一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法与流程
本发明属林木繁殖技术领域，涉及组织培养胚性愈伤悬浮培养技术，尤其是一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法。
背景技术：
马尾松（pinusmassonianalamb.）是我国南方生态建设和造林用材的主要树种。作为一种综合利用价值高、推广前景广阔的树种，马尾松不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。马尾松育种周期长，加之近年来随着种子园母树老化，结实量下降，良种匮乏，导致南方马尾松人工林遗传分化差异大、林分质量不高、生产力低下。为推动马尾松产业高效发展，实现优良品系无性育苗的良种产业化尤为关键。植物组培技术的使用，是实现良种育苗产业化的有效途径。在组培技术中相对于器官发生而言，体细胞胚胎发生作为植物细胞全能性的一种表达方式，是植物细胞工程中植株再生的重要手段，其具有增殖系数高，结构完整、遗传稳定及不受自然条件限制等诸多优势，在大规模无性繁殖、人工种子制备、种质保存及遗传转化等诸多领域均具有重大应用价值，是当前国际上进行林木无性快繁的主要手段。目前，马尾松体细胞胚胎发生已有相关研究，但在继代培养中受胚性愈伤组织活力的影响，增殖系数变化较大，后期再分化能力差异较大，繁育效果不稳定。此外，胚性愈伤组织作为一种优良的细胞工程与生物工程育种的繁殖材料，具有明显的优越性，但进行胚性细胞悬浮系的构建是进行细胞融合与分子遗传改良等方面研究的基础与保障。目前在马尾松胚性细胞悬浮系建立的方法研究中，多处于一种试验性摸索阶段，研究成效不显著，尚未达到实际生产性应用的水平。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供了一种能获取大量悬浮培养的胚性细胞的马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法，实现了马尾松胚性愈伤悬浮细胞系的建立。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种马尾松胚性细胞增殖的悬浮培养方法，包括材料选择、初始接种和悬浮培养工序，将在培养基ⅰ中培养获得的生长快、活力旺盛的胚性愈伤作为培养材料，然后将在培养基ⅱ中通过二次振荡培养获取的胚性培养物置于培养基ⅲ中进行悬浮培养，最后获得马尾松悬浮胚性细胞；主要操作步骤如下：
（1）材料选择：
将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基ⅰ中培养7～10d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料；
（2）初始接种：
将2～3g培养材料转入150ml广口瓶中，往瓶中加入25ml培养基ⅱ，振荡培养10～14d，然后再往瓶中加入20ml培养基ⅱ，继续振荡培养7～10d，获得胚性培养物；
（3）悬浮培养：
将广口瓶中胚性培养物全部转入100ml量筒进行沉积，去掉上清液，取5ml沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40ml培养基ⅲ进行振荡培养7～14d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积，弃上清液后取3～10ml沉积胚性细胞和35～42ml培养基ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期7～10d，获得马尾松悬浮胚性细胞。
以上步骤（1）所述的培养基ⅰ为：改良dcr培养基+2,4-d0.6mg·l-1+naa1.0mg·l-1+meta-topolin（mt）0.5mg·l-1+肌醇200mg·l-1+谷氨酰胺500mg·l-1+酸水解酪蛋白500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+乳糖5000mg·l-1+木糖10000mg·l-1+植物凝胶2000mg·l-1+250mg·l-1mes。
以上步骤（2）所述的培养基ⅱ为：改良dcr培养基+2,4-d0.3mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.3mg·l-1+肌醇100mg·l-1+谷氨酰胺1000mg·l-1+天冬酰胺500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+麦芽糖20000mg·l-1+活性碳250mg·l-1+250mg·l-1mes。
以上步骤（3）所述的培养基ⅲ为：改良dcr培养基+naa1.0-2.0mg·l-1+mt0.4-0.8mg·l-1+aba0.2-0.4mg·l-1+ga30.2-0.4mg·l-1+肌醇900mg·l-1+谷氨酰胺350mg·l-1+天冬酰胺1200mg·l-1+五氮杂胞苷1.0-2.0mg·l-1+麦芽糖30000mg·l-1+250mg·l-1mes。
以上步骤（2）和步骤（3）所述的振荡培养条件均为：暗培养，温度21±0.5℃，转速80～90r/mim。
以上步骤（3）所述的沉积的时间为40～60min。
以上所述的改良dcr培养基的组成为：kno3480mg·l-1；nh4no3120mg·l-1；kh2po4220mg·l-1；cacl2110mg·l-1；mgso4·7h2o180mg·l-1；mgcl2·6h2o65mg·l-1；feso4·7h2o15mg·l-1；na2edta20mg·l-1；mnso4·h2o20.0mg·l-1；znso4·7h2o43.0mg·l-1；cuso4·5h2o0.13mg·l-1；h3bo315.5mg·l-1；na2moo4·2h2o0.02mg·l-1；ki4.15mg·l-1；cocl2·6h2o0.03mg·l-1；维生素b10.5mg·l-1；维生素b61.0mg·l-1；烟酸1.0mg·l-1；甘氨酸2.0mg·l-1。
对比于现有技术，本发明具有的优点和积极效果如下：
1、本发明选择了生长快、活力旺盛的胚性愈伤作为培养材料，通过初始接种，并通过不断的继代增殖悬浮培养，详细、系统地对悬浮增殖培养中的材料性状、初始接种量、接种密度、培养周期及培养条件等进行了明确的规定，实现了马尾松胚性愈伤悬浮细胞系的建立，并获取了大量的悬浮培养的胚性细胞，为今后开展相关马尾松细胞与基因工程方面的研究提供了可靠的资源与技术保障。
2、本发明在材料筛选阶段以固体培养的方式，培养基中辅以植物凝胶为凝结剂，形成大量生长活性旺盛的胚性愈伤组织；在初始接种阶段进行不同量、不同时间的二次振荡培养，提高了胚性愈伤的增殖能力。
3、本发明针对胚性愈伤悬浮增殖培养中不同培养阶段规定了不同培养基的组成，根据培养目的不同添加不同活性成分，如在材料选择和初始接种阶段采用的硫代硫酸钠能有效抑制细胞褐化，在初始接种阶段中采用的天冬酰胺能增强细胞活性并促进细胞增长速率，在悬浮培养阶段采用的五氮杂胞苷通过调控dna甲基化水平维持胚性愈伤活力与再分化能力。
4、本发明对dcr培养基进行了改良，降低了大量元素中铵态氮、钙、镁含量，增加钾含量和硝态氮/铵态氮比值，同时还重点调整了在悬浮培养条件下，与马尾松胚性细胞增殖生长密切相关的硼、锰、锌、钼、碘等微量元素含量，使得培养基更科学，更适合马尾松胚性愈伤增殖悬浮培养，成效显著。
5、本发明使用优化的培养材料、初始接种与继代转接悬浮培养方式，胚性愈伤在悬浮培养中胚性细胞活力旺盛、生长快，繁殖效率高，增殖倍数可达15.7，且分散性能好，利于大规模生产操作，具有较好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为经本发明的材料选择获得的培养材料，即生长旺盛活性强的马尾松胚性愈伤组织。
图2为经本发明的初始接种获得的马尾松胚性培养物。
图3为经本发明悬浮培养获得的马尾松悬浮胚性细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
在温度20±0.5℃条件下，将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基ⅰ中培养7d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料。所述的培养基ⅰ为：改良dcr培养基+2,4-d0.6mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.5mg·l-1+肌醇200mg·l-1+谷氨酰胺500mg·l-1+酸水解酪蛋白500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+乳糖5000mg·l-1+木糖10000mg·l-1+植物凝胶2000mg·l-1+250mg·l-1mes。
将2g培养材料转入150ml广口瓶中，往瓶中加入25ml培养基ⅱ，振荡培养14d，然后再往瓶中加入20ml培养基ⅱ，继续振荡培养10d，获得胚性培养物。所述的培养基ⅱ为：改良dcr培养基+2,4-d0.3mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.3mg·l-1+肌醇100mg·l-1+谷氨酰胺1000mg·l-1+天冬酰胺500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+麦芽糖20000mg·l-1+活性碳250mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速90r/mim。
将广口瓶中胚性培养物全部转入100ml量筒进行沉积40min，去掉上清液，取5ml沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40ml培养基ⅲ进行振荡培养14d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积40min，弃上清液后，取10ml沉积胚性细胞和35ml培养基ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期10d。所述的培养基ⅲ为：改良dcr培养基+naa1.0mg·l-1+mt0.4mg·l-1+aba0.2mg·l-1+ga30.2mg·l-1+肌醇900mg·l-1+谷氨酰胺350mg·l-1+天冬酰胺1200mg·l-1+五氮杂胞苷2.0mg·l-1+麦芽糖30000mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速90r/mim。
继代培养10次，胚性愈伤生长快、活力旺盛，增殖倍数为13.2。
以上所述的改良dcr培养基的组成为：kno3480mg·l-1；nh4no3120mg·l-1；kh2po4220mg·l-1；cacl2110mg·l-1；mgso4·7h2o180mg·l-1；mgcl2·6h2o65mg·l-1；feso4·7h2o15mg·l-1；na2edta20mg·l-1；mnso4·h2o20.0mg·l-1；znso4·7h2o43.0mg·l-1；cuso4·5h2o0.13mg·l-1；h3bo315.5mg·l-1；na2moo4·2h2o0.02mg·l-1；ki4.15mg·l-1；cocl2·6h2o0.03mg·l-1；维生素b10.5mg·l-1；维生素b61.0mg·l-1；烟酸1.0mg·l-1；甘氨酸2.0mg·l-1。
实施例2：
在温度20±0.5℃条件下，将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基ⅰ中培养10d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料。所述的培养基ⅰ为：改良dcr培养基+2,4-d0.6mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.5mg·l-1+肌醇200mg·l-1+谷氨酰胺500mg·l-1+酸水解酪蛋白500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+乳糖5000mg·l-1+木糖10000mg·l-1+植物凝胶2000mg·l-1+250mg·l-1mes。
将3g培养材料转入150ml广口瓶中，往瓶中加入25ml培养基ⅱ，振荡培养10d，然后再往瓶中加入20ml培养基ⅱ，继续振荡培养7d，获得胚性培养物。所述的培养基ⅱ为：改良dcr培养基+2,4-d0.3mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.3mg·l-1+肌醇100mg·l-1+谷氨酰胺1000mg·l-1+天冬酰胺500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+麦芽糖20000mg·l-1+活性碳250mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速80r/mim。
将广口瓶中胚性培养物全部转入100ml量筒进行沉积60min，去掉上清液，取5ml沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40ml培养基ⅲ进行振荡培养7d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积60min，弃上清液后，取10ml沉积胚性细胞和35ml培养基ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期7d。所述的培养基ⅲ为：改良dcr培养基+naa2.0mg·l-1+mt0.8mg·l-1+aba0.4mg·l-1+ga30.4mg·l-1+肌醇900mg·l-1+谷氨酰胺350mg·l-1+天冬酰胺1200mg·l-1+五氮杂胞苷1.0mg·l-1+麦芽糖30000mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速80r/mim。
继代培养10次，胚性愈伤生长快、活力旺盛，增殖倍数为13.7。
以上所述的改良dcr培养基的组成为：kno3480mg·l-1；nh4no3120mg·l-1；kh2po4220mg·l-1；cacl2110mg·l-1；mgso4·7h2o180mg·l-1；mgcl2·6h2o65mg·l-1；feso4·7h2o15mg·l-1；na2edta20mg·l-1；mnso4·h2o20.0mg·l-1；znso4·7h2o43.0mg·l-1；cuso4·5h2o0.13mg·l-1；h3bo315.5mg·l-1；na2moo4·2h2o0.02mg·l-1；ki4.15mg·l-1；cocl2·6h2o0.03mg·l-1；维生素b10.5mg·l-1；维生素b61.0mg·l-1；烟酸1.0mg·l-1；甘氨酸2.0mg·l-1。
实施例3：
在温度20±0.5℃条件下，将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基ⅰ中培养7d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料。所述的培养基ⅰ为：改良dcr培养基+2,4-d0.6mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.5mg·l-1+肌醇200mg·l-1+谷氨酰胺500mg·l-1+酸水解酪蛋白500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+乳糖5000mg·l-1+木糖10000mg·l-1+植物凝胶2000mg·l-1+250mg·l-1mes。
将3g培养材料转入150ml广口瓶中，往瓶中加入25ml培养基ⅱ，振荡培养10d，然后再往瓶中加入20ml培养基ⅱ，继续振荡培养7d，获得胚性培养物。所述的培养基ⅱ为：改良dcr培养基+2,4-d0.3mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.3mg·l-1+肌醇100mg·l-1+谷氨酰胺1000mg·l-1+天冬酰胺500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+麦芽糖20000mg·l-1+活性碳250mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速85r/mim。
将广口瓶中胚性培养物全部转入100ml量筒进行沉积50min，去掉上清液，取5ml沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40ml培养基ⅲ进行振荡培养10d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积50min，弃上清液后，取10ml沉积胚性细胞和35ml培养基ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期7d。所述的培养基ⅲ为：改良dcr培养基+naa2.0mg·l-1+mt0.4mg·l-1+aba0.2mg·l-1+ga30.4mg·l-1+肌醇900mg·l-1+谷氨酰胺350mg·l-1+天冬酰胺1200mg·l-1+五氮杂胞苷2.0mg·l-1+麦芽糖30000mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速85r/mim。
继代培养10次，胚性愈伤生长快、活力旺盛，增殖倍数为14.5。
以上所述的改良dcr培养基的组成为：kno3480mg·l-1；nh4no3120mg·l-1；kh2po4220mg·l-1；cacl2110mg·l-1；mgso4·7h2o180mg·l-1；mgcl2·6h2o65mg·l-1；feso4·7h2o15mg·l-1；na2edta20mg·l-1；mnso4·h2o20.0mg·l-1；znso4·7h2o43.0mg·l-1；cuso4·5h2o0.13mg·l-1；h3bo315.5mg·l-1；na2moo4·2h2o0.02mg·l-1；ki4.15mg·l-1；cocl2·6h2o0.03mg·l-1；维生素b10.5mg·l-1；维生素b61.0mg·l-1；烟酸1.0mg·l-1；甘氨酸2.0mg·l-1。
实施例4：
在温度20±0.5℃条件下，将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基ⅰ中培养10d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料。所述的培养基ⅰ为：改良dcr培养基+2,4-d0.6mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.5mg·l-1+肌醇200mg·l-1+谷氨酰胺500mg·l-1+酸水解酪蛋白500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+乳糖5000mg·l-1+木糖10000mg·l-1+植物凝胶2000mg·l-1+250mg·l-1mes。
将3g培养材料转入150ml广口瓶中，往瓶中加入25ml培养基ⅱ，振荡培养14d，然后再往瓶中加入20ml培养基ⅱ，继续振荡培养7d，获得胚性培养物。所述的培养基ⅱ为：改良dcr培养基+2,4-d0.3mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.3mg·l-1+肌醇100mg·l-1+谷氨酰胺1000mg·l-1+天冬酰胺500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+麦芽糖20000mg·l-1+活性碳250mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速80r/mim。
将广口瓶中胚性培养物全部转入100ml量筒进行沉积40min，去掉上清液，取5ml沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40ml培养基ⅲ进行振荡培养7d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积40min，弃上清液后，取10ml沉积胚性细胞和35ml培养基ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期7d。所述的培养基ⅲ为：改良dcr培养基+naa1.0mg·l-1+mt0.8mg·l-1+aba0.2mg·l-1+ga30.4mg·l-1+肌醇900mg·l-1+谷氨酰胺350mg·l-1+天冬酰胺1200mg·l-1+五氮杂胞苷1.5mg·l-1+麦芽糖30000mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速80r/mim。
继代培养15次，胚性愈伤生长快、活力旺盛，增殖倍数为15.7。
以上所述的改良dcr培养基的组成为：kno3480mg·l-1；nh4no3120mg·l-1；kh2po4220mg·l-1；cacl2110mg·l-1；mgso4·7h2o180mg·l-1；mgcl2·6h2o65mg·l-1；feso4·7h2o15mg·l-1；na2edta20mg·l-1；mnso4·h2o20.0mg·l-1；znso4·7h2o43.0mg·l-1；cuso4·5h2o0.13mg·l-1；h3bo315.5mg·l-1；na2moo4·2h2o0.02mg·l-1；ki4.15mg·l-1；cocl2·6h2o0.03mg·l-1；维生素b10.5mg·l-1；维生素b61.0mg·l-1；烟酸1.0mg·l-1；甘氨酸2.0mg·l-1。
实施例5：
在温度20±0.5℃条件下，将按常规方法培养获得的马尾松胚性愈伤转入培养基ⅰ中培养8d，挑选体积增大2倍以上、颜色纯白，且无水渍、褐化的胚性愈伤作为培养材料。所述的培养基ⅰ为：改良dcr培养基+2,4-d0.6mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.5mg·l-1+肌醇200mg·l-1+谷氨酰胺500mg·l-1+酸水解酪蛋白500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+乳糖5000mg·l-1+木糖10000mg·l-1+植物凝胶2000mg·l-1+250mg·l-1mes。
将2g培养材料转入150ml广口瓶中，往瓶中加入25ml培养基ⅱ，振荡培养12d，然后再往瓶中加入20ml培养基ⅱ，继续振荡培养8d，获得胚性培养物。所述的培养基ⅱ为：改良dcr培养基+2,4-d0.3mg·l-1+naa1.0mg·l-1+mt0.3mg·l-1+肌醇100mg·l-1+谷氨酰胺1000mg·l-1+天冬酰胺500mg·l-1+硫代硫酸钠50mg·l-1+蔗糖10000mg·l-1+麦芽糖20000mg·l-1+活性碳250mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速90r/mim。
将广口瓶中胚性培养物全部转入100ml量筒进行沉积40min，去掉上清液，取5ml沉积胚性细胞转入干净的广口瓶中，往瓶中加入40ml培养基ⅲ进行振荡培养8d，停止振荡，在瓶中进行胚性细胞的沉积40min，弃上清液后，取10ml沉积胚性细胞和35ml培养基ⅲ转入干净的广口瓶中，进行胚性细胞的继代增殖悬浮振荡培养，培养周期8d。所述的培养基ⅲ为：改良dcr培养基+naa1.5mg·l-1+mt0.6mg·l-1+aba0.3mg·l-1+ga30.3mg·l-1+肌醇900mg·l-1+谷氨酰胺350mg·l-1+天冬酰胺1200mg·l-1+五氮杂胞苷2.0mg·l-1+麦芽糖30000mg·l-1+250mg·l-1mes。振荡培养条件为：暗培养，温度21±0.5℃，转速85r/mim。
继代培养20次，胚性愈伤生长快、活力旺盛，增殖倍数为14.8。
以上所述的改良dcr培养基的组成为：kno3480mg·l-1；nh4no3120mg·l-1；kh2po4220mg·l-1；cacl2110mg·l-1；mgso4·7h2o180mg·l-1；mgcl2·6h2o65mg·l-1；feso4·7h2o15mg·l-1；na2edta20mg·l-1；mnso4·h2o20.0mg·l-1；znso4·7h2o43.0mg·l-1；cuso4·5h2o0.13mg·l-1；h3bo315.5mg·l-1；na2moo4·2h2o0.02mg·l-1；ki4.15mg·l-1；cocl2·6h2o0.03mg·l-1；维生素b10.5mg·l-1；维生素b61.0mg·l-1；烟酸1.0mg·l-1；甘氨酸2.0mg·l-1。
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