本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种稳定快速生产ε-聚赖氨酸的方法。
背景技术：
ε-聚赖氨酸(亦称ε-聚-l-赖氨酸，ε-poly-l-lysine，ε-pl)是目前从自然界中发现的两种氨基酸同聚物之一，是由微生物代谢合成(主要为放线菌，如白色链霉菌、淀粉酶产色链霉菌、北里孢菌、弗吉尼亚链霉菌、灰褐链霉菌、不吸水链霉菌，另外，球形节杆菌以及部分芽孢杆菌也可以合成)的天然产物，它由25-35个α-羧基和ε-氨基连接的l-氨基酸残基(l-lys)组成。
ε-pl是一种聚阳离子多肽，对微生物具有广谱抑菌活性，其中包括细菌如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和某些病毒。小鼠喂食实验表明，这种聚合物几乎没有急性毒性、亚慢性及慢性毒性，细菌传代实验中也未表现出致诱变性。ε-pl也能在人体内分解为赖氨酸，其是世界范围内各国允许在食品中强化的一种氨基酸，同时也是人体必需的八种氨基酸之一。此外，它还具有优良的稳定性和水溶性，其水溶液在加热处理100℃中煮沸30min甚至121℃高压蒸汽处理20min均不会产生分解。正是基于上述优良特性(抑菌谱广、安全性高、热稳定性好、生物可降解)，在一些国家(如日本、韩国、美国、比利时等)批准其作为一种食品防腐剂应用于食品工业中。2012年申请人联合天津科技大学等提交了ε-pl及其盐酸盐为食品添加剂申请材料，2014年4月，中国国家卫生计生委食品安全标准与监测评估司批准了ε-聚赖氨酸(ε-pl)及其盐酸盐(ε-pl·hcl)可作为食品添加剂新品种应用于大米及制品、小麦粉及其制品、杂粮制品、烘烤食品、肉及肉制品、调味品、果蔬汁类及其饮料、水果、蔬菜(包括块根类)、豆类、食用菌、藻类、坚果以及籽类等食品工业中。此外，其在化妆品、基因载体、药物包被、水凝胶、生物芯片和生物电子的镀膜材料等方面也具有重要的应用。因此，ε-pl及其盐酸盐具有非常广阔的应用潜力及商业市场前景。
在国内，虽然ε-pl及其盐酸盐作为新的食品添加剂使用才短短的五年时间，相对来说整体的行业规模还比较小，属于起步阶段，但是，随着食品工业对ε-聚赖氨酸及其盐酸盐的认知度越来越高，除国外市场依旧很大外，国内市场的需求量也将不断增加，另外，作为该行业的领航企业申请人于2019年启动的扩大使用范围相关工作，并于2019年4月9日在国家风险评估中心征求意见公示。
目前，ε-pl的获得仍然主要依靠微生物发酵技术，1989年日本智索股份有限公司(chissocorporation)首先利用白色链霉菌发酵技术实现了ε-pl的工业化生产，且于2001年形成了年产千吨级的规模。而国内虽然已有少数几家企业实现了ε-pl的工业化生产，但限于相对落后的技术水平，发酵水平普遍偏低，即使有报道产量相对高的，也仅主要在小试水平实现，难以放大生产，因此，国内生产现状亟需提高，打破现有技术壁垒，研究开发新的发酵工艺，对提高ε-pl生产能力，扩大ε-pl的工业化生产规模，增大国产ε-pl的市场份额具有非常重要的意义。
经过检索，截至目前，我国公布的有关ε-pl及其盐酸盐发酵生产的主要专利有：
1.专利号为zl97182253.0的“大量生产ε-聚-l-赖氨酸的菌株和生产方法”发明专利，是岩田敏治等人在中国申请的专利，该专利是在获得诱变菌株b21021(fermbp-5926)基础上，于培养基中好气培养该菌株，然后从发酵液中分离和纯化ε-聚-l-赖氨酸。
2.专利号为zl200510037774.2的“利用北里孢菌pl6-3制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”发明专利，公开了一种通过筛选的北里孢菌(kitasatosporasp.)pl6-3发酵生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法。
3.专利号为zl200610013800.2的“回流工艺生产ε-聚-l-赖氨酸的方法”的发明专利，公开了一种回流工艺生产ε-聚-l-赖氨酸的方法，该专利的保护点在于将提取过程后期的穿透液循环使用，进而发酵生产ε-聚-l-赖氨酸。
4.专利号为zl200710057098.4的“一种诱变菌株白色链霉菌tust2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的发明专利，公开了一种诱变白色链霉菌菌株tust2及利用该菌株进行ε-聚赖氨酸及其盐发酵的方法。
5.专利号为zl200810153709.x的“高抑菌活性ε-聚-l-赖氨酸组分的制备方法”的发明专利，是申请人与天津科技大学共同申请的。该专利将通过微生物发酵法得到的ε-pl发酵液，经过微滤、超滤和纳滤组合多级分离技术获取高抑菌活性ε-聚-l-赖氨酸。
6.专利号为zl200910025270.7的“一株球形节杆菌菌株及其在发酵生产ε-聚赖氨酸中的应用”的发明专利，公开了一株球形节杆菌arthrobacterglobiformisqc18，并利用该菌株发酵产ε-聚赖氨酸。
7.专利号为zl200910030330.4的“一种吸附固定化发酵生产ε-聚赖氨酸的工艺”的发明专利，公开了一种将吸附固定化材料固定于发酵罐中，以实现生产菌株固定于该材料上，进而实施固定化生产ε-聚赖氨酸的发酵工艺。
8.申请号为200910071853.3的“一种ε-聚赖氨酸的制备方法”，公开了一种利用弗吉尼亚链霉菌发酵制备ε-聚赖氨酸的方法。
9.专利号为zl200910069517.5的“一种提高ε-聚-l-赖氨酸产量的新方法”的发明专利，公开了一种采用淀粉酶产色链霉菌或白色链霉菌进行ε-聚赖氨酸发酵的方法，该方法通过流加l-赖氨酸来提高ε-聚赖氨酸产量，较不流加产量提高25-50％。
10.专利号为zl200910224087.x的“一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”的发明专利，公开了一种灰褐链霉菌streptomycesgriseofuscusls-h1，并利用该菌株发酵积累ε-聚赖氨酸及其盐的方法。在优化条件下，产量可达0.7-20g/l。
11.专利号为zl201010585034.3的“一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法”，公开了一种筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法，该方法利用与德拉根道夫试剂复合，从而不需加入指示剂即可筛得ε-聚赖氨酸产生菌。
12.申请号为201010609202.8的“一种提高ε-聚赖氨酸发酵产量的方法”，公开了一种通过微波、硫酸二乙酯复合诱变获得高产菌株的方法，利用该菌株摇瓶发酵水平从0.6g/l提高至0.85g/l。
13.专利号为zl201110152802.0的“不吸水链霉菌str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法”，公开了一种新筛选的不吸水链霉菌str-8及利用其制备ε-聚赖氨酸及其盐的方法。
14.申请号为201110250123.7的“一种利用甘油为单一碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法”，公开了一种采用甘油作碳源，结合两阶段ph调控策略和流加发酵方法生产ε-聚赖氨酸的方法。
15.申请号为201110274326.x的“一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵生产ε-聚赖氨酸的方法”，公开了一种采用葡萄糖和甘油共同作为碳源，发酵生产ε-聚赖氨酸的方法。
16.专利号为zl201110333684.3的“一种ε-聚-l-赖氨酸的生产方法”的发明专利，公开了一种ε-聚-l-赖氨酸的生产方法，该专利的保护点在于在发酵培养前期或者中期加入1-10g/l的甘氨酸，以提高菌株合成代谢能力，该方法的实施，使得产物积累量提高了20-50％。
17.专利号为zl201110362088.8的“链霉菌streptomycessp.nk-660及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法”的发明专利，公开了链霉菌streptomycessp.nk-660的获得，及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法。
18.专利号为zl201210081685.8的“一株链霉菌及其应用”的发明专利，公开了一株链霉菌streptomycessp.nk-49，及利用该菌株生产ε-聚赖氨酸的发酵培养和产物纯化的方法。
19.申请号为201210327491.1的“玉米浸泡水用于发酵生产ε-聚赖氨酸的方法”，公开了一种玉米浸泡水用于发酵生产ε-聚赖氨酸的方法，用玉米浸泡水代替部分配料用水和酵母膏，采用从土壤中筛选所获得的弗吉尼亚链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸。
20.申请号为201210361520.6的“发酵法制备ε-聚-l-赖氨酸”，公开了一种发酵法制备ε-聚-l-赖氨酸的方法，该方法在菌株发酵获得粗提液，后采用离子交换层析、脱色、超滤、乙醇沉淀等技术制备获得ε-聚-l-赖氨酸成品。
21.专利号为zl201210518271.7的“一种增强细胞生长及生物过程效率的ε-聚赖氨酸补料分批发酵方法”的发明专利，公开了一种增强细胞生长及生物过程效率的ε-聚赖氨酸补料分批发酵方法。该专利用不吸水链霉菌str-8进行发酵培养，当培养体系ph值下降至3.6～4.1之间时，按照每小时每升发酵培养基中补加0.025g～0.5g酵母粉或其他有机氮源至培养体系中直至发酵结束，同时自ph降至3.6～4.1之间开始，用氨水控制培养体系的ph维持在3.6～4.1之间直至发酵结束，并补加灭过菌的含葡萄糖和硫酸铵的补料培养基，维持培养体系的葡萄糖为5～30g/l直至发酵结束。利用该方法最高ε-聚赖氨酸为15天35.4g/l。
22.专利号为zl201310257217.6的“一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法”的发明专利，公开了一种促进ε-聚赖氨酸合成的方法，通过在ε-聚赖氨酸发酵过程中分批或连续流加所述l-谷氨酸和/或l-谷氨酸钠固体或溶液，实现ε-聚赖氨酸产量显著提高。
23.申请号为201410079901.4的“一种ε-多聚赖氨酸菌及其制备与发酵方法”，公开了一种利用ε-多聚赖氨酸菌(streptomycesgriseolusk6)制备ε-多聚赖氨酸的发酵方法。
24.专利号为zl201410156360.0的“一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法”的发明专利，公开了一种积累高丝氨酸的ε-聚赖氨酸的发酵方法，该方法采用淀粉酶产色链霉菌cgmccno.3145作为生产菌株，在发酵0-48h，向发酵培养基中添加终浓度为2.5-5.0g/l的l-苏氨酸。
25.专利号为zl201410216869.x的“一种白色链霉菌及其应用”的发明专利，公开了一种产ε-聚l-赖氨酸的白色链霉菌ls2，及其在制备ε-聚l-赖氨酸的应用。
26.专利号为zl201510021744.6的“一种低ph值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法”的发明专利，公开了一种在发酵过程中引入酸性ph胁迫工艺，即人为或自发使ph降为2.5-3.0，维持12-48h之后，将ph再提高到3.5-4.5，保持稳定直到发酵结束的ε-聚赖氨酸发酵方法。
27.申请号为201510069494.3的“一种以木薯淀粉发酵生产ε-聚赖氨酸的方法”，公开了一种用木薯淀粉为碳源，在一定条件下发酵生产ε-聚赖氨酸的方法。
28.专利号为zl201510417599.3的“一种利用玉米副产物同时生产ε-聚赖氨酸和蛋白饲料的方法”的发明专利，公开了一种利用玉米副产物同时生产ε-聚赖氨酸及蛋白饲料的方法。该方法用淀粉酶和纤维素酶分别处理玉米皮和胚芽粕，将其中的淀粉和部分纤维质水解成还原糖，固液分离后的滤液与葡萄糖母液混合作为碳源，配合玉米浆作为有机氮源进行液态发酵生产ε-聚赖氨酸。
29.申请号为201510454548.8的“一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法”，公开了一种采用响应面法优化ε-聚赖氨酸发酵的新型培养基的方法，该方法可以利用木薯淀粉和鱼粉等优化设计获得最佳新型发酵培养基。
30.申请号为201510454549.2的“一种以木薯淀粉原料生产ε-聚赖氨酸的连续流加补料分批发酵工艺”，公开了ε-聚赖氨酸的生产工艺，具体的说是一种以木薯淀粉原料生产ε-聚赖氨酸的连续流加补料分批发酵工艺。
31.申请号为201510557915.7的“一种天然防腐剂ε-聚赖氨酸菌种及其筛选、发酵和鉴定方法”，公开了一种ε-聚赖氨酸菌种kitasatosporaclausaky3，同时公开了该ε-聚赖氨酸菌种的筛选、发酵和鉴定方法。
32.专利号为zl201510749970.6的“一种ε-聚-l-赖氨酸的发酵生产工艺”的发明专利，公开了一种采用淀粉酶产色链霉菌(streptomycesdiastatochromogenes)cgmccno.3145作为生产菌株，在两阶段分批补料过程中，在补糖的同时复合流加苏氨酸，进行ε-聚-l-赖氨酸的发酵生产工艺，产量较不流加苏氨酸提高了60-110％。
33.专利号为zl201510886138.0的“一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用”的发明专利，公开了一种小白链霉菌基因工程菌streptomycesalbuluspd-4，并公开了该重组菌的构建方法与发酵验证。
34.专利号为zl201610190625.8的“一种ε-聚赖氨酸的制备方法”的发明专利，是申请人联合浙江工业大学一起申请的，该发明公开了一种ε-聚赖氨酸的制备方法，具体涉及：将ε-聚赖氨酸盐酸盐加入到水中，配制成质量浓度6-10％的ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液，调节ph值，获得ph值9-13的ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液，采用纳滤膜进行一次浓缩，取一次截留液加水稀释并再次采用纳滤膜浓缩，取再次浓缩的截留液重复稀释和浓缩至截留液中无氯离子检出，取最后一次浓缩的截留液再浓缩至ε-聚赖氨酸质量浓度20％以上后进行干燥，获得ε-聚赖氨酸；采用本发明方法，可大批量得到ε-聚赖氨酸产品，工艺简单，收率高达90％以上，所得产品成型较好，便于储存和运输。
35.申请号为201610551417.6的“一种提高ε-聚赖氨酸产量的方法”，公开了一种通过在链霉菌发酵培养基中添加外源物质，包括葡萄糖酸钙，天冬氨酸，赖氨酸，提高ε-聚赖氨酸产量的方法。
36.专利号为zl201610641559.1的“一种ε-聚赖氨酸的生产方法”的发明专利，公开了一种ε-聚赖氨酸的生产方法，具体包括制备发酵液，将发酵液依次进行过滤、碱化、吸附、盐酸解析、脱色处理后得到清液；调整清液的ph为9.0～10.0，进行纳滤操作，即完成。
37.申请号为201610641559.1的“一株ε-聚赖氨酸高产菌株及生产ε-聚赖氨酸方法”，公开了一种ε-聚赖氨酸高产菌株ea-19，并利用该菌株采用鼓泡法发酵生产ε-聚赖氨酸的方法。
38.申请号为201611120754.6的“一种以ph调控结合有机氮源补料提高ε-聚赖氨酸产量的方法”，公开了一种ph两阶段控制结合控制发酵液中nh4+-n、葡萄糖浓度以发酵生产ε-聚赖氨酸的方法。
39.申请号为201710347341.x的“一种ε-聚赖氨酸的生产方法”，公开了一种将制得的含有ε-聚赖氨酸的发酵液采用阳离子树脂吸附后依次经过氨水解吸和减压浓缩处理以制备ε-聚赖氨酸的方法。
40.申请号为201710544155.5的“一种ε-聚赖氨酸的生产方法”，公开了一种以北里孢菌为菌种，经种子培养和发酵培养生产ε-聚赖氨酸的方法，该方法的特征之处在于控制发酵培养基中的铁离子浓度。
41.申请号为201810873130.4的“一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法”，公开了一种以丝瓜络或海绵作为细胞固定载体，并在ε-聚赖氨酸合成阶段间歇流加灭过菌的有机氮源溶液，结合离子交换树脂离位分离ε-聚赖氨酸的发酵方法。
42.申请号为201810873126.8的“一种提高ε-聚赖氨酸发酵产量的营养液制备方法”，公开了一种以食用菌工厂化栽培所产生的菌渣如杏鲍菇菌渣、真姬菇菌渣或金针菇菌渣等为生产原料制备ε-聚赖氨酸发酵用营养液的制备方法。
如前文所述，国内虽已有少数几家企业实现了ε-pl的工业化生产，但大多仍处于实验室和中试开发阶段，且发酵水平较国际领先水平有较大差距，即使有报道产量相对高的，也仅主要在小试水平实现，相关技术难以规模化放大生产；目前，ε-pl种子制备普遍采用的方法是，种子培养至一定时间(如30h)，转至二级种子或发酵，但是这种统一时间的方式会因菌种保存时间长短、或斜面质量的好坏，造成种子稳定性较差，不利于后续控制。
此外，ε-pl生产中糖酸转化率和ε-pl生产能力受发酵液中残糖的影响，因此为了提高ε-pl的产量，通常选择分批补料发酵的方式，即在发酵过程中流加碳源并维持一定的浓度，以此提高产量。对于ε-pl常规的分批补料发酵而言，普遍采用ph两阶段控制，即发酵一阶段控制恒定ph5.0及以上，目的是以利于菌体的生长，待耗糖量将至一定值(10g/l)，使发酵ph自然将至ph4.0，进行二阶段发酵，继续恒定ph直至发酵结束，第二阶段的控制主要的目的是促进ε-pl的高产。(上述发酵方法的文献来源：pkahar，tiwata，jhiraki，eyparkandmokabe.enhancementofε-polylysineproductionbystreptomycesalbulusstrain410usingphcontrol[j].journalofbioscienceandbioengineering，2001，91(2)：190-194.目前大多都是采用这篇文献中的两阶段ph控制)而对于该种发酵方式，无形中增加了发酵培养周期，容易造成ε-pl生产效率低，增加能耗，而且初始ph过高，也会增加了染菌的可能，因此，找寻一种稳定的种子培养方法、快速的发酵方法，对打破现有技术壁垒，改善发酵工艺具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，将传统两阶段发酵生产，优化为一步降ph，不仅仅简化了现有发酵生产方法，显著提高了ε-聚赖氨酸的产率(传统ε-聚赖氨酸产量12-18g/l，本工艺25g/l-31g/l)，不仅缩短了发酵周期(所述发酵周期不包含种子培养时间，传统发酵周期为168h-196h，本工艺发酵周期为110h-144h)。本发明不仅节约了发酵工艺成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，工艺简单易放大，易于实现绿色、高效、节能的产业化大规模生产。
一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，步骤如下：将链霉菌孢子悬液接种于种子培养基中，进行种子培养，待ph降至4.0-6.0，得到种子液，将所述种子液接入发酵培养基中，在温度28-32℃，溶氧20-50％下发酵培养，当发酵液中葡萄糖浓度降至8-10g/l时，流加补料培养基，恒定发酵液中葡萄糖浓度在10-12g/l；待发酵液ph降至3.0-4.5，维持恒定ph3.0-4.5；待ε-聚赖氨酸产量不再增加，结束发酵。
优选地，所述种子培养中，待所述ph降至4.5-5.5，得到种子液。
优选地，所述发酵培养中，待所述发酵液ph降至3.5-4.5，维持恒定ph3.5-4.5。
优选地，所述链霉菌孢子悬液的制备步骤为：取生长成熟的链霉菌孢子加入生理盐水中，经摇匀，棉纱过滤以滤掉菌丝，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤1-3次，得到孢子悬液，所述孢子悬液所含孢子量为107-108个/ml。
优选地，所述孢子悬液接种至种子培养基的接种量为0.2％-2％(v/v)。
优选地，所述种子液的培养温度为：28-32℃。
优选地，所述种子液培养方式为摇床振荡培养、发酵罐搅拌培养或鼓泡培养中的一种，所述摇床振荡培养中，控制转速为180-220r/min；所述发酵罐搅拌培养或鼓泡培养中，控制溶氧为20-35％。
优选地，所述种子液接入发酵培养基的接种量为5％-20％(v/v)。
优选地，所述发酵培养中，溶氧为20-35％。
优选地，所述补料培养基组成为(g/l)：葡萄糖600-1000，硫酸铵30-50，ph自然，余量为水。
优选的，所述发酵培养过程中，通过流加碱液来维持ph恒定，所述碱液具体为6m的氢氧化钠或浓度为50％-100％氨水中的一种或两种的组合。
优选地，所述一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法，具体步骤如下：
(1)取生长成熟的链霉菌孢子加入生理盐水中，经摇匀，棉纱过滤以滤掉菌丝，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤1-3次，得到孢子悬液，所述孢子悬液所含孢子量为107-108个/ml；
(2)将所述孢子悬液按照接种量0.2％-2％接入种子培养基中，在温度28-32℃下进行种子培养，待ph降至4.5-5.5时，得到种子液；
(3)将所述种子液按照接种量5％-20％，转接至发酵培养基中进行发酵，在温度28-32℃，溶氧20-35％下发酵培养；当发酵液中残余葡萄糖浓度降至8-10g/l时，流加补料培养基，使残余葡萄糖浓度维持在10-12g/l；待发酵液ph降至3.5-4.5时，流加碱，维持恒定ph3.5-4.5；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。
优选的，所述步骤(1)中，所述棉纱为脱脂棉、纱布中的一种或两种的组合。
优选的，所述步骤(2)中，种子培养基组成为：m3g培养基(g/l)：葡萄糖20-50、酵母粉5-10、(nh4)2so410-15，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po41.36，mgso4·7h2o0.5，znso4·7h2o0.04，feso4·7h2o0.03，ph6.5-7.5，余量为水。
优选的，所述步骤(3)中，所述发酵培养方式为摇床振荡培养、发酵罐搅拌培养或鼓泡培养中的一种，所述摇床振荡培养的转速为180-220r/min。
优选的，所述步骤(3)中，发酵培养基组成为(g/l)：碳源50-80、有机氮源5-10、无机氮源5-10，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po41.36，mgso4·7h2o0.5，znso4·7h2o0.04，feso4·7h2o0.04,ph6.0-7.5，余量为水；所述碳源为葡萄糖、甘露糖、甘露醇、半乳糖、海藻糖、果糖或糖蜜中的一种或两种以上的混合；所述有机氮源为酵母粉、酵母膏、玉米浆、蛋白胨或牛肉膏中的一种或两种以上的混合，所述无机氮源如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素中的一种或两种以上的混合。
更优选的，所述步骤(3)中，发酵培养基组成中，碳源为葡萄糖，有机氮源为酵母粉，无机氮源为硫酸铵。
优选地，所述链霉菌具体为淀粉酶产色链霉菌。
更优选地，所述链霉菌菌种保藏号为：cgmccno.3145。
所述菌种来源于公开号为cn101671703a的发明专利《一种提高ε-聚-l-赖氨酸产量的新方法》。
本发明的优点和积极效果是：
1、孢子悬液直接上罐：本发明改变了现有生产工艺步骤，采用经过滤的孢子悬液直接上罐，孢子更均匀同步，从而省略了从菌种到种子液，用于活化菌种的摇瓶种子的步骤，省去了摇瓶种子的发酵时间(约30h)，显著缩短了发酵周期，降低了生产成本。本发明制备的链霉菌孢子悬仅是将菌丝过滤掉，对于是否仅获得单孢子的数量不作要求。
2、以ph为指标判定转种时机——实现高效稳定发酵
本发明以ph为指标判定转种时机，使得种子液质量稳定，而现有技术则是以培养时间作为判定转种的标准(一般发酵时间为30h)；本发明确定以种子液ph降至4.0-6.0时为转种时机，可以确保种子液代谢状态的相对稳定，可以显著缩短因种子稳定性带来的产量波动，同时显著提高发酵效率。
本发明发现现有技术以发酵时间为衡量标准确定种子液的培养时间，由于每批种子液的ph的不同，以此为种子转种发酵后，其发酵性能差异性较大，从而引起发酵的不稳定；而本发明以ph为衡量转种时机时，其种子液的代谢状态基本一致，以此为种子液转种发酵后，其发酵性能显著提高。
3、一步降ph发酵获得高产ε-聚赖氨酸
在发酵过程中，将传统两阶段发酵生产，优化为一步降ph(即待发酵液ph降至3.0-4.5，维持恒定ph3.0-4.5)，不仅仅简化了现有发酵生产方法，显著提高了ε-聚赖氨酸的产率(传统ε-聚赖氨酸产量12-18g/l，本工艺25g/l-31g/l)，不仅缩短了发酵周期(所述发酵周期不包含种子培养时间的发酵周期，传统发酵周期为168h-196h，本工艺发酵周期为110h-144h)，本发明使ε-聚赖氨酸产量较原始工艺提高了80％-130％，发酵周期缩短了28％-45％。本发明不仅节约了发酵成本，如时间、人力、用电、用水成本，而且减少了发酵废液和废气的排放，减轻环境污染，工艺简单易放大，易于实现绿色、高效、节能的产业化大规模生产。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的目的、技术方案，以下结合具体实施例，将对本发明作进一步说明，但以下实施例仅是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法
(1)取培养好的生长在斜面固体培养基的链霉菌(保藏号为：cgmccno.3145)，用接种环刮下整支斜面孢子于盛有玻璃珠的250ml三角瓶中，加入50ml生理盐水，加盖瓶塞后摇匀使孢子充分打散，然后用无菌三层纱布过滤至100ml三角瓶中，再累计加50ml无菌生理盐水至250ml三角瓶中，按上述方法将残留孢子悬液继续过滤2次，即可制成孢子悬液；孢子悬液所含孢子量为(4-5)×107个/ml；
(2)将所述孢子悬液按照接种量2％接入含有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，在温度30℃，摇床振荡培养，220r/min的条件下进行种子培养，待ph降至5.0时，得到种子液；
(3)将所述种子液按照接种量8％，转接至装有发酵培养基的10l机械搅拌式发酵罐中进行发酵，控制发酵温度30℃，初始转速250r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联；当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，流加补料培养基，使残余葡萄糖浓度维持在10g/l；待发酵液ph降至4.0时，自动流加50％氨水使ph维持在4.0；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。
所述补料培养基组成为(g/l)：葡萄糖700，硫酸铵45，ph自然，余量为水。
其中，斜面固体培养基为贝纳特(benneett’s)固体培养基(g/l)：葡萄糖10、牛肉膏1、蛋白胨2、酵母粉1、琼脂粉20，ph7.0，余量为水。
种子培养基组成(即为m3g培养基)(g/l)：葡萄糖50、酵母粉5、(nh4)2so410，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po41.36，mgso4·7h2o0.5，znso4·7h2o0.04，feso4·7h2o0.03，ph7.0，余量为水。
发酵培养基组成(g/l)：
葡萄糖50、酵母粉5、(nh4)2so410，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po41.36，mgso4·7h2o0.5，znso4·7h2o0.04，feso4·7h2o0.03，ph7.0，余量为水。
发酵结束后，经检测发酵液中，ε-pl最高产量为30.11g/l较下文对比例1的产量提高116％，发酵周期为120h(所述发酵周期仅为发酵时间，种子发酵时间不计算在内，种子发酵时间与对比例发酵时间相比显著缩短到原来的35-60％)，较常规发酵工艺对比例1的发酵周期缩短了38.7％。
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：
按照申请号为200910152931.2的发明专利《一种提取ε-聚赖氨酸及其盐的方法》中所述方法，将发酵液酸化后过滤得到清滤液，然后将清滤液碱化制成碱化液再压入树脂吸附柱中进行吸附，先用纯化水洗涤饱和树脂，再用盐酸解析，得解析液，用活性炭把解析液脱色，过滤得脱色液，将脱色液压入膜滤装置进行循环浓缩，得浓缩液，浓缩液经喷雾或减压冷冻干燥即得ε-聚赖氨酸纯品。
按照申请号为201610190625.8的发明专利《一种ε-聚赖氨酸的制备方法》所述方法进行ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：将ε-聚赖氨酸盐酸盐加入到水中，配制成质量浓度6-10％的ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液，调节ph值，获得ph值9-13的ε-聚赖氨酸盐酸盐水溶液，采用纳滤膜进行一次浓缩，取一次截留液加水稀释并再次采用纳滤膜浓缩，取再次浓缩的截留液重复稀释和浓缩至截留液中无氯离子检出，取最后一次浓缩的截留液再浓缩至ε-聚赖氨酸质量浓度20％以上后进行干燥，获得ε-聚赖氨酸。
实施例2一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法
(1)取生长成熟的链霉菌(保藏号为：cgmccno.3145)的孢子加入生理盐水中，经摇匀，用无菌棉纱过滤以滤掉菌丝，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤1次，得到孢子悬液，孢子悬液所含孢子量为(0.7-1)×108个/ml；
(2)将所述孢子悬液按照接种量1％接入种子培养基中，在温度30℃，摇床振荡培养，220r/min的条件下进行种子培养，待ph降至5.5时，得到种子液；
(3)将所述种子液按照接种量10％，转接至装有发酵培养基的10l机械搅拌式发酵罐中进行发酵，控制发酵温度30℃，初始转速250r/min，溶氧控制在25％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联；当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，流加补料培养基，使残余葡萄糖浓度维持在11g/l；待发酵液ph降至3.5时，自动流加50％氨水使ph维持在3.5；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。
所述补料培养基组成为(g/l)：葡萄糖750，硫酸铵45，ph自然，余量为水。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl最高产量为29.75g/l较原始工艺对比例1提高114％，发酵周期为128h(所述发酵周期仅为发酵时间，种子发酵时间不计算在内，种子发酵时间与对比例发酵时间相比显著缩短到原来的35-60％)，较原始工艺缩短了34.7％。
种子培养基组成(即为m3g培养基)(g/l)组成同实施例1。
发酵培养基组成(g/l)：
葡萄糖60、酵母膏8、(nh4)2so48，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po41.36，mgso4·7h2o0.5，znso4·7h2o0.04，feso4·7h2o0.03，ph7.0，余量为水。
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
实施例3一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法
(1)取生长成熟的链霉菌孢子(保藏号为：cgmccno.3145)加入生理盐水中，经摇匀，用无菌脱脂棉过滤以滤掉菌丝，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤2-3次，得到孢子悬液，孢子悬液所含孢子量为(6-8)×107个/ml；
(2)将所述孢子悬液按照接种量1.5％接入种子培养基中，在温度30℃，摇床振荡培养，220r/min的条件下进行种子培养，待ph降至4.0时，得到种子液；
(3)将所述种子液按照接种量15％，转接至装有发酵培养基的10l机械搅拌式发酵罐中进行发酵，控制发酵温度28℃，初始转速250r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联；当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，流加补料培养基，使残余葡萄糖浓度维持在11g/l；待发酵液ph降至3.0时，自动流加50％氨水使ph维持在3.0；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。
所述补料培养基组成为(g/l)：葡萄糖600，硫酸铵30，ph自然，余量为水。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl最高产量为25.93g/l较原始工艺对比例1提高86.8％，发酵周期为116h(所述发酵周期仅为发酵时间，种子发酵时间不计算在内，种子发酵时间与对比例发酵时间相比显著缩短到原来的35-60％)，较原始工艺缩短了40.8％。
种子培养基组成(即为m3g培养基)(g/l)组成同实施例1。
发酵培养基组成(g/l)：
葡萄糖55、玉米浆15、(nh4)2so45，k2hpo4·3h2o0.8，kh2po41.36，mgso4·7h2o0.5，znso4·7h2o0.04，feso4·7h2o0.03，ph7.0，余量为水。
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
实施例4一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法
(1)取生长成熟的链霉菌孢子(保藏号为：cgmccno.3145)加入生理盐水中，经摇匀，用无菌纱布过滤以滤掉菌丝，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤2-3次，得到孢子悬液，孢子悬液所含孢子量为(4-6)×107个/ml；
(2)将所述孢子悬液按照接种量2％接种至含有50l种子培养基的100l种子罐中，进行发酵罐搅拌培养，于30℃、200r/min的条件下(即协调通风，调整溶氧至30-35％)培养，待ph降至4.5，即可制成种子液。
(3)将所述种子液按照接种量15％，转接至装有发酵培养基的700l机械搅拌式发酵罐中进行发酵，控制发酵温度30℃，初始转速200r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联；当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，流加补料培养基，使残余葡萄糖浓度维持在10g/l；待发酵液ph降至4.5时，自动流加50％氨水使ph维持在4.5；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。
所述补料培养基组成为(g/l)：葡萄糖900，硫酸铵40，ph自然，余量为水。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl最高产量为28.50g/l，较原始工艺(对比例2)提高127％，发酵周期为124h(所述发酵周期仅为发酵时间，种子发酵时间不计算在内，种子发酵时间与对比例发酵时间相比显著缩短到原来的35-60％)，较原始工艺缩短了28％。
种子培养基组成(g/l)：同实施例1组成；
发酵培养基组成(g/l)：同实施例1组成；
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
实施例5一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法
(1)取生长成熟的链霉菌孢子(保藏号为：cgmccno.3145)加入生理盐水中，经摇匀，用无菌棉纱过滤以滤掉菌丝，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤2-3次，得到孢子悬液，孢子悬液所含孢子量为(8-9)×107个/ml；
(2)将所述孢子悬液按照接种量1％接种至含有50l种子培养基的100l种子罐中，进行发酵罐搅拌培养，于30℃、200r/min的条件下(即协调通风，调整溶氧至20-28％)培养，待ph降至5.0，即可制成种子液。
(3)将所述种子液按照接种量10％，转接至装有发酵培养基的700l机械搅拌式发酵罐中进行发酵，控制发酵温度30℃，初始转速200r/min，溶氧控制在35％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联；当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，流加补料培养基，使残余葡萄糖浓度维持在10g/l；待发酵液ph降至3.5时，自动流加50％氨水使ph维持在3.5；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。
所述补料培养基组成为(g/l)：葡萄糖650，硫酸铵35，ph自然，余量为水。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl最高产量为27.85g/l较原始工艺对比例2提高121％，发酵周期为120h(发酵周期仅为发酵时间，种子发酵时间不计算在内，种子发酵时间与对比例发酵时间相比显著缩短到原来的35-60％)，较原始工艺缩短了30.2％。
种子培养基组成(g/l)：同实施例1组成；
发酵培养基组成(g/l)：同实施例2组成；
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
实施例6一种稳定、快速生产ε-聚赖氨酸的方法
(1)取生长成熟的链霉菌孢子(保藏号为：cgmccno.3145)加入生理盐水中，经摇匀，用无菌脱脂棉过滤以滤掉菌丝，再加生理盐水将链霉菌孢子重悬浮，按照上述方法继续过滤2-3次，得到孢子悬液，孢子悬液所含孢子量为(0.8-1)×108个/ml；
(2)将所述孢子悬液按照接种量1％接种至含有50l种子培养基的100l种子罐中，进行发酵罐搅拌培养，于30℃、200r/min的条件下(即协调通风，调整溶氧至25-30％)培养，待ph降至5.5，即可制成种子液。
(3)将所述种子液按照接种量15％，转接至装有发酵培养基的700l机械搅拌式发酵罐中进行发酵，控制发酵温度30℃，初始转速200r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联；当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，流加补料培养基，使残余葡萄糖浓度维持在11g/l；待发酵液ph降至4.5时，自动流加50％氨水使ph维持在4.5；待ε-聚赖氨酸不再增加，结束发酵。
所述补料培养基组成为(g/l)：葡萄糖700，硫酸铵45，ph自然，余量为水。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl最高产量为27.33g/l较原始工艺对比例2提高117.6％，发酵周期为118h(发酵周期仅为发酵时间，种子发酵时间不计算在内，种子发酵时间与对比例发酵时间相比显著缩短到原来的35-60％)，较原始工艺缩短了32％。
种子培养基组成(g/l)：同实施例1组成；
发酵培养基组成(g/l)：同实施例3组成；
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
对比例1常规生产工艺制备ε-聚赖氨酸(10l罐发酵)
(1)取培养好的生长在斜面固体培养基的链霉菌(保藏号为：cgmccno.3145)，从斜面固体培养基上挑取孢子，接入含有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，控制种子培养基中初始孢子量在(0.8-1)×108个，进行摇床振荡培养，于30℃、220r/min的条件下，摇床培养30h，得到种子液。
(2)将培养好的种子液以10％的接种量接入装有发酵培养基的10l机械搅拌式发酵罐中，分两阶段控制：第i阶段，待发酵液ph降至5.9后，控制在ph5.9以利于菌体的增殖；第ii阶段，当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，使ph自然降至4.0，同时自动流加50％氨水使ph维持在4.0，同时流加补料培养基，将发酵液中的葡萄糖浓度控制在10g/l，以利于产物生成，至ε-聚赖氨酸浓度不再增加，结束发酵；发酵过程中，温度控制在30℃，初始转速250r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联。
所述补料培养基组成为(g/l)：同实施例1组成。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl产量为13.88g/l，发酵周期为196h。
其中斜面固体培养基为贝纳特固体培养基(g/l)：同实施例1组成；
m3g培养基(g/l)：同实施例1组成；
发酵培养基(g/l)：同实施例1组成；
(3)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
对比例2常规生产工艺制备ε-聚赖氨酸(700l罐发酵)
(1)取培养好的生长在斜面固体培养基的链霉菌(保藏号为：cgmccno.3145)，从斜面固体培养基上挑取孢子，接入含有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，控制种子培养基中初始孢子量在(0.8-1.2)×108个，于30℃、220r/min的条件下，摇床培养30h，得到摇瓶种子液。
(2)将摇瓶种子液以10％接种量接种至含有50l种子培养基的100l种子罐中，进行发酵罐搅拌培养，于30℃、200r/min的条件下(即协调通风，调整溶氧至30％)培养30h，即可制成一级罐种子液。
(3)将培养好的一级罐种子液以10％的接种量接入装有发酵培养基的700l机械搅拌式发酵罐中，分两阶段控制：第i阶段，待发酵液ph降至5.9后，控制在ph5.9以利于菌体的增殖；第ii阶段，当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，使ph自然降至4.0，然后自动流加50％氨水使ph维持在4.0，同时流补料培养基，将发酵液中的葡萄糖浓度控制在10g/l，以利于产物生成，至ε-聚赖氨酸浓度不再增加，结束发酵；发酵过程中，温度控制在30℃，初始转速250r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联。
所述补料培养基组成为(g/l)：同实施例4组成。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl产量为12.56g/l，发酵周期为172h。
其中斜面固体培养基(g/l)：同实施例1组成；
m3g培养基(g/l)：同实施例1组成；
发酵培养基(g/l)：同实施例1组成；
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
对比例3制备ε-聚赖氨酸(10l罐发酵)
(1)链霉菌孢子悬液的制备同本发明实施例1，得到的孢子悬液所含孢子量为5×107个/ml；(链霉菌保藏号为：cgmccno.3145)
(2)将所述孢子悬液按照接种量2％接入含有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，进行摇床振荡培养，在温度30℃，220r/min的条件下下进行种子培养，摇床培养30h，得到摇瓶种子液。
(3)将培养好的种子液以10％的接种量接入装有发酵培养基的10l机械搅拌式发酵罐中，分两阶段控制：第i阶段，待发酵液ph降至5.9后，控制在ph5.9以利于菌体的增殖；第ii阶段，当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，使ph自然降至4.0，然后自动流加50％氨水使ph维持在4.0，同时流加补料培养基，将发酵液中的葡萄糖浓度控制在10g/l，以利于产物生成；发酵过程中，温度控制在30℃，初始转速250r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联。
所述补料培养基组成为(g/l)：同实施例1组成。
种子培养基(g/l)：同实施例1组成；
发酵培养基(g/l)：同实施例1组成；
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl产量为16.52g/l，发酵周期为192h。
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。
对比例4制备ε-聚赖氨酸(700l罐发酵)
(1)链霉菌孢子悬液的制备同本发明实施例1，得到的孢子悬液所含孢子量为6×107个/ml；(链霉菌保藏号为：cgmccno.3145)
(2)将所述孢子悬液按照接种量2％接种至含有50l种子培养基的100l种子罐中，进行发酵罐搅拌培养，于30℃、200r/min的条件下(即协调通风，调整溶氧至28％-30％)培养30h，即可制成种子液。
(3)将摇瓶种子液以10％接种量接种至含有50l种子培养基的100l种子罐中，于30℃、200r/min的条件下(即协调通风，调整溶氧至28％-30％)培养30h，即可制成一级罐种子液。
(4)将培养好的一级罐种子液以10％的接种量接入装有发酵培养基的700l机械搅拌式发酵罐中，分两阶段控制：第i阶段，待发酵液ph降至6.0后，控制在ph6.0以利于菌体的增殖；第ii阶段，当发酵液中的葡萄糖浓度降至10g/l时，使ph自然降至4.0，然后自动流加50％氨水使ph维持在4.0，同时流补料培养基，将发酵液中的葡萄糖浓度控制在10g/l，以利于产物生成，至ε-聚赖氨酸浓度不再增加，结束发酵；发酵过程中，温度控制在30℃，初始转速250r/min，溶氧控制在30％，维持通风比1-2vvm，搅拌与溶氧关联。
所述补料培养基组成为(g/l)：同实施例4组成。
发酵结束后，经检测发酵液中ε-pl产量为14.56g/l，发酵周期为170h。
其中斜面固体培养基(g/l)：同实施例1组成；
m3g培养基(g/l)：同实施例1组成；
发酵培养基(g/l)：同实施例1组成；
(4)ε-聚赖氨酸或ε-聚赖氨酸纯品或ε-聚赖氨酸盐酸盐的制备：同实施例1。