花烟草NaD1基因启动子及其用途的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及花烟草nad1基因启动子及其用途。

背景技术：

启动子是指rna聚合酶特异性识别和结合，指导基因开始转录的特定dna序列。真核生物启动子分为核心启动子区和上游序列区两个区域，核心启动区含有转录起始位点和tata-box等顺式作用元件；上游序列区含有不同的调控表达元件，对基因转录的效率、特异性和活性起关键作用，确保基因转录的有效性和精确性。根据转录模式的不同，启动子可分为组成型、组织特异型和诱导型。了解启动子的元件构成及其功能，对于研究基因的时空表达和转录调控至关重要，此外，因对外源基因表达水平的调控作用，启动子成为基因工程表达载体的重要元件之一。

nicotialaalatadefensin1(nad1)蛋白是一种来自观赏性花烟草(nicotianaalata)的植物防御素，它对尖孢镰刀杆菌，灰霉菌，念珠菌等多种致病性真菌具有抗菌活性，并对多种哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用，因此nad1具有重要的研究价值。对于nad1的研究主要涉及蛋白功能和作用机制，而其基因调控元件的研究未有报道。其中启动子对基因表达起到重要调控作用，了解其调控模式能有助于更高效地利用nad1蛋白。

本发明对花烟草nad1基因的上游调控序列进行了克隆，以期得到其启动子基本元件的完整序列，对其进行生物信息学分析。通过构建连接缺失启动子片段启动gus基因表达的植物表达载体，遗传转化花烟草，从而验证启动子的活性。对花烟草nad1基因的表达模式进行了分析，以期为研究nad1基因的表达调控模式奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种nad1基因的光反应原件启动子。

花烟草nad1基因启动子，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步的，本发明还涉及一种核酸构建体，其包含本发明的启动子,与启动子可操作连接的基因序列。

进一步的，本发明还涉及一种重组载体，所述载体为本发明的启动子与pcambia1391zvector质粒经重组所得。

进一步的，本发明还涉及一种重组细胞，所述细胞含有权利要求1的启动子或权利要求3的核酸构建体或权利要求4的重组载体。

优选的，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根瘤农杆菌细胞。

本发明启动子制备方法：

以花烟草dna为模板，使用3条特异性引物进行扩增，所述扩增引物按照genomewalkingkit说明书进行设计。

所述3条特异性引物分别含有seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示的序列所述引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和保护碱基。

进一步的，本发明还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染本发明的重组细胞。

进一步的，本发明还涉及一种植物愈伤组织或外植体，所述愈伤组织或外植体转化有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体或感染有本发明的重组细胞。

进一步的，本发明还涉及所述启动子或所述核酸构建体或所述重组载体或所述重组细胞在高效利用nad1蛋白中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

提供了一种来源于花烟草nad1基因的启动子，所述启动子对nad1基因的表达起到了重要调控作用，该启动子中含有光反应元件，光胁迫处理花烟草使nad1基因在花中的表达有显著变化，研究该启动子调控模式在更高效地利用nad1蛋白中有重要用途。

附图说明

图1为nad1基因5’端调控区顺式作用元件。

图2为重组质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测图。

图中，1:2000marker；2:pnad1-644；3:pnad1-310；4:15000marker。

图3为pcambia1391z质粒图谱。

图4为载体构建示意图。

图中，a:pcambia1391z-pnad1-644::gus；b:pcambia1391z-pnad1-310::gus。

图5为花烟草转化过程。

图6为抗性幼苗叶片gus组织化学染色。

图中，1:野生型；2:pcambia1391z-pnad1-310::gus；

3:pcambia1391z-pnad1-644::gus。

图7为nad1基因在花烟草不同组织器官表达量。

图8为nad1基因在不同生长发育阶段的叶片中表达量。

图9为不同光处理条件下nad1基因在花烟草花中的表达量。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

下述所用生物材料均为市售，本申请人实验室有保存，可以对外公开发放。

实施例1、启动子的克隆参照魏胜华(2011)中ctab法对花烟草(植物材料花烟草种子由云南大学生命科学学院陈穗云教授赠予)dna进行提取。按照genomewalkingkit说明书设计3条特异性引物，通过热不对称交错pcr反应克隆nad1基因上游片段。如表1所示。

表1基因启动子扩增的体系

表2pcr扩增程序

其中，3条特异性引物分别为na-sp1：5’-agcttttctgcatggtggtttgg-3’,na-sp2：5’-gagacaaaccataggcaacaaagagc-3’：na-sp3：5’-gaagcacaaggagcgagccatagt-3’。

将第3次pcr产物于1.2％琼脂糖凝胶中分离,并根据gelextractionkit说明书回收纯化目的条带,按照pmd^tm19-tvectorcloningkit提供的方法克隆到试剂盒自带的pmd19-t载体上，连接产物转化大肠杆菌dh5α菌株进行扩增，经蓝白斑筛选、pcr和hindiii、kpnⅰ双酶切鉴定后，送交华大基因测序返回。测序结果如seqidno.1所示。

实施例2、nad1基因启动子序列的鉴定和分析

根据测序结果设计特异性引物na-p-644-f/r，na-p-644-f序列为5’-gtcgactcaggttatttactttttgggg-3’(下划线标记为salι酶切位点)，na-p-644-r序列为5’-gaattctgaagcacaaggagcgag-3’(下划线标记为ecorι酶切位点)。

以花烟草基因组dna为模板使用taqdnapolymerasehighfidelitykit扩增其上游片段。

其中，pcr反应体系为:platinum酶1.0μl，10×highfidelitypcrbuffer2.5μl，mgso4(50mm)1.0μl，dntpmix(10mm)0.5μl，上下游引物各0.5μl，dna1.0μl，ddh2o18.8μl，终体系为25.0μl。pcr反应程序为：94℃预变性2min，(94℃15sec，60℃30sec，68℃1min)5个循环，(94℃15sec，59℃30sec，68℃1min)5个循环，(94℃15sec，58℃30sec，68℃1min)25个循环，68℃延伸10min，12℃保存。

将上述扩增产物胶回收并连接至ptmd-19t载体上，送由公司测序后与克隆得到的启动子序列进行比对，克隆得到一条大小为644bp的nad1基因上游序列，测序结果经过与已知nad1基因上游序列比对，并通过鉴定发现成功扩增nad1基因启动子序列。测序所得启动子序列如seqidno.1所示。

利用植物顺式作用元件数据库plantcare进行相关预测,发现该序列含有启动子基本顺式作用元件tata-box和caat-box,由此推断该序列可能含有基础启动子区域。软件分析显示该序列还存在如myb蛋白结合位点mbs、抗逆反应顺式作用元件tc-richrepeats、光反应元件boxι以及乙烯反应元件ere、真菌诱导响应元件tgacg-motif等多个转录因子结合区域,分析结果如图1及表3所示。

表3nad1基因5’端调控区顺式作用元件

实施例3、pcambia1391z-pnad1-644：：gus及pcambia1391z-pnad1-310：：gus重组载体的构建

根据得到的启动子序列，合成pnad1-644及pnad1-310启动子片段(nad1基因的atg开始上游310bp片段,seqidno.5)，pnad1-310包含启动子基本元件tata-box、caat-box及转录因子结合元件。将前述两个片段分别连接至植物表达载体pcambia1391z的gus报告基因前，用于驱动其表达。连接产物转入dh5α菌株进行扩增，利用碱裂解法提取质粒进行salⅰ、ecorⅰ双酶切验证，用琼脂糖凝胶进行检测，电泳结果显示得到预期大小为644bp和310bp的条带，结果如图2所示，说明所构建的载体为阳性。构建成功的载体分别命名为pcambia1391z-pnad1-644：：gus及pcambia1391z-pnad1-310：：gus。如图3和图4所示。

实施例4、农杆菌介导的遗传转化

采用冻融法将两种植物表达载体分别转入农杆菌lba4404感受态细胞中，通过农杆菌介导的叶盘法分别转化入花烟草中，在筛选培养基中添加的激素有1.0mg/l的6-ba和0.1mg/l的naa，抗生素为20mg/l的潮霉素(hyg)。通过筛选得到了抗性幼苗。如图5所示。

实施例5、gus组织化学染色

取抗性幼苗的叶片浸泡于gus染色液中，37℃染色12h，gus染色液包括0.1gx-gluc，2ml0.5mol/ledtana2，39ml0.2mol/lnah2po4，61ml0.2mol/lna2hpo4，100μl1％tritonx-100，450μlβ-巯基乙醇，ddh2o定容至100ml。用75％乙醇脱色至浸泡液中没有绿色后拍照记录。对抗性幼苗叶片进行gus染色分析显示都为阳性，说明启动子核心元件taat-box、caat-box位于片段pnad1-310中，即-310～-1bp。结果如图6所示。

实施例6、nad1基因的表达模式分析

提取花烟草根、顶端嫩茎、嫩叶、花及不同发育阶段的花烟草叶片的总rna，分别在3株植株取样，用abi反转录试剂盒反转录成cdna。以β-actin基因为对照，利用real-timepcr技术对nad1基因进行表达量分析。

其中，反应程序为：pcr反应体系为：sybrpremixextaq酶5.0μl，上下游引物各0.5μl，cdna1.0μl，ddh2o3.0μl，终体系为10.0μl。反应程序为50℃孵育2min；95℃预变性2min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，40个循环，添加溶解曲线。

导出数据后，利用δδct法对nad1基因的相对表达量进行统计分析。

对nad1基因在花烟草不同组织器官及不同生长发育阶段的表达量进行荧光定量分析(图7)。发现nad1基因在花期花烟草的根、顶端嫩茎、嫩叶及花蕾中均有表达,其中以花中的表达量最高,嫩叶中的表达量次之。nad1基因在花中表达量是其在根中表达量的近2000倍,是其在茎中表达量的近80倍,是其在嫩叶中表达量的近10倍；在叶中的表达量也达到了根中表达量的近128倍和茎中表达量的近5倍。说明nad1基因的表达具有组织特异性，在花发育期间，nad1基因主要在花蕾中进行表达，其相对表达量远高于该基因在其他器官中的表达量。

nad1基因在不同发育阶段的叶片中的表达存在差异，如图8所示，叶片中的表达量随着植物的生长发育阶段先增加后下降，在烟草发育期其表达量达到最大。

实施例7、nad1基因对光元件的响应

以花蕾期的花烟草为材料，对其分别进行光照处理0h、24h和72h，暗处理0h、24h和72h，采取不同阶段的花蕾利用trizol法提取rna，根据highcapacitycdnareversetranscriptionkit反转为cdna，以实验室筛选出的nad1-f-60、nad1-r-177引物对nad1基因的表达量进行real-timepcr分析。其中，nad1-f-60序列为5’-ctatgaggtgcaagctagagaatg-3’，nad1-r-177序列为5’-ggcaccttctgaggattttgcta-3’。

real-timepcr分析以β-actin基因为对照，反应程序如下：pcr反应体系为：sybrpremixextaq酶5.0μl，上下游引物各0.5μl，cdna1.0μl，ddh2o3.0μl，终体系为10.0μl。反应程序为50℃孵育2min；95℃预变性2min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，40个循环，添加溶解曲线。其中，n-actin-f序列为5’-tgagatgcaccacgaagctc-3’，n-actin-r系列为5’-ccaacattgtcaccaggaagtg-3’。

导出数据后，利用δδct法对nad1基因的相对表达量进行统计分析。

在不同光处理的条件下测定了nad1基因在花烟草花中的表达量，结果表明(图9)：光照条件对nad1基因在花烟草花中的表达量有显著影响，随着光处理时间的增长而显著增加，随着暗处理时间增长而显著减少。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110>贵州大学

<120>花烟草nad1基因启动子及其用途

<141>2019-07-11

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>644

<212>dna

<213>花烟草(nicotianaalata)

<400>1

tcaggttatttactttttggggaaaaggtggggaaacctataattatgcattggaattga60

tttctttagcatttattgatgttattaagttaattatgactagatacgagtggattggtg120

gtggaatcgagaggtaaggtggtaattgagctttgaaatacccgttgacttgaggtaagt180

gtttggtctaactttgacttaagggattagggatccccgacttatttgctatgtgaaatt240

ccatgtgtgtggcgcataggtgtggtgacgagtacctatacgccgccaaataatctgttt300

agcctgttccctttcccgttcccttatatattgctttcatgtcttaactgctacttgctt360

attgatgtttccatgtctagttgctgaaaatttatgaacatgaggaacatgtgttattaa420

tttatctcaaaatttcaaaattaccaaaattgtgtacaataatttgattcacattattat480

ttttttcatttactttttttgcttcaaaagataagtacaagtttttctactcttatttca540

ttgcctataaatacctctattgagttactgctcattcaacactctgaatagcaatctttc600

ttattattaaaattcctatcctttttcactcattcaaagagact644

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agcttttctgcatggtggtttgg23

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gagacaaaccataggcaacaaagagc26

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gaagcacaaggagcgagccatagt24

<210>5

<211>310

<212>dna

<213>花烟草(nicotianaalata)

<400>5

tttcatgtcttaactgctacttgcttattgatgtttccatgtctagttgctgaaaattta60

tgaacatgaggaacatgtgttattaatttatctcaaaatttcaaaattaccaaaattgtg120

tacaataatttgattcacattattatttttttcatttactttttttgcttcaaaagataa180

gtacaagtttttctactcttatttcattgcctataaatacctctattgagttactgctca240

ttcaacactctgaatagcaatctttcttattattaaaattcctatcctttttcactcatt300

caaagagact310