一种快速检测鉴定茶黄蓟马的LAMP引物组及方法与流程

本发明涉及生物监测、检测鉴定及害虫防治技术领域，具体是一种快速检测鉴定茶黄蓟马的lamp引物组、检测方法和在出入境农产品检测、农作物生产中茶黄蓟马的早期监测、检测和鉴定中的应用。

背景技术：

茶黄蓟马scirtothripsdorsalishoods属缨翅目thysanoptera、蓟马科thripidae、硬蓟马属scirtothrips。最初起源于东南亚或印度，在最近二十年中已迅速扩散为全球性分布，是一种全球性的重要入侵害虫。其寄主范围非常广，已记载的寄主有40科100多种植物，主要为害植株的幼叶与幼果，严重时导致植物生长不良，甚至死亡，此外茶黄蓟马还可传播番茄斑萎病毒属tospovirus、等轴不稳定环斑病毒组ilarvirus、菜豆金色花叶病毒属begomovirus的八种植物病毒。对寄主植物产量的直接损失严重时可达90％以上。欧盟等地区与国家均将其列为检疫性有害生物名单。因此对茶黄蓟马开展分子生物学检测方法研究，建立能够准确、快速的快速检测鉴定方法对于进出境植物及植物产品快速通关，保护我国农业与生态安全、促进农产品出口，以及田间防控的早期监测从而及时防治非常迫切与重要。

目前茶黄蓟马的检测鉴定技术主要有两种：一种是形态特征鉴定，形态特征鉴定是昆虫鉴定最常用的方法，但其对于茶黄蓟马的鉴定具有一定的局限性，首先，茶黄蓟马体型微小,成虫体长小于1mm，蓟马近似种之间的区别特征少且不明显，必须制作玻片进行镜检并且对制片技术具有很高要求，因此对鉴定人员的专业性要求很高；其次，蓟马分类一般以成虫的外部形态作为鉴定依据，而在未成熟时期(卵、若虫)的分类，由于形态的不稳定或特征不明显而难以鉴定分类。而且这时的茶黄蓟马有可能处于未成熟时期，因此更增加蓟马形态鉴定的困难度。目前对发现未成熟时期的茶黄蓟马，常需饲养至成虫方能从事鉴定，如此不但耗时，而且蓟马饲养方法不甚成熟，且在发现的虫口数量常不多的情况下，能顺利饲养至成虫的比率甚低。另外一种是核酸分子检测法，主要为常规pcr法，该方法需要通过对不同生长阶段的茶黄蓟马均可进行检测鉴定，但这种检测方法检测时间较长，需要在专业的检测实验室中进行操作、依赖精密、贵重的设施设备，检测过程包括核酸提取、酸扩增、凝胶成像等程序繁琐的步骤且需要专业的技术人员进行操作，因此也提高了检测成本并限制了其应用范用，不适合口岸、与田间等现场推广使用。

lamp荧光检测技术是核酸体外扩增与荧光法技术的结合，在恒温条件下进行，通过添加特殊的dna聚合酶和特异性引物，在扩增的同时加入荧光基团，通过荧光信号累积实时监控扩增过程，实现核酸快速扩增和检测，并对产物做溶解曲线分析。其具有所需实验条件简单，前处理要求低，特异性强、扩增速度快等优点，可广泛应用于食品、医药、农业等领域，在昆虫的检测中报道较少，而对于茶黄蓟马的lamp荧光检测方法的建立目前还没有报道。

本发明利用茶黄蓟马的its2基因序列特征设计了6条特异性的lamp荧光检测引物，在此基础上建立了茶黄蓟马的lamp荧光检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速检测鉴定茶黄蓟马的lamp引物组及方法，针对现月技术中对茶黄蓟马检测和鉴定中主要基于形态学特征，对专业人员技术要求高、程序繁琐、耗时长等特点，以及现有pcr分子检测需要在专业的检测实验室中进行操作、依赖精密、贵重的设施设备，检测过程繁琐以及成本高等问题，难以做到对有害生物的及时监测、检测鉴定，提供了茶黄蓟马的lamp荧光检测引物组与检测方法，前处理简单、灵敏高、准确度高、检测周期高、实现各种类型现场快速检测。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

茶黄蓟马lamp荧光检测特异性引物的设计：通过对茶黄蓟马scirtothripsdorsalis与其他蓟马科thripidae的its2基因序列进行比对分分析，利用lampdesigner软件(http://www.optigene.co.uk/lamp-designer/)设计了多套并实验筛选了一套茶黄蓟马特异性荧光检测引物组，由下列引物组成：

正向内引物fip：gcggagactccaatctcgtcactcaacgaccagactgt；

反向内引物bip：ctcacggcgtggtactcttaattccgtgcagcgatatc；

正向外引物f3：ggccacacctgactga；

反向外引物b3：caagcgaacgagacaagt；

正向环引物loopf：cgccacgagtgacaca；

反向环引物loopb：aaagtgagtgtgggctcg。

作为本发明进一步的方案：所述引物组采用茶黄蓟马的its2作为靶基因。

一种快速检测鉴定茶黄蓟马的方法，包括如下步骤：

(1)引物合成：选择专业的引物合成公司合成引物；

(2)样本前处理：将茶黄蓟马转移到滴有10μltnes提取液的载玻片上，将其载玻片放在解剖镜下，调至视野范围内，先用无菌的微针将蓟马的翅展向身体的两侧，而后再用微针从蓟马腹部进行刺穿，将刺过的蓟马放入事先装有10μl提取液的2ml的离心管中，而后用移液器吸取40μl的提取液冲洗针头滴入离心管中，再取40μl提取液来回的冲洗载玻片上放蓟马的位置，连同原来的的10μl提取液一同吸入离心管中作为样本模板待用；

(3)lamp特异性检测：使用isothermalmastermix反应试剂盒，25μl反应体系进行扩增，采用上述的lamp引物组进行lamp检测。

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中，微针采用昆虫针中的“00”号针。

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中，穿刺次数为4-6下。

作为本发明进一步的方案：步骤(3)中，25μl反应体系的具体配置为：1×的isothermalmastermix15μl，5μmol/lf3和b3引物各1μl，40μmol/lfip和bip引物各1μl，20μmol/llf和lb引物各1μl，样本模板2μl，加ddh2o补足至25μl。

作为本发明进一步的方案：步骤(3)中，采用genieⅱ便携式基因荧光扩增仪进行扩增。

作为本发明再进一步的方案：步骤(3)中，lamp检测反应条件为，63℃反应30min，最后反应温度升高至98℃，以0.05℃/s的速度降温至80℃作熔解曲线，反应5min，然后终止反应。

与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、操作简单、应用性强：本发明的最大优点是不需要以往pcr检测中繁琐的操作步骤与规程，无需提取核酸，操作简单；不需要以往pcr检测中所需要的专业检测环境与pcr仪、电泳仪、凝胶成像系统等专业精密的仪器设备，仅需一台便携式lamp荧光检测仪，便于各类现场检测，便于基层推广使用；

2、特异性强、灵敏度高、结果准确：本发明设计的引物组是本技术的关键，该引物根据茶黄蓟马its2基因序列设计得到，引物包含6条特异性引物，可识别靶标序列上的6个独立区域，任何一个区域与引物不匹配均不能进行扩增；可对茶黄蓟马各个虫态进行实时检测，具有很高的灵敏性；且经过多次重复验证，结果准确；

3、检测快速：应用本发明检测方法，仅需十几分钟即可得到检测结果，大大缩短了检测时间。

附图说明

图1为茶园常见5种蓟马虫体的lamp反应。

图2为茶园常见5种蓟马dna的普通pcr凝胶电泳图。

图3为茶黄蓟马虫体与茶黄蓟马dna的lamp反应图。

图4为茶黄蓟马幼虫虫体与茶黄蓟马成虫虫体的lamp反应图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

采用多种靶基因设计扩增引物，并直接采用茶黄蓟马虫体作为样本模板(省去核酸dna提取步骤)，经过长期的试验研究与比对，筛选并摸索出一组快速检测茶黄蓟马的lamp检测引物与检测方法。该检测引物如下：该引物设计采用茶黄蓟马的its2作为靶基因，根据genbank上的茶黄蓟马的基因序列(genbank登录号:gu830902.1)，使用lampdesigner软件(http://www.optigene.co.uk/lamp-designer/)，设计6条引物：正向内引物(fip)、反向内引物(bip)、正向外引物(f3)、反向外引物(b3)、正向环引物(loopf)及反向环引物(loopb)，引物序列如下：

采用该引物对茶黄蓟马进行快速检测的步骤如下：

(1)引物合成：选择专业的引物合成公司合成引物。

(2)样本前处理：将茶黄蓟马转移到滴有10μltnes提取液的载玻片上，将其载玻片放在解剖镜下，调至视野范围内，先用无菌的微针(昆虫针中的“00”号针为最好)将蓟马的翅展向身体的两侧，而后再用微针从蓟马腹部进行刺穿，一般穿刺以4～6下为宜，将刺过的蓟马放入事先装有10μl提取液的2ml的离心管中，而后用移液器吸取40μl的提取液冲洗针头滴入离心管中，再取40μl提取液来回的冲洗载玻片上放蓟马的位置，连同原来的的10μl提取液一同吸入离心管中作为样本模板待用。

(3)lamp特异性检测：使用isothermalmastermix反应试剂盒，25μl反应体系：1×的isothermalmastermix15μl，5μmol/lf3和b3引物各1μl，40μmol/lfip和bip引物各1μl，20μmol/llf和lb引物各1μl，样本模板2μl，加ddh2o补足至25μl。扩增程序：利用genieⅱ便携式基因荧光扩增仪进行扩增，设置程序为：63℃反应30min，最后反应温度升高至98℃，以0.05℃/s的速度降温至80℃作熔解曲线，反应约5min后终止反应。

实施例1

将所设计引物采用lamp检测方法在genieⅱ便携式基因荧光扩增仪对茶园中常见5种蓟马进行扩增和检测以验证该引物与方法的特异性，并将其结果与常规pcr检测方法进行比较，结果表明该方法特异性非常好。具体情况如下：以茶黄蓟马(三个样品)、色蓟马thripscoloratuskarny；淡色蓟马thripsflavusschrank；烟蓟马thripstabacilindeman；花蓟马frankliniellaintonsa(trybom)的成虫虫体为模板，用双蒸水作空白对照进行lamp反应，检测该方法的特异性，只有茶黄蓟马的3个样品有扩增(见图1)，出峰时间均在10分钟左右，分别为10min、10min30s、10min15s，熔解温度为89.6℃-90.6℃之间，结果表明该方法的特异性好。应用常规pcr检测方法对于以上成虫的dna样品进行检测，结果显示一致(见图2)。

实施例2

将所设计引物采用lamp检测方法在genieⅱ便携式基因荧光扩增仪对茶黄蓟马成虫虫体与茶黄蓟马dna进行扩增和检测以验证该引物与检测方法的特异性，结果表明使用该引物直接采用茶黄蓟马虫体与采用茶黄蓟马dna进行检测结果均具有扩增，茶黄蓟马dna出峰时间分别为8min、9min，茶黄蓟马虫体的出峰时间分别为11min与13min45s，四个样品的熔解温度在89.4℃-89.8℃之间，检测鉴定结果一致(见图3)。

实施例3

将所设计引物采用lamp检测方法在genieⅱ便携式基因荧光扩增仪对茶黄蓟马幼虫虫体与茶黄蓟马成虫虫体进行扩增和检测以验证该引物与检测方法的特异性，结果表明使用该引物采用茶黄蓟马幼虫虫体与成虫虫体进行检测结果均具有扩增，三头茶黄蓟马幼虫虫体出峰时间分别为10min15s、10min45s、11min45s，两头茶黄蓟马成虫虫体出峰时间分别为12min30s、12min，五个样品的熔解温度在83.0℃-90.2℃之间，检测鉴定结果一致(见图4)。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110>南昌师范高等专科学校

<120>一种快速检测鉴定茶黄蓟马的lamp引物组及方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcggagactccaatctcgtcactcaacgaccagactgt38

<210>2

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcacggcgtggtactcttaattccgtgcagcgatatc38

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggccacacctgactga16

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caagcgaacgagacaagt18

<210>5

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgccacgagtgacaca16

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aaagtgagtgtgggctcg18