这样的反应性基团的实例包括羧酸、脂肪族伯胺、芳香族胺、芳香族氯甲基(例如乙烯基苄基氯化物)、酰胺、酰肼、醛、羟基、硫醇和环氧基。这些反应性基团可以固有地存在于核心结构49的表面，或者可以通过任何合适的官能化技术(例如，化学反应、用含反应性基团的聚合物涂覆核心结构49等)被掺入核心结构49的表面上。具有其固有的反应性基团或其添加的反应性基团或涂层的核心结构49限定了区域16。

在本文公开的利用珠50的实例中，一个引物组12a、12b、12c、12d或12a’、12b’、12c’、12d’可以在3’末端用磷酸酯封闭基团官能化，这将抑制接种后发生任何延伸。一旦发生第一次延伸(用另一引物组12a’、12b’、12c’、12d’或12a、12b、12c、12d)，磷酸酯基团将然后与接种到磷酸酯封闭的引物组12a、12b、12c、12d或12a’、12b’、12c’、12d’的任何链一起被去除，并且然后可以进行两个引物组12a、12b、12c、12d和12a’、12b’、12c’、12d’之间的扩增。该方法将帮助降低多克隆率，因为最初仅一个引物组12a、12b、12c、12d或12a’、12b’、12c’、12d’是可延伸的。

虽然在图13a至图13d中未示出，但是在沉积官能化珠50之前，方法100可以包括通过将第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’附接至核心结构49来形成官能化珠50。官能化可以使用任何合适的技术进行，包括使叠氮基(例如琥珀酰亚胺(nhs)酯)封端的引物与核心结构49表面上的肼反应，或者使炔烃封端的引物与核心结构表面上的叠氮化物反应，或者使氨基封端的引物与核心结构49表面上的活化的羧酸酯基团或nhs酯反应，或者使硫醇封端的引物与烷基化反应物(例如碘代乙酰胺或马来酰亚胺)反应，使亚磷酰胺封端的引物与硫醚反应，或者使生物素修饰的引物与核心结构49表面上的链霉亲和素反应。一些核酸引物19、19’、21、21’可以在离液剂(ki、ni或nascn)的存在下被捕获到二氧化硅珠上。作为一个具体的实例，二苯并环辛炔(dbco，其包括炔烃)封端的引物可以用于无铜点击接枝。

官能化珠50可以使用任何合适的技术沉积在图案化树脂54’上。作为一个实例，官能化珠50可以在液体载体(例如水)中混合，该液体载体可以被加载到图案化树脂54’的表面上。在另一个实例中，官能化珠50可以通过在还包括其上具有图案化树脂54’的支撑物52的振荡器中振荡珠50与50μm至150μm的钢珠而被强制嵌入凹陷28a中。由于官能化珠50的尺寸以及凹陷28a和28b的尺寸，尺寸排阻将防止官能化珠50进入较小的凹陷28b，并且将使得一个官能化珠50能够自组装到一个凹陷28a中。官能化珠50可以物理地截留在相应的凹陷28a中。官能化珠50可以可选择地化学附接在相应的凹陷28a中，例如经由链霉亲和素/生物素接头。

如图13d中示出的，凹陷28b然后可以用第一引物组12a、12b、12c、12d官能化。引物18、18’和20、20’可以是本文公开的任何实例，并且包括可以附接至聚合物层32的反应性基团的官能团。因为凹陷28a中的聚合物层32被官能化珠50覆盖，凹陷28a中的聚合物层32未暴露，并且因此其反应性基团不可用于与第一引物组12a、12b、12c、12d的反应。

引物18、18’和20、20’可以是本文阐述的任何实例，并且彼此不同，并且不同于引物19、19’和21、21’。例如，如果引物21、19包括p5和p7u引物，则引物20、18可以包括p5u和p7引物。在该实例中，第一引物组12a包括不可裂解的第一引物18(例如p7)和可裂解的(例如尿嘧啶修饰的)第二引物(例如p5u)；并且第二引物组12a’包括可裂解的(例如尿嘧啶修饰的)第一引物19(例如p7u)和不可裂解的第二引物21(例如p5)。如本文讨论的，引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’的化学性是正交的，这允许跨越两个引物群体(组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’)的扩增，以及一些产生的模板链(例如42、46)的裂解，在特定区域14或16中留下相同的(正向或反向)模板链40或44。这使得能够同时获得可区分的读段1和读段2信号。

可以进行接枝过程以将引物18、18’和20、20’接枝到凹陷28b中的聚合物层32。在一个实例中，接枝可以通过流过沉积(例如，使用临时结合的盖)、浸泡涂布、喷涂、水坑分配来完成，或者通过将引物18、18’和20、20’附接至凹陷28b中的聚合物层32的另一种合适的方法来完成。这些示例性技术中的每一种可以利用引物溶液或混合物，引物溶液或混合物可以包含引物、水、缓冲液和催化剂。

可以使用浸泡涂布，因为在该实例中，官能化珠50在被引入凹陷28a之前被官能化，并且因此不与浸泡化学物质反应。浸泡涂布可以包括将如图13c中示出的支撑物52(其上具有图案化树脂54’和凹陷28a中的官能化珠50)浸没在一系列温度受控的浴中。浴也可以是流控制的和/或用氮气层覆盖。浴可以包含引物溶液或混合物。在各种浴中，引物18、18’和20、20’附接至聚合物层32的反应性基团。在一个实例中，将支撑物52引入包含引物溶液或混合物的第一浴中，在该第一浴中发生反应以附接引物18、18’和20、20’，并且然后移动到另外的浴中以用于洗涤。从浴到浴的移动可能涉及机械臂，或可以手动进行。干燥系统也可以用在浸泡涂布中。

喷涂可以通过将引物溶液或混合物直接喷雾到如图13c中示出的支撑物52(其上具有图案化树脂54’和凹陷28a中的官能化珠50)上来完成。喷涂的晶片可以在从约0℃至约70℃的范围内的温度孵育持续从约4分钟至约60分钟的范围内的时间。在孵育后，可以使用例如旋涂器稀释和去除引物溶液或混合物。

水坑分配可以根据池和旋转剥离方法来进行，并且因此可以用旋涂器来完成。引物溶液或混合物可以(手动地或经由自动化过程)施加到如图13c中示出的支撑物52(其上具有图案化树脂54’和凹陷28a中的官能化珠50)上。施加的引物溶液或混合物可以被施加至整个表面上或遍布整个表面，包括在官能化珠50和间隙区域30上。引物涂覆的基底可以在从约0℃至约80℃的范围内的温度孵育持续从约2分钟至约60分钟的范围内的时间。在孵育后，可以使用例如旋涂器稀释和去除引物溶液或混合物。

用任何接枝方法，引物18、18’和20、20’与凹陷28b中的暴露的聚合物层32的反应性基团反应，并且对官能化珠50或图案化树脂54’的间隙区域30不具有亲和力。因此，引物18、18’和20、20’选择性地接枝到凹陷28b中的聚合物层32。

图14是图13d中描绘的流动池10a的一部分的横截面图。流动池10a包括：支撑物52；支撑物52上的图案化树脂54’，所述图案化树脂54’包括由间隙区域30分隔的第一凹陷28b和第二凹陷28a，第一凹陷28b具有比第二凹陷28a更小的开口尺寸；被附接在至少一些第一凹陷28b中的第一引物组12a、12b、12c或12d(包括引物18、18’和20、20’)；和分别位于至少一些第二凹陷28a中的官能化珠50，所述官能化珠50包括被附接在核心结构49的表面的第二引物组12a’、12b’、12c’或12d’(包括引物19、19’和21、21’)，其中第二引物组12a’、12b’、12c’或12d’不同于第一引物组12a、12b、12c或12d。在图13d和图14中示出的实例中，聚合物层32存在于第一凹陷28b和第二凹陷28a中，并且第一引物组12a、12b、12c或12d被附接至至少一些第一凹陷28b中的聚合物层32。此外，在图13d和图14中示出的实例中，官能化珠50被放置在至少一些第二凹陷28a中的聚合物层32上。

现在参考图15a至图15d，示出了包括凹陷28a、28b的方法100的另一个实例。图15a描绘了包括较大凹陷28a和较小凹陷28b的图案化树脂54’。为了清楚起见，省略了凹陷28a和28b的深度。

图15b描绘了凹陷28a和28b各自的聚合物层32。聚合物层32可以如本文描述的选择性地施加，这可以包括：活化间隙区域30和凹陷28a、28b中的暴露的表面，将聚合物层32沉积在活化的间隙区域30和凹陷28a、28b中，以及从间隙区域30去除聚合物层32。

在该实例中，如图15c中示出的，然后将引物组12a、12b、12c、12d(包括引物18、18’和20、20’)接枝到各个凹陷28a、28b中的聚合物层32。因为官能化珠50未被引入，所以各个凹陷28a、28b中的聚合物层32被暴露，并且因此其反应性基团可用于与第一引物组12a、12b、12c、12d反应。接枝可以使用参考图13d描述的任何技术来完成。因为聚合物层32暴露在各个凹陷28a、28b中，所以引物18、18’和20、20’可以接枝到各个凹陷28a、28b中。

如图15d中示出的，官能化珠50然后可以被引入凹陷28a(其中具有聚合物层32和引物组12a、12b、12c、12d)。官能化珠50可以使用任何合适的技术沉积在图案化树脂54’上。由于官能化珠50的尺寸以及凹陷28a和28b的尺寸，尺寸排阻将防止官能化珠50进入较小的凹陷28b，并且将使得一个官能化珠50能够自组装到一个凹陷28a中。在该实例中，官能化珠50可以物理地截留在相应的凹陷28a中。可选择地，在该实例中，官能化珠50可以化学地附接在相应的凹陷28a中，例如经由链霉亲和素/生物素接头。

图16是图15d中描绘的流动池10b的一部分的横截面图。流动池10b包括：支撑物52；支撑物52上的图案化树脂54’，所述图案化树脂54’包括由间隙区域30分隔的第一凹陷28b和第二凹陷28a，第一凹陷28b具有比第二凹陷28a更小的开口尺寸；被附接在至少一些第一凹陷28b中的第一引物组12a、12b、12c、12d(包括引物18、18’和20、20’)；和分别位于至少一些第二凹陷28a中的官能化珠50，所述官能化珠50包括被附接在核心结构49的表面的第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’(包括引物19、19’和21、21’)，其中第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’不同于第一引物组12a、12b、12c、12d。在图15d和图16中示出的实例中，聚合物层32存在于第一凹陷28b和第二凹陷28a中，并且第一引物组12a、12b、12c、12d被附接至第一凹陷28b和第二凹陷28a中的聚合物层32。然后，在该实例中，官能化珠50被放置在至少一些第二凹陷28a中的第一引物组12a、12b、12c、12d(包括引物18、18’和20、20’)上。

现在参考图17a至图17d，示出了包括凹陷28c的方法100的实例。

图17a描绘了包括凹陷28c的图案化树脂54”。各个凹陷28c包括较大部分34和较小部分34’。为了清楚起见，省略了凹陷28c(如图11d中示出的)的深度。

图17b描绘了各个凹陷28c中的聚合物层32。如图17b中示出的，各个凹陷28c的较大部分34和较小部分34’两者具有被施加至其的聚合物层32。聚合物层32可以如本文描述的选择性地施加，这在一个实例中可以包括：活化间隙区域30和凹陷28c中的暴露的表面，将聚合物层32沉积在活化的间隙区域30和凹陷28c中，以及从间隙区域30去除聚合物层32。

如图17c中示出的，在方法100的该实例中，官能化珠50被沉积到凹陷28c的较大部分34中。本文描述的任何官能化珠50可以用于该实例。

官能化珠50(包括引物19、19’和21、21’)可以使用任何合适的技术，诸如本文描述的技术，沉积在图案化树脂54”上。由于官能化珠50的尺寸以及部分34和34’的尺寸，尺寸排阻将防止官能化珠50进入较小部分34’，并且将使得一个官能化珠50能够自组装到各凹陷28c的较大部分34中。在该实例中，官能化珠50可以物理地截留在相应的较大部分34中，或者可以化学地附接在相应的较大部分34中，例如经由链霉亲和素/生物素接头。

如图17d中示出的，凹陷28c的较小部分34’然后可以用第一引物组12a、12b、12c、12d官能化。可以使用本文描述的引物18、18’和20、20’的任何实例，只要它们被选择为不同于官能化珠50的引物19、19’和21、21’并与官能化珠50的引物19、19’和21、21’正交。在该实例中，凹陷28c的较大部分34中的聚合物层32被官能化珠50覆盖，并且因此凹陷28c的较大部分34中的聚合物层32未暴露。因此，聚合物反应性基团不可用于与第一引物组12a、12b、12c、12d的反应。较小部分34’中的聚合物反应性基团保持暴露，并且因此可用于与第一引物组12a、12b、12c、12d的反应。引物18、18’和20、20’与较小部分34’中的聚合物层32的接枝可以使用参考图13d描述的任何技术来完成。

图18是图17d中描绘的流动池10c的一部分的横截面图。流动池10c包括：支撑物52；支撑物52上的图案化树脂54”，所述图案化树脂54”包括由间隙区域30分隔的凹陷28c；被附接至至少一些凹陷28c的第一引物组12a、12b、12c、12d(包括引物18、18’和20、20’)；和被放置在至少一些凹陷28c中使得第一引物组12a、12b、12c、12d的至少一些引物18、18’和20、20’暴露的官能化珠50，所述官能化珠50包括被附接在核心结构49的表面的第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’，其中第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’不同于第一引物组12a、12b、12c、12d。在图17d和图18中示出的实例中，各个凹陷28c包括第一部分34和第二部分34’，所述第一部分34具有大于或等于官能化珠50的直径的第一开口尺寸，所述第二部分34’具有小于官能化珠50的直径的第二开口尺寸；并且官能化珠50被放置在至少一些凹陷28c中的各个凹陷的第一部分34中。同样在图17d和图18中示出的实例中，聚合物层32存在于凹陷28c中，并且第一引物组12a、12b、12c、12d被附接至聚合物层32的未被官能化珠50占据的部分(即，被附接至凹陷28c的较小部分34’中的聚合物层32的部分)。

现在参考图19a至图19d，示出了包括凹陷28c的方法100的另一个实例。各个凹陷28c包括较大部分34和较小部分34’。为了清楚起见，省略了凹陷28c(如图11d中示出的)的深度。

图19b描绘了各个凹陷28c中的聚合物层32。如图19b中示出的，各个凹陷28c的较大部分34和较小部分34’两者具有被施加至其的聚合物层32。聚合物层32可以如本文描述的选择性地施加，在该实例中，这可以包括：活化间隙区域30和凹陷28c中的暴露的表面，将聚合物层32沉积在活化的间隙区域30和凹陷28c中，以及从间隙区域30去除聚合物层32。

在该实例中，如图19c中示出的，然后将引物组12a、12b、12c、12d(包括引物18、18’和20、20’)接枝到各个凹陷28c中的聚合物层32。因为官能化珠50未被引入，所以凹陷28c的各个部分34、34’中的聚合物层32被暴露，并且因此其反应性基团可用于与第一引物组12a、12b、12c、12d的反应。接枝可以使用参考图13d描述的任何技术来完成。由于聚合物层32暴露在凹陷28c的各个部分34、34’中，因此引物18、18’和20、20’可以接枝到各个部分34、34’中。

如图19d中示出的，官能化珠50然后可以被引入凹陷28c(其中具有聚合物层32和引物组12a、12b、12c、12d)的较大部分34中。官能化珠50可以使用任何合适的技术沉积在图案化树脂54”上。由于官能化珠50的尺寸以及部分34和34’的尺寸，尺寸排阻将防止官能化珠50进入较小部分34’，并且将使得一个官能化珠50能够自组装到一个较大部分34中。在该实例中，官能化珠50可以物理地截留在相应的较大部分34中，或者可以化学地附接在相应的较大部分34中，例如经由链霉亲和素/生物素接头。

图20是图19d中描绘的流动池10d的一部分的横截面图。流动池10d包括：支撑物52；支撑物52上的图案化树脂54”，所述图案化树脂54”包括由间隙区域30分隔的凹陷28c；被附接至至少一些凹陷28c的第一引物组12a、12b、12c、12d(包括引物18、18’和20、20’)；和被放置在至少一些凹陷28c中使得第一引物组12a、12b、12c、12d的至少一些引物18、18’和20、20’暴露的官能化珠50，所述官能化珠50包括被附接在核心结构49的表面的第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’，其中第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’不同于第一引物组12a、12b、12c、12d。在图19d和图20中示出的实例中，各个凹陷28c包括第一部分34和第二部分34’，所述第一部分34具有大于或等于官能化珠50的直径的第一开口尺寸，所述第二部分34’具有小于官能化珠50的直径的第二开口尺寸；并且官能化珠50被放置在至少一些凹陷28c中的各个凹陷的第一部分34中。同样在图19d和图20中示出的实例中，聚合物层32存在于凹陷28c中，第一引物组12a、12b、12c、12d被附接至凹陷28c中的聚合物层32，并且官能化珠50被放置在第一引物组12a、12b、12c、12d的一些引物18、18’和20、20’上(即，位于被附接至凹陷28c的较大部分34中的聚合物层32的引物18、18’和20、20’上)。

示出了没有结合至其的盖的示例性流动池10a、10b、10c、10d。尽管未示出，流动池10a、10b、10c、10d可以具有结合至如描述的间隙区域30的至少一部分的盖。在一些实例中，盖可以在流动池10a、10b、10c、10d形成之后被结合。

流动池10a、10b、10c、10d可以用于多种测序方法或技术，包括通常被称为合成测序(sbs)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等的技术。在一个具体的实例中，流动池10a、10b、10c、10d可以暴露于模板流体/混合物，并且可以如本文描述的进行扩增以产生不可裂解的第一模板链40、可裂解的第一模板链46、不可裂解的第二模板链44、可裂解的第二模板链42。可以进行裂解，并且然后可以进行本文公开的同时配对末端测序方法。

用流动池10a、10b、10c、10d所使用的任何技术，由于引物组12a、12a’或12b、12b’或12c、12c’或12d、12d’存在于凹陷28a或28b或凹陷28c的部分34或34’中，而不存在于间隙区域30上，扩增和测序将被限于凹陷28a和28b或28c。

基于嵌段共聚物的流动池

本文公开的流动池的一些实例包括嵌段共聚物，其与包括图案化树脂的多层基底一起使用。参考图21至图25b描述了这些实例。

在这些实例中，图案化树脂(例如，54’)可以使用“自上而下”方法，诸如纳米压印光刻术来制造。自上而下方法可以产生具有高密度、低间距和小纳米特征的凹陷28的阵列。当与嵌段共聚物的定向自组装组合时，这是一种“自下而上”方法，甚至更小的特征(具有亚光刻尺寸结构域)可以在凹陷28内形成。较小的特征可以是合意的，因为可以获得更高的簇密度。更高的簇密度意指可以从给定的单位面积读取更多的碱基，这增加了图案化流动池的遗传收率。此外，非接枝区域(例如，间隙区域30)围绕小特征，这使得更容易接近接枝到嵌段共聚物的引物。因此，引物的利用可以增加。

在这些实例中，嵌段共聚物在图案化树脂的凹陷28中自组装，而不是在凹陷28之间的间隙区域30中自组装。因此，不包括用于从间隙区域30去除材料的另外的处理。

流动池的这些实例包括：支撑物52；支撑物52上的图案化树脂，所述图案化树脂包括由间隙区域30分隔的凹陷28；凹陷28中的图案化树脂上的嵌段共聚物，嵌段共聚物的各个嵌段具有不同于嵌段共聚物的各个其他嵌段的嵌段特异性官能团的嵌段特异性官能团；和引物，所述引物被附接至至少一个嵌段的嵌段特异性官能团。在一些实例中，引物包括被附接至嵌段共聚物的一个嵌段的不可裂解的引物18、18’和21、21’，并且流动池可以用于配对末端测序技术，该配对末端测序技术包括顺序地对被附接至一个嵌段的正向模板链测序，并且然后对反向模板链测序。在其他实例中，本文公开的引物组12a、12a’、或12b、12b’、或12c、12c’、或12d、12d’被分别附接至嵌段共聚物的不同嵌段。在该实例中，一个嵌段包括引物18、18’和20、20’，并且另一个嵌段包括引物19、19’和21、21’。流动池的该实例可以用于本文公开的同时配对末端测序技术。

流动池的部分的实例在图22e和图23中示出，并且将在本文中进一步描述。

用于制造流动池的实例的方法200的实例在图21示出。如图21中示出的，方法100包括：使树脂图案化以形成包括由间隙区域30分隔的凹陷28的图案化树脂(参考标记202)；将包含嵌段共聚物的溶液引入图案化树脂，嵌段共聚物的各个嵌段具有不同于嵌段共聚物的各个其他嵌段的嵌段特异性官能团的嵌段特异性官能团(参考标记204)；将溶液暴露于溶剂蒸气退火，由此嵌段共聚物在凹陷28中相分离并自组装(参考标记206)；和将引物接枝到至少一个嵌段的嵌段特异性官能团(参考标记208)。该方法200将参考图22a至22e来进一步描述。

图22a描绘了支撑物52，并且图22b描绘了支撑物52上沉积的树脂54a。可以使用本文描述的支撑物52的任何实例。用嵌段共聚物，树脂54a能够具有其中限定的凹陷28(图22c)，并且还能够充当用于随后沉积的嵌段共聚物58的指导模板(图22c和图22d之间的“bcp”)。因此，可以使用光刻术、纳米压印光刻术、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等图案化的任何树脂54a可以被使用。此外，树脂54a在被图案化后(即，图案化树脂54a’)应当与待沉积在其上的嵌段共聚物58具有相同范围内的表面能。在一个实例中，树脂54a/图案化树脂54a’和嵌段共聚物58各自具有从约25mn/m至约50mn/m的范围内的表面能。

可以被图案化并且充当指导模板的树脂54a的一些实例选自由以下组成的组：笼状聚倍半硅氧烷树脂(poss)基树脂、环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂及其组合。虽然已经提供了若干实例，但是认为可以使用任何可以被自由基固化的树脂。本文公开的任何树脂54可以用于树脂54a。

如图22a和图22b之间示出的，树脂54a沉积在支撑物52上。在方法200的实例中，树脂54a的沉积包括化学气相沉积、浸涂、浸泡涂布、旋涂、喷涂、水坑分配、超声喷涂、刮刀涂布、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷或喷墨印刷。

然后，使用本文提及的任何图案化技术使沉积的树脂54a图案化。在图22a和图22b中和在图22a和图22b之间示出的实例中，纳米压印光刻术用于使树脂54a图案化。在树脂54a沉积后，可以将其软烘烤以去除过量的溶剂。将纳米压印光刻术模具或工作印模56压靠在树脂54a层上，以在树脂54a上产生压印。换句话说，树脂54a被工作印模56的突出物凹进或穿孔。然后，树脂54a可以在工作印模56就位的情况下固化。固化可以通过暴露于光化辐射，诸如可见光辐射或紫外(uv)辐射，或者当使用光致抗蚀剂时暴露于从约240nm至380nm的范围内的波长的辐射；或者当使用可热固化的抗蚀剂时通过暴露于热来完成。固化可以促进聚合和/或交联。作为实例，固化可以包括多个阶段，包括软烘烤(例如，去除溶剂)和硬烘烤。软烘烤可以在从约50℃至约150℃的范围内的较低温度进行。硬烘烤的持续时间可以在从约100℃至约300℃的范围内的温度持续从约5秒至约10分钟。可以用于软烘烤和/或硬烘烤的装置的实例包括热板、烘箱等。

在固化后，释放工作印模56。这在树脂54a中产生地形特征，即凹陷16。如图22c中示出的，具有其中限定的凹陷28的树脂54a被称为图案化树脂54a’。图案化树脂54a’可以经历进一步的硬烘烤以完成固化并锁定在压印的地形中。在一些实例中，硬烘烤可以在从约60℃至约300℃的范围内的温度进行。

如图22c中示出的，图案化树脂54a’包括其中限定的凹陷28和分隔相邻的凹陷28的间隙区域30。在本文公开的实例中，凹陷28变得用嵌段共聚物(bcp)58和引物18、21官能化(图22f)，而间隙区域30的部分可以用于键合，但不具有嵌段共聚物58或引物18、21。

如图22c中示出的，图案化树脂54a’然后可以暴露于在凹陷28中形成相分离的嵌段共聚物58(包括嵌段58a和58b)的工艺中。如图22c和图22d之间示出的，嵌段共聚物58的溶液沉积在图案化树脂54a’上，其中嵌段共聚物58的各个嵌段58a、58b具有不同于嵌段共聚物58的各个其他嵌段58b、58a的嵌段特异性官能团的嵌段特异性官能团。现在将描述嵌段共聚物58的各种实例。

嵌段共聚物58是由至少两种不同的单体构成的杂聚物。在一个实例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58a，所述第一嵌段58a包括具有引物接枝官能团作为其嵌段特异性官能团的单体；和第二嵌段58b，所述第二嵌段58b包括调节相互作用参数以驱动第一嵌段和第二嵌段的相分离的单体。在该实例中，第二嵌段58b的单体还可以包括嵌段特异性官能团，其可以与图案化树脂54’反应(并且因此附接至图案化树脂54’)。可以与图案化树脂54’反应(并且因此附接至图案化树脂54’)的嵌段特异性官能团在本文中被称为树脂附接官能团。应当理解，第一和第二名称并不表示嵌段共聚物中的任何特定顺序，并且任何嵌段可以包括引物接枝官能团或调节相互作用参数的官能团。例如，第一嵌段58a可以包括具有嵌段特异性官能团的单体，该嵌段特异性官能团能够接枝引物(例如，18、21)，并且能够调节相互作用参数以驱动第一嵌段和第二嵌段的相分离，并且第二嵌段58b可以包括具有树脂附接官能团的单体。对于另一个实例，第一嵌段58a可以包括具有嵌段特异性官能团的单体，该嵌段特异性官能团能够接枝引物(例如，18、21)并且附接至树脂54’，并且第二嵌段58b可以包括能够调节相互作用参数以驱动第一嵌段和第二嵌段的相分离的单体。

在本文公开的嵌段共聚物58的任何实例中，引物接枝官能团选自由以下组成的组：叠氮化物/叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、醛、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫醇及其组合。当多个引物接枝官能团被包含在单个嵌段中时，不同的引物可以被附接至单个嵌段。当不同的引物接枝官能团被包含在不同的嵌段中时，不同的引物可以被附接至不同的嵌段。

引物接枝官能团可以能够与被附接至引物的5’末端的官能团反应。例如，双环[6.1.0]壬-4-炔(bcn)封端的引物可以经由应变促进的无催化剂点击化学被嵌段共聚物58的叠氮化物引物接枝官能团捕获。对于另一个实例，炔烃封端的引物可以经由铜催化的点击化学被嵌段共聚物58的叠氮化物引物接枝官能团捕获。对于仍另一个实例，降冰片烯封端的引物可以与嵌段共聚物58的四嗪引物接枝官能团一起经历无催化剂环应变促进的点击反应。

在一个实例中，引物接枝官能团是被附接至丙烯酰胺单体的叠氮基基团。该单体的实例是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺。在另一个实例中，引物接枝官能团是被附接至含苯单体的叠氮基基团。该单体的两个实例包括苄基叠氮化物或叠氮化物官能化的苯乙烯(例如，)。

在本文公开的嵌段共聚物58的任何实例中，树脂附接官能团选自由以下组成的组：氨基基团、醇基团、芳基基团和带电基团。合适的阴离子带电基团包括硫酸盐或羧酸。合适的阳离子带电基团包括铵、胍或咪唑鎓。在其他实例中，树脂附接官能团可以是三氟甲基基团(-cf3)。在本文公开的嵌段共聚物58的仍另一个实例中，包括树脂附接官能团的单体可以是硅氧烷单体，诸如sio(ch3)2。

在一个实例中，树脂附接官能团是被附接至丙烯酰胺单体的氨基基团。该单体的实例是在该实例中，乙基桥(氮之间)可以用丙基桥或不干扰单体的期望功能的任何其他桥长来替代。在一个实例中，桥长度可以多达16个碳原子。在另一个实例中，树脂附接官能团是苯乙烯单体的芳基基团。其他树脂附接基团(用于共价附接)取决于树脂54是如何官能化的。例如，如果树脂包含环氧基基团，胺或醇可以是合适的树脂附接官能团。

嵌段共聚物58的一些实例包括引物接枝官能团和树脂附接官能团。这些基团可以分别和部分地取决于待接枝的引物(例如，18、21或18、20或18’、20’或19、21或19’、21’)并且取决于待附接至嵌段共聚物58的图案化树脂54’。以下是嵌段共聚物58的一些实例，其包括引物接枝官能团和树脂附接官能团。

在图案化树脂54’是环氧poss的实例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58a，所述第一嵌段58a包括具有氨基基团作为其嵌段特异性官能团的丙烯酰胺单体；和第二嵌段58b，所述第二嵌段58b包括具有叠氮基基团作为其嵌段特异性官能团的叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体。在该实例中，第一嵌段58a包括树脂附接官能团，并且第二嵌段58b包括引物接枝官能团，尽管第二嵌段58b也可以作为树脂附接官能团起作用。该嵌段共聚物58的具体实例是：

其中r是氢或聚合物引发物质端基，n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。聚合物引发物质端基的实例包括可逆加成-片段化链转移(raft)端基、原子转移自由基聚合(atrp)端基、氮氧化物介导的自由基聚合(nmp)端基、四甲基乙二胺(temed)端基或自由基聚合(frp)端基。在另一个实例中，n和m独立地在从约1至约1,000的范围内。

在图案化树脂54’是环氧poss的另一个实例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58a，所述第一嵌段58a包括具有芳基基团作为其嵌段特异性官能团的苯乙烯单体；和第二嵌段58b，所述第二嵌段58b包括具有叠氮基基团作为其嵌段特异性官能团的叠氮化物官能化的苯乙烯。在该实例中，第一嵌段58a包括树脂附接官能团，并且第二嵌段58b包括引物接枝官能团，尽管第二嵌段58b也可以作为树脂附接官能团起作用。该嵌段共聚物58的具体实例是：

其中n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。在另一个实例中，n和m独立地在从约1至约1,000的范围内。

在图案化树脂54’是环氧poss的仍另一个实例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58a，所述第一嵌段58a包括具有叠氮基作为其嵌段特异性官能团的叠氮化物官能化的苯乙烯；和第二嵌段58b，所述第二嵌段58b包括具有硅氧烷作为其嵌段特异性官能团的硅氧烷单体。在该实例中，第一嵌段58a包括引物接枝官能团，尽管第一嵌段58a也可以作为树脂附接官能团起作用，并且第二嵌段58b包括树脂附接官能团。该嵌段共聚物58的具体实例是：

其中n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。在另一个实例中，n和m独立地在从约1至约1,000的范围内。

在图案化树脂54’是无定形的氟聚合物(诸如)的实例中，嵌段共聚物58包含：第一嵌段58a，所述第一嵌段58a包括具有三氟甲基基团作为其嵌段特异性官能团的单体；和第二嵌段58b，所述第二嵌段58b包括具有引物接枝官能团和树脂附接官能团作为其嵌段特异性官能团的单体。在该嵌段共聚物58的一个实例中，第二嵌段58b包括叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体，并且第一嵌段58a(在该实例中，其可以是表面能改变官能团)可以是氟化的丙烯酸酯或氟化的丙烯酰胺。该嵌段共聚物58的具体实例具有以下结构：

其中n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。在另一个实例中，n和m独立地在从约1至约1,000的范围内。在该嵌段共聚物58(其适合与无定形的氟聚合物一起使用)的另一个实例中，第二嵌段58b包括叠氮化物官能化的苯乙烯，并且第一嵌段58a(在该实例中是表面能改变官能团)可以是丙烯酸三氟乙酯。该嵌段共聚物58的具体实例具有以下结构：

其中n在从1至10,000的范围内，并且m在从1至10,000的范围内。在另一个实例中，n和m独立地在从约1至约1,000的范围内。

还应当理解，本文公开的嵌段共聚物58还可以包括一种或更多种分别不干扰嵌段58a和/或58b的功能(例如，引物接枝、树脂附接、相分离等)的其他单体。可以选择另外的嵌段的另外的单体(以及特别是另外的单体的嵌段特异性官能团)来影响/改变嵌段共聚物58的表面自由能、影响嵌段共聚物58的稳定性、附接至另一种引物和/或附接酶。可以影响/改变表面自由能的单体的实例包括丙烯酸酯单体(例如丙烯酸三氟乙酯或甲基丙烯酸三氟乙酯)或三氟乙基丙烯酰胺的三氟甲基基团。可以附接酶的单体的实例可以包括以下嵌段特异性官能团：硫醇、胺或醇，它们可以与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)官能化的酶反应。应当理解，其他官能团可以用于附接酶或其他生物分子。因此，嵌段共聚物58的一些实例是三元共聚物，这将参考图24b和图24a来进一步详细的讨论。

如上文提及的，在方法200中，嵌段共聚物58的溶液被引入图案化树脂54’(如图22c和图22d之间示出的)。溶液可以是嵌段共聚物58在合适的溶剂诸如甲苯中的稀溶液(例如，从约0.01wt％至约10wt％的范围)。嵌段共聚物58溶液可以使用任何合适的技术，诸如旋涂等来沉积。

为了使嵌段共聚物58在拓扑图案化支撑物(例如图案化树脂54’)上自组装并经历微相分离，包含嵌段共聚物的溶液将与下面的图案化树脂54’具有高huggins相互作用参数。在一个实例中，嵌段共聚物58的溶液具有从约0.04至约0.30的范围内的flory-huggins相互作用参数。在另一个实例中，嵌段共聚物58的溶液具有约0.26的flory-huggins相互作用参数。

然后将图案化树脂54’上的沉积后的(as-deposited)嵌段共聚物58暴露于溶剂退火。溶剂退火中使用的溶剂蒸气、温度和时间可以取决于所使用的嵌段共聚物58，并且具体地取决于嵌段共聚物58自组装到凹陷28中和分别微相分离成嵌段58a和58b的条件。在一个实例中，溶剂蒸气是甲苯，温度是室温(例如，从约14℃至约25℃)，并且时间是约3小时。应当理解，溶剂选择、退火时间和退火温度取决于嵌段共聚物。一些合适的溶剂可以是甲苯、庚烷、高级烷烃及其混合物。时间和温度可以影响凹陷28中的形态，并且因此可以被控制。作为实例，退火时间可以在从1分钟至180分钟的范围内，或者甚至更长，例如从约3小时至约48小时；并且退火温度可以在从18℃至约250℃的范围内。

作为溶剂退火的结果，嵌段共聚物58自组装到凹陷16中(并且因此不存在于间隙区域30上)，并且还相分离成分离的结构域或嵌段58a、58b。在图22d中，分离的嵌段58a、58b具有圆形图案或螺旋形图案，尽管该图案可以取决于所使用的嵌段共聚物58。嵌段共聚物58的图案的其他实例例如在图23a和图23b中示出。图23a是凹陷28和一些周围的间隙区域30的俯视图，其中凹陷28中的嵌段共聚物58相分离成呈现出指纹图案的嵌段58a和58b。图23b是凹陷28和一些周围的间隙区域30的俯视图，其中凹陷28中的嵌段共聚物58相分离成呈现出线性图案的嵌段58a和58b。嵌段58a、58b具有亚光刻尺寸结构域。

在溶剂退火期间，包括树脂附接官能团的嵌段58a或58b可以与图案化树脂54’反应，并且因此可以附接至图案化树脂54’。

虽然未示出，在方法200的一些实例中，包括相分离且自组装的嵌段共聚物58a、58b的凹陷28中的图案化树脂54’暴露于另外的固化过程。固化可以如先前描述的进行。

如图22d和图22e之间示出的，进行接枝过程，以便将引物(18、21或18’、21’用于顺序配对末端测序或18、20或18’、20’和19、21或19’、21’用于同时配对末端测序)接枝到凹陷28中的嵌段58a和/或58b的任何引物接枝官能团。

在一个实例中，接枝可以通过流过沉积(例如，使用临时结合的盖)、浸泡涂布、喷涂、水坑分配来完成，或者通过将引物(18、21或18’、21’用于顺序配对末端测序或18、20或18’、20’和19、21或19’、21’用于同时配对末端测序)附接至嵌段58a和/或58b的引物接枝官能团的另一种合适的方法来完成。在同时配对末端测序的实例中，引物18、20或18’、20’可以接枝到一个嵌段58a，并且引物19、21或19’、21’可以接枝到另一个嵌段58b。这些示例性技术中的每一种可以如本文描述的进行，并且可以利用引物溶液或混合物，其可以包含引物、水、缓冲液和催化剂。

应当理解，引物(不可裂解的引物18、21或18’、21’用于顺序配对末端测序或不可裂解/可裂解的引物对18、20或18’、20’和19、21或19’、21’用于同时配对末端测序)将附接至包含引物接枝官能团的嵌段58a和/或58b。在图22e和图22f中示出的实例中，引物18、21被附接至嵌段58b而不被附接至嵌段58a。在该实例中，嵌段58a可以具有贡献的相互作用参数以驱动第一嵌段58a和第二嵌段58b的相分离，并且还可以通过树脂附接官能团被附接至图案化树脂54’。

现在参考图24，描绘了其中嵌段共聚物58相分离成两个嵌段58a和58b的另一个实例。在该实例中，两个不同的引物组，一个包括引物18、18’和20、20’，并且另一个包括引物19、19’和21、21’，分别被附接至嵌段58a、58b。该实例使得能够在如本文描述的测序期间的同时配对末端读段。在该实例中，嵌段58a、58b各自包括可以分别附接相应的引物组的引物接枝官能团。

如上文提及的，一些嵌段共聚物58是三元共聚物，其中各个嵌段包含不同的嵌段特异性官能团。在一个实例中，嵌段共聚物58是包含第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段的三元共聚物；其中第一嵌段的嵌段特异性官能团被附接至图案化树脂(即，是树脂附接官能团)；第二嵌段的嵌段特异性官能团被附接至引物(即，是引物接枝官能团)；并且第三嵌段的嵌段特异性官能团被附接至i)不同于被附接至第二嵌段的嵌段特异性官能团的引物的另一种引物或者被附接至ii)酶(例如nextera^tm转座子)。相分离的三元共聚物的实例在图25a中示出。在该实例中，分离的三元共聚物包含嵌段58a、58b、58c，其中58a包括引物接枝官能团，58b包括树脂附接官能团和/或影响嵌段共聚物的表面自由能和/或影响嵌段共聚物的稳定性，并且58c包括不同的引物接枝官能团或酶附接官能团。如所描绘的，嵌段58a附接第一引物组12a、12b、12c、12d，包括引物18、18’和20、20’，并且嵌段58c附接第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’，包括引物19、19’和21、21’。在该实例中，嵌段58a充当区域14，并且嵌段58c充当区域16。在另一个实例中，区域14、16可以是彼此直接邻接的嵌段(例如，58a和58b或58b和58c)。

在另一个实例中，嵌段共聚物58是包含第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段的三元共聚物；其中第一嵌段的嵌段特异性官能团被附接至图案化树脂54’(即，是树脂附接官能团)；第二嵌段的嵌段特异性官能团被附接至引物(即，是引物接枝官能团)；并且第三嵌段的嵌段特异性官能团影响嵌段共聚物的表面自由能或影响嵌段共聚物的稳定性。相分离的三元共聚物的实例在图25b中示出。在该实施例中，分离的三元共聚物包括嵌段58a、58b、58c，其中58a包括树脂附接官能团，58b影响嵌段共聚物的表面自由能或影响嵌段共聚物的稳定性，并且58c包括引物接枝官能团。在该实例中，不可裂解的引物18、21被附接，并且因此该实例可能特别适合于顺序配对末端测序。

图38a和图38b一起描绘了涉及嵌段共聚物58’的另一种示例性方法。在该实例中，嵌段共聚物58’是层状嵌段共聚物。层状嵌段共聚物将自组装，使得不同的嵌段58a’和58b’层放在另一嵌段的上部，使得它们平行于下面的材料54b、54c和支撑物52。层状嵌段共聚物的实例包括含有杂环叠氮化物单元的共聚物。材料54b、54c可以是本文描述的树脂54a的不同实例、硅烷或硅烷化树脂，并且可以被选择以指导嵌段共聚物58’的自组装。在受控条件下，嵌段共聚物58’自组装成特定的结构域/嵌段58a’和58b’，这些结构域/嵌段58a’和58b’层放在下面的材料54b、54c上。在图38a和38b中示出的实例中，作为退火的结果，结构域/嵌段58a’和58b’自组装，使得嵌段58b’在一个地区(覆盖材料54b)的表面处暴露，并且使得另一个嵌段58a’在另一个地区(覆盖材料54c)的表面处暴露。嵌段58b’可以包括引物附接官能团，该引物附接官能团可以附接包括引物18、18’和20、20’的第一引物组12a、12b、12c、12d；并且嵌段58a’可以包括不同的引物附接官能团，该不同的引物附接官能团可以附接包括引物19、19’和21、21’的第二引物组12a’、12b’、12c’、12d’。在该实例中，嵌段58b’充当区域14，并且嵌段58a’充当区域16。

包括嵌段共聚物58、58’的流动池可以用于多种测序方法或技术，包括通常被称为合成测序(sbs)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等的技术。在这些实例的一些实例中，由于相分离的嵌段58a、58b、58c和附接的引物(不可裂解的引物18、21或18’、21’用于顺序配对末端测序或不可裂解/可裂解的引物对18、20或18’、20’和19、21或19’、21’用于同时配对末端测序)存在于凹陷28中，而不存在于间隙区域30上，扩增将限于凹陷28。

作为一个实例，合成测序(sbs)反应可以在系统上运行，所述系统诸如hiseq^tm、hiseqx^tm、miseq^tm、miseqdx^tm、miniseq^tm、novaseq^tm、nextseqdx^tm、nextseq^tm、或来自illumina(sandiego,ca)的任何其他测序仪系统。在sbs中，监测测序引物沿着核酸模板(例如，测序模板)的延伸以确定模板中核苷酸的序列。潜在的化学过程可以是聚合(例如，由聚合酶催化)或连接(例如，由连接酶催化)。在特定的基于聚合酶的sbs过程中，荧光标记的核苷酸以模板依赖模式被添加至测序引物(从而延伸引物)，使得检测添加至测序引物的核苷酸的顺序和类型可以用于确定模板的序列。

例如，为了启动第一个sbs循环，一个或更多个标记的核苷酸、dna聚合酶等可以被递送至流动通道/递送通过流动通道等，该流动通道容纳被附接至不可裂解的引物18、21或18’、21’(用于顺序配对末端测序)的正向链或反向链的阵列，或者被附接至不可裂解/可裂解的引物对18、20或18’、20’(用于同时配对末端测序)的正向链和反向链两者的阵列，其中测序引物延伸导致标记的核苷酸被掺入，可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统(未示出)可以向官能化的凹陷提供激发光。

在这些实例中，核苷酸还可以包括在核苷酸已经被添加之后使进一步的引物延伸终止的可逆终止性质，并且解封剂可以用于继续测序。洗涤可以在不同的流体递送步骤之间进行。然后sbs循环可以重复n次以将测序引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。

虽然已经详细描述了sbs，但是应当理解，本文描述的流动池可以与其他测序方案一起用于基因分型，或者用于其他化学应用和/或生物应用。

为了进一步说明本公开内容，本文给出了实施例。应当理解，这些实施例为了说明性的目的被提供，并且不被解释为限制本公开内容的范围。

实施例

实施例1

将具有预接枝的p7和p5u引物的pazam沉积在具有柱状特征的流动池基底上，柱状特征为约400nm高并且直径约350nm。沉积的预接枝的pazam层的一部分的扫描电子显微术(sem)图像在图39a中示出。将剥离的抗蚀剂沉积在该第一次接枝的pazam层上，以形成本文描述的保护层的实例。沉积的保护层的一部分的sem图像在图39b中示出。然后进行蚀刻以从柱状特征的顶部去除保护层和第一次接枝的pazam层。蚀刻后的基底的一部分的sem图像在图39c示出。将pazam沉积在柱状特征的顶部和剩余的保护层上，以形成第二pazam层。将第二pazam层用p5和p7u引物接枝。

使用剥离工艺从第一次接枝的pazam层去除保护层和任何第二次接枝的pazam层。

将来自同一基因组(来自人类基因组)的文库片段引入流动池。文库片段包括与p5或p7引物序列互补的部分，以及索引序列，以及读段1和读段2序列。接种文库片段，并且使用桥扩增进行聚簇。然后进行同时配对末端测序。

在柱状特征和相邻区域之间的边界地区，发现所有读段中约34％是配对的。

这些读段是从单个位置提取的，并且与基因组对齐。图40a图示出了两个r1读段(r1和r1‘)，这两个读段被输入作为同时配对末端读段。

流动池也通过顺序配对末端合成来处理(对正向链测序并去除，然后对反向链测序)。图40b图示出了来自图40a的结果，其中来自顺序配对末端合成的第二读段(r2)被翻转，以示出它确实匹配同时配对末端读段对。r2中的剪切(clipped)部分可能是由于质量下降，而r1读段是更高质量的、未剪切读段。这些结果证明，本文公开的方法可以使用同时产生的对(图40a)产生与标准配对末端测序(图40b)等效的信息。

仍进一步地，对于基于同时配对末端测序和标准(顺序)配对末端测序的数据，文库片段的插入物大小分布大致相等。这些结果进一步证明，本文公开的方法，使用同时产生的对，可以产生与标准配对末端测序等效的信息。

实施例2

将pazam沉积在平面流动池基底上，并且用p7和p5u引物接枝。将保护层(shipley1813光致抗蚀剂)沉积在该第一次接枝的pazam层的顶部。使用紫外光通过光掩模暴露保护层的限定部分，然后在溶剂中显影，留下50μm的保护层的圆形垫。空气等离子体用于蚀刻掉间隙区域中第一次接枝的pazam层的暴露的部分，而保护垫下面的部分保持完整。然后将第二层pazam沉积在间隙区域和剩余的保护层上。然后将第二次沉积的pazam用p5和p7u引物接枝。

使用剥离工艺从第一次接枝的pazam层去除保护层和任何第二次接枝的pazam层。

将来自同一基因组(来自人类基因组)的文库片段引入流动池。文库片段包括与p5或p7引物序列互补的部分，以及索引序列，以及读段1和读段2序列。接种文库片段，并且使用桥扩增进行聚簇。然后进行同时配对末端测序。

在第一次接枝的pazam和第二次接枝的pazam之间的边界地区，发现所有读段的约2.2％是配对的。这意味着两个读段在彼此的2μm内，并且在基因组中在彼此的2kb内。

另外的注释

应当认识到，前述概念的所有组合和下文更详细讨论的额外概念(假设这样的概念不相互不一致)被设想为本文公开的创造性主题的部分。特别是，出现在本公开内容的结尾处的所要求保护的主题的所有组合被设想为本文公开的创造性主题的一部分。还应当认识到，也可以出现在通过引用并入的任何公开内容中的本文中明确使用的术语应当符合与在本文公开的特定概念最一致的含义。

在整个说明书中对“一个实例”、“另一个实例”、“实例”等的提及意指结合该实例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)被包含在本文描述的至少一个实例中，并且可以存在于或可以不存在于其他实例中。此外，应当理解，除非上下文另有明确指示，否则任何实例的所描述的元素可以在各种实例中以任何合适的方式组合。

应当理解，本文提供的范围包括规定范围和在规定范围内的任何值或子范围，如同这样的值或子范围被明确地引用。例如，从约400nm至约1μm(1000nm)的范围应当被解释为不仅包括从约400nm至约1μm的明确列举的限制，而且还包括单个值，诸如约708nm、约945.5nm等和子范围，诸如从约425nm至约825nm、从约550nm至约940nm等。此外，当使用“约”和/或“基本上”来描述一个值时，它们意指涵盖所陈述的值的微小变化(多达+/-10％)。

虽然已经详细描述了若干实例，但是应当理解，可以修改所公开的实例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。

序列表

<110>伊鲁米那股份有限公司

伊鲁米纳剑桥有限公司

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