一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒及方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒及方法。

背景技术：

原发性高血压病是最常见的慢性疾病之一，是导致冠心病、脑卒中等心血管疾病的重要危险因子，大量的研究证明，原发性高血压病主要受遗传因素和环境因素的共同影响。目前临床常用的降压药物包括利尿剂、β肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂和α肾上腺素受体阻滞剂，然而，在临床治疗高血压的药物在个体反应差异十分普遍，主要原因是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异。

CYP2D6在肝脏总CYP中仅占1-2％，但经其催化代谢的药物多达80多种，不同个体CYP2D6的活性最大可相差1000倍。在中国人群中最常见的多态性为CYP2D6*10，约51.6％的中国人携带此遗传变异。该多态性导致CYP2D6的酶活性降低，且极其不稳定，从而影响药物代谢。

β肾上腺素受体属于G蛋白偶联受体超家族，由ADRB1基因编码，该基因存在多态性。研究表明ADRB1基因G1165C多态性与高血压药物治疗相关，使用美托洛尔、卡维地洛等治疗后，C1165纯合子个体有效率更高。

血管紧张素转换酶是肾素-血管紧张素系统的关键酶，由ACE基因编码，该基因定位于17号染色体长臂2区3带，序列长21kb。ACE基因存在多种遗传多态性，其中第16内含子中存在的287bp的Alu插入片段(I)和缺失片段(D)的多态性与高血压药物治疗相关，研究表明DD纯合型个体使用贝那普利和福辛普利的疗效显著，II纯合型个体使用依那普利和咪达普利的疗效显著，ID杂合型个体使用血管紧张素抑制剂类药物治疗，均有效。

新型利尿剂吲达帕胺(寿比山，indapmide)的上市，使利尿剂在高血压病的治疗地位又有新的提高，它的特点是常用剂量仅表现为轻微的利尿作用，主要表现为血管扩张作用，降压有效率在80％左右，且不存在传统利尿剂的代谢异常副作用，已在临床广泛应用。心房钠尿肽前体A (natriure ticpeptide precursor A，NPPA)是研究多种疾病遗传易感性的“候选基因”，位于人染色体1p36，编码ANP的前体。ANP作为一种利尿剂控制细胞外液量和电解质的平衡，而提高ANP水平可引起低血压。研究表明ANP(以及NPPA基因)与多种心脑血管疾病相关，如脑卒中、心力衰竭、左心房肥厚及高血压等。NPPA G664A是位于基因1号外显子上的单核苷酸突变(G/A)，使ANP前体蛋白第7位氨基酸变为甲硫氨酸，导致ANP活性降低。

细胞色素氧化酶P450(CYP2C9)是人类肝脏中一类重要的药物代谢酶，约占人类肝中CYP酶总量的20％。CYP2C9等位基因的分布具有明显的人群、种族和地域差异，中国人群中，主要突变型基因为CYP2C9*3，是在第7个外显子第1075位发生A>C突变，造成CYP2C9多肽链上的第359位异亮氨酸突变成亮氨酸(Ile359>Leu359)，其等位基因频率为1.0-3.5％。洛沙坦、厄贝沙坦等沙坦类是常用的降血压药物，是一类有效的血管紧张素受体拮抗药，它主要由CYP2C9代谢，研究显示，沙坦类药物在体内主要由CYP2C9代谢，多态性CYP2C9*3的突变致使酶活性显著下降，毒性增加，疗效降低。临床研究表明，CYP2C9*3突变可导致洛沙坦降压效果减弱；CYP2C9*3突变可增加缬沙坦和厄贝沙坦的血药浓度，导致缬沙坦和厄贝沙坦降压效果增强。因此，当高血压患者选择沙坦类药物时，应该先对CYP2C9进行基因检测，根据CYP2C9*3的基因型选择沙坦类药物。

血管紧张素II受体拮抗剂(Angiotensin II receptor antagonists)是一类作用于肾素-血管紧张素系统的药物，主要应用于治疗高血压、糖尿病肾病和充血性心力衰竭。I型血管紧张素II受体(Angiotensin II receptor type 1，AGTR1)是血管紧张素II(angiotensin，Ang II)的受体，主要分布于血管平滑肌细胞上，介导Ang II绝大多数生物学作用。它是肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system，RAS)的组成部分，对高血压的发生及药物治疗具有重要意义。人类AGTR1基因位于3q21-25，仅含1个外显子，无内含子区域。研究发现，AGTR1基因多态性中，T573C，A1166C及A1062G替换的频率最高，A1166C基因型的患者在使用洛沙坦和坎地沙坦时呈现更显著的血压反应。高血压患者对血管紧张素II受体阻断药(如氯沙坦、依贝沙坦、替米沙坦等)的药物敏感性如下：A1166A患者药物敏感性正常，建议使用常规剂量；A1166C患者药物敏感性升高，建议降低剂量；C1166C患者药物敏感性升高，建议降低剂量。

钙离子拮抗剂是通过阻滞钙通道来降低血压的化学制剂。它可以选择性抑制Ca²⁺经细胞膜上的钙通道进入细胞内，其通过扩张血管和负性肌力，松弛血管平滑肌，减少末梢血管阻力，从而起到降压作用。细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是一大类药物代谢酶，参与许多药物、生物异源性物质和内源性物质的代谢。CYP3A5主要在成人的肝脏和小肠表达，其表达具有明显的多态性。CYP3A5的基因突变是产生酶活性差异的最主要原因，其中CYP3A5*3在intron3(6959A>G)的突变引起可变剪切，产生了不稳定的蛋白质，从而使得突变性纯合子个体，即其携带基因CYP3A5*3/*3的人不表达CYP3A5。研究显示，钙拮抗剂类药物受CYP3A5*3基因多态性影响较大，含有突变基因型患者，药物毒副作用增加。

基因多态性检测方法很多，最常见的包括测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、ARMS、Taqman PCR、ME-PCR、基因芯片等。这些方法不仅操作复杂，检测周期长，而且影响检测结果因素很多，不易控制，难以满足临床试剂检测的要求，目前只在科研领域进行。

技术实现要素：

本发明的目的是在于针对现有技术的不足，提供一种快速、精准系统地检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒及方法。

为解决上述的问题，本发明采用以下技术方案：

一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒，试剂盒包括反应液I，反应液II，反应液III，阳性对照品，阴性对照品。所述的反应液I包括PCR缓冲体系及酶，反应液II包括ACE、CYP2D6、ADRB1基因检测引物及相应荧光探针，反应液III包括NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9基因检测引物及相应荧光探针，阳性对照品为ACE、CYP2D6、ADRB1、NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9七个基因的杂合型质粒，阴性对照品为不含目标靶基因的Tris盐。

所述的反应液I包含10*taq buffer I，5*taq buffer II，Hotstart Taq酶，UDG酶，dNTP，dUTP，增强剂；所述的10*taq buffer I包含200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，15mM MgCl2；所述的5*taq buffer II包含20mM Mg SO4，所述的增强剂为包含0.5M甜菜碱、1％(V/V)甲酰胺、3％(V/V)甘油和0.2mg/mlBSA的混合物。

反应液II包含ACE、CYP2D6、ADRB1检测引物及相应探针如下：

ACE F1：TTTCTCTAGACCTGCTGCCTATAC

ACE R1：AGCTCAGAGAATTTCAGAGCTG

ACE P：CTGCTGCCTATACAGTCACTTTTATGTGG，5端标记ROX，3端标记BHQ2。

D6 F1：CCTCCCTCACCTGGTCGAAGC

D6 R1：TTCCTGCTCCTGGTGGACCTG

D6 P：CTGCACGCTACTCACCAGGCCC，5端标记FAM，3端标记BHQ1。

B1 F1：GCCTTCAACCCCATCATCT

B1 R1：GTCGTCGTCGTCGTCCGA

B1 P：TTCCAGCGACTGCTCTGCT，5端标记HEX，3端标记BHQ1。

反应液II包含以下检测引物比例为：ACE F1：ACE R1＝2pmol：20pmol；D6 F1：D6 R1＝30pmol：3pmol；B1 F1：B1 R1＝2pmol：20pmol；上述三条检测探针的添加量均为5pmol。

反应液III包含NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9检测引物及相应探针如下：

R1 F1：TGAGTGACATGTTCGAAACC

R1 R1：CAGCCGTCATCTGTCTAATGC

R1 P：CAAATGAGCATTAGCTACTTTTCAGA，5端标记ROX，3端标记BHQ2。

PA F1：GACACAAATGCAGCAGAGAC

PA R1：AGGATGGGCACACTCATAC

PA P：CTGTTATCTTCAGTACTGCAAAGAGAAC，5端标记FAM，3端标记BHQ1。

A5 F1：GAGAGTGGCATAGGAGATAC

A5 R1：CACAGCAAGAGTCTCACACAG

A5 P：TGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTTTG，5端标记CY5，3端标记BHQ3。

C9 F1：ATCAGCTAAAGTCCAGGAA

C9 R1：GAAACAAACTTACCTTGGGAAT

C9 P：CGAGGTCCAGAGATACATTGACC，5端标记HEX，3端标记BHQ1。

反应液III包含以下检测引物比例为：R1 F1：R1 R1＝4pmol：40pmol；PA F1：PA R1＝3pmol：30pmol；A5 F1：A5 R1＝2pmol：20pmol；C9 F1：C9 R1＝40pmol：4pmol，上述四条检测探针的添加量均为5pmol。

一种高血压精准用药相关基因的多态性检测方法，其检测步骤如下：

1)按照19ul反应液I：2ul反应液II配制扩增检测试剂I；按照19ul反应液I：2ul反应液III配制扩增检测试剂II。

2)吸取待检样本DNA各4ul，分别加入到扩增检测试剂I和扩增检测试剂II中，分别混匀。

3)将加有DNA的扩增检测试剂I与扩增检测试剂II反应管置于实时荧光PCR仪中进行PCR扩增检测。

4)实时荧光PCR扩增程序设置如下：

一种高血压精准用药相关基因的多态性检测方法，其7种基因型的结果判读：

与现有技术相比，本发明有如下特点：

1)本发明提供有一种检测五大类高血压药物相关基因多态性检测的试剂盒及方法，能有效指导主流抗高血压药物的临床应用。较市面上的现有产品，覆盖更全。

2)本发明采用单条探针结合熔解曲线法进行基因多态性检测，同时采用两管多重PCR反应对高血压药物相关7个基因多态性检测，具有快速、灵敏度高、特异性强、方法简单、检测结果准确等优势。

3)试剂盒可对10pg基因组DNA进行多态性检测。

附图说明

图1为CYP2D6*10位点多态性检测结果。

图2为ADRB1(1165G>C)位点多态性检测结果。

图3为ACE(I/D)位点多态性检测结果。

图4为NPPA(664G>A)位点多态性检测结果。

图5为CYP2C9*3位点多态性检测结果。

图6为AGTR1(1166A>C)位点多态性检测结果。

图7为CYP3A5*3位点多态性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

实施案例1：高血压个体化用药相关基因多态性检测试剂盒引物及探针的设计

根据ACE(rs4646994)、CYP2D6(rs1065852)、ADRB1(rs1801253)、NPPA(rs5065)、AGTR1(rs5186)、CYP3A5(rs776746)、CYP2C9(rs56165452)七个基因相关检测位点设计检测探针及引物，相关序列如下：

ACE F1：TTTCTCTAGACCTGCTGCCTATAC

ACE R1：AGCTCAGAGAATTTCAGAGCTG

ACE P：CTGCTGCCTATACAGTCACTTTTATGTGG，5端标记ROX，3端标记BHQ2。

D6 F1：CCTCCCTCACCTGGTCGAAGC

D6 R1：TTCCTGCTCCTGGTGGACCTG

D6 P：CTGCACGCTACTCACCAGGCCC，5端标记FAM，3端标记BHQ1。

B1 F1：GCCTTCAACCCCATCATCT

B1 R1：GTCGTCGTCGTCGTCCGA

B1 P：TTCCAGCGACTGCTCTGCT，5端标记HEX，3端标记BHQ1。

R1 F1：TGAGTGACATGTTCGAAACC

R1 R1：CAGCCGTCATCTGTCTAATGC

R1 P：CAAATGAGCATTAGCTACTTTTCAGA，5端标记ROX，3端标记BHQ2。

PA F1：GACACAAATGCAGCAGAGAC

PA R1：AGGATGGGCACACTCATAC

PA P：CTGTTATCTTCAGTACTGCAAAGAGAAC，5端标记FAM，3端标记BHQ1。

A5 F1：GAGAGTGGCATAGGAGATAC

A5 R1：CACAGCAAGAGTCTCACACAG

A5 P：TGTCTTTCAATATCTCTTCCCTGTTTG，5端标记CY5，3端标记BHQ3。

C9 F1：ATCAGCTAAAGTCCAGGAA

C9 R1：GAAACAAACTTACCTTGGGAAT

C9 P：CGAGGTCCAGAGATACATTGACC，5端标记HEX，3端标记BHQ1。实施案例2：高血压个体化用药相关基因多态性检测试剂盒制备

反应液I为包含10*taq buffer I，5*taq buffer II，Hotstart Taq酶，UDG酶，dNTP，dUTP，增强剂的混合物，为实时荧光PCR提供一个高效扩增的缓冲体系。其中，所述的10*taq buffer I包含200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，100mM(NH4)2SO4，15mM MgCl2；所述的5*taq buffer II包含20mM Mg SO4，所述的增强剂为包含0.5M甜菜碱、1％(V/V)甲酰胺、3％(V/V)甘油和0.2mg/mlBSA的混合物。

反应液II含ACE、CYP2D6、ADRB1基因检测引物及相应荧光探针，其中CE F1：ACE R1＝2pmol：20pmol；D6 F1：D6 R1＝30pmol：3pmol；B1 F1：B1 R1＝2pmol：20pmol；三条检测探针的添加量均为5pmol。

反应液III含NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9基因检测引物及相关荧光探针，其中R1 F1：R1 R1＝4pmol：40pmol；PA F1：PA R1＝3pmol：30pmol；A5 F1：A5 R1＝2pmol：20pmol；C9 F1：C9 R1＝40pmol：4pmol，四条检测探针的添加量均为5pmol。

阳性对照品为ACE、CYP2D6、ADRB1、NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9七个基因的杂合型质粒。

阴性对照品为不含目标靶基因的Tris盐。

实施案例3：高血压个体化用药相关基因多态性检测试剂盒使用方法

1)提取待测样本中的基因组DNA。

2)按照19ul反应液I：2ul反应液II配制扩增检测试剂I；按照19ul反应液I：2ul反应液III配制扩增检测试剂II。

3)吸取待检样本DNA、阳性对照品及阴性对照品各4ul，分别加入到扩增检测试剂I和扩增检测试剂II中，混匀。

4)将加有DNA的扩增检测试剂I与扩增检测试剂II反应管置于实时荧光PCR仪中进行PCR扩增检测。

其中扩增程序如下：

结果判读标准：

收集100例临床血液样本，利用商品化的血液提取试剂盒提取基因组DNA，然后采用本发明的试剂盒进行相关基因多态性检测，同时采用sanger测序法进行对比，全部一致。

序列表

<110> 杭州千基生物科技有限公司

杭州博芯生物技术有限公司

<120> 一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒及方法

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