本发明涉及一种钩藤属植物鉴定方法，更具体地，涉及一种基于its序列和机器学习鉴定钩藤属植物的方法。
背景技术：
钩藤为茜草科钩藤属植物，主要分布在广西、贵州、云南等西南地区。《中国药典》2015年版规定钩藤为茜草科植物一般钩藤uncariarhynchophulla(miq)jack.、大叶钩藤u.macrophyllawall.、华钩藤u.sinensis(oliv)havil.、u.hirsutehavil.和无柄果钩藤u.sessilifructusroxb.五种药材。钩藤是中医常用药，药用历史悠久，具有息风定惊，清热平肝的功效。
钩藤因具有较高的药用价值和应用前景而受到广泛关注，对钩藤植物化学成分的分析报道层出不穷，但对其鉴定方面的研究较少。目前，中药钩藤的分类鉴定主要依据形态学、组织学和化学成分分析等方法。但钩藤各品种间外形相似，而不同种钩藤的药效成分具有明显差别，加之某些地区的品种面临濒危，导致市场上销售的钩藤种类较为混乱，出现互混、互代、以次充好等现象，影响用药的安全性和有效性。单靠药材性状、化学组分分析不能全面、科学地鉴定与评估钩藤药材的质量。因此，需要一种能够对钩藤属植物进行更精确、更快速的鉴定方法。
已有利用its区序列对侯钩藤进行鉴定的报道，报道中确定了7个变异位点作为鉴定侯钩藤的位点，但其必须满足至少两个位点的条件才能鉴定为侯钩藤，但当某个物种某个位点发生突变，无法满足多个位点同时存在的条件，就可能导致鉴定失败；另有利用its区序列鉴定11个钩藤属物种(一般钩藤、华钩藤、大叶钩藤、鹰爪风、攀茎钩藤、北越钩藤、毛钩藤、倒挂钩藤、白钩藤、平滑钩藤、云南钩藤)的报道，报道中使用relp(restrictionfragmentlengthpolymorphism)法确定并比较了45个位点作为鉴定10个钩藤属植物(鹰爪风除外)的位点，分别列举了2-7个单一位点来鉴定10个钩藤属物种，鉴定具体的物种仅需满足2-7个位点中的其中一个位点，但该报道所找的用于鉴别钩藤属物种的位点并不都是特异位点，可能导致鉴定失败。以上两个报道的共同点为：鉴定位点需人工从众多位点中逐个筛选，费时费力，且可能面临鉴定失败的情况，无法满足快速、准确、特异性鉴定钩藤属植物的要求。
机器学习是近20多年兴起的一门多领域交叉学科，为了充分且有效地利用生物学数据，生物学与机器学习的交叉研究日益活跃。目前，国内外尚未有将its序列和机器学习相结合用于钩藤属植物鉴定的报道。
技术实现要素：
为了克服已有技术的不足，本发明的目的在于提供一种结合its序列与机器学习的方法来准确、快速、特异地鉴定钩藤属物种。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种基于its序列和机器学习的钩藤属植物鉴定方法，包括如下步骤：
s1：数据的获取和数据集的建立
获取钩藤属植物的its区序列，并进行比对，切除引物端后，去除中间存在高变的插入或缺失的序列，得到用于机器学习的数据集。
具体地，上述s1中，its区序列一部分来自于实验获取，物种是一般钩藤、华钩藤、毛钩藤、白钩藤、大叶钩藤、侯钩藤、北越钩藤，通过分子生物学实验及测序获得该7个钩藤属物种的its区序列，具体包括如下步骤：
s11.以改良的ctab法，提取7个待测物种样品的总dna；
优选地，上述待测样品为新鲜采集的茜草科钩藤属植物的叶片，待测叶片先经过预处理后才进行dna的提取，所述预处理是将叶片浸泡于75％乙醇溶液中，5min后取出放置于无菌环境中风干，然后再液氮冷却的条件下研磨至粉末，该粉末即为待测样品。
s12.以7个待测物种样品的总dna为模板，利用引物its5和its4进行pcr扩增得到钩藤属植物的its区序列；上述引物its5和its4是针对钩藤属植物而设计的专用引物，其中，引物its4的核苷酸序列如seqidno:1所示，its5的核苷酸序列如seqidno:2所示。
seqno.1:tcctccgcttattgatatgc20
seqno.2:ggaagtaaaagtcgtaacaagg22
优选地，pcr扩增反应体系总体积为20μl，该反应体系包含2.5mmol/l10×pcrbuffer(含mgcl2)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10μmol/l引物its40.8μl，10μmol/l引物its50.8μl，5u/μlhifidna聚合酶0.1μl，加入dna模板50ng，其余体积用无菌水补足。
优选地，所述pcr扩增反应过程为：95℃预变性3min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
具体地，上述s1中，its区序列一部分来自于genbank，物种是一般钩藤、华钩藤、毛钩藤、白钩藤、大叶钩藤、北越钩藤、平滑钩藤、倒挂钩藤、攀茎钩藤、云南钩藤。
进一步地，将实验获得的its区序列与从genbank下载的its区序列合为一个文件，所用比对软件采用mega(版本7.0)软件。
s2：利用机器学习提取鉴定钩藤属物种的核苷酸特征
将步骤1得到的数据集以barcodingwithlogic作为机器学习进行100次-1000次迭代计算，得到鉴定钩藤属植物的核苷酸特征。
进一步地，以barcodingwithlogic作为机器学习方法，是将s1得到的数据集随机分成训练集和测试集，其中训练集占总集合的90％，测试集占总集合的10％，进行1000次迭代计算。
s3：11个钩藤属植物的鉴定
鉴定11个钩藤属植物的特异核苷酸位点，具体标准是：
若第486位碱基为g，则鉴定为平滑钩藤u.laevigata；
若第497位碱基为t，则鉴定为华钩藤u.sinensis；
若第631为碱基为a，则鉴定为云南钩藤u.yunnanensis；
若第589位碱基为t，则鉴定为侯钩藤u.rhynchophylloides；
若第118位碱基为t，则鉴定为一般钩藤u.rhynchophylla；
若第608位碱基为t，则鉴定为北越钩藤u.homomllla；
若第468位碱基为c，则鉴定为毛钩藤u.hirsuta；
若第651位碱基为a，则鉴定为白钩藤u.sessilifructus；
若第574位碱基为c，则鉴定为大叶钩藤u.macrophylla；
若第485位碱基为c且第589位碱基为c，则鉴定为倒挂钩藤u.lancifolia；
若第482位碱基为t，则鉴定为攀茎钩藤u.scandens。
上述核苷酸位点为鉴定钩藤属物种的特异位点(species-specificpositions)。第486位碱基g是平滑钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有平滑钩藤在该位点未发生变异；第497位碱基t是华钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有华钩藤在该位点未发生变异；第631位碱基a是云南钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有云南钩藤在该位点未发生种内变异；第589位碱基t是侯钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有侯钩藤在该位点未发生变异；第118位碱基t是一般钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有一般钩藤在该位点未发生变异；第608位碱基t是北越钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有北越钩藤在该位点未发生变异；第468位碱基c是毛钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有毛钩藤在该位点未发生变异；第651位碱基a是白钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有白钩藤在该位点未发生变异；第574位碱基c是大叶钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有大叶钩藤在该位点未发生变异；第482位碱基t是攀茎钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，所有攀茎钩藤在该位点未发生变异；第485位碱基c和第589位碱基c不是倒挂钩藤区别于另外10个物种的特异碱基，但这两个位点结合可以鉴别倒挂钩藤，所有倒挂钩藤在这两个位点未发生变异。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
本发明首次将its序列与机器学习相结合的方法用于钩藤属植物的鉴定，得到了鉴定11个钩藤属植物的核苷酸位点，这些核苷酸位点是鉴定11个钩藤属物种的特异位点，可以实现仅由1-2个位点分别对11个钩藤属植物进行快速、准确、特异性地鉴定。该方法无需进行人工筛选鉴定位点，就可以快速、准确、特异性地从众多位点中筛选出鉴定11个钩藤属物种的特异位点，说明its序列与机器学习结合的方法用于鉴定钩藤属植物的结果是可靠的。本发明弥补了基于形态学等传统鉴定方法以及仅基于dna条形码的分子鉴定的局限性，填补了将生物学信息与机器学习结合鉴定钩藤属植物的空白，为物种鉴定、分类和物种检测提供了重要的核苷酸信息，也为中药钩藤的规范用药、安全用药提供了必要保证。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例17个钩藤属植物its区序列的获得
1、样品dna的提取
(1)待测样品：从不同地区采集多份钩藤属植物共39份样品，如表1所示。
表17个钩藤属物种样品采集地点
(2)按照下述方法分别对表1的钩藤属植物样品进行dna的提取
1)将待测样品浸泡在75％乙醇中5min，取出，放置在无菌环境中自然风干；
2)取2g待测样品，加液氮研磨至粉末状，置于10ml离心管中，然后加入65℃预热的3×ctab提取液5ml，混匀后65℃水浴2h，期间每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述3×ctab提取液配方为：4％ctab，0.1mol/ltris-hcl，1.4mol/lnacl，2％pvpp，25mmol/ledta，高温高压灭菌；其中2％β-巯基乙醇于灭菌、冷却后加入；体系中的“％”代表体积分数；
3)水浴结束后，12000rpm离心5min，取上清分装至1.5ml离心管，加等体积tris饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，混匀后12000rpm离心10min；
4)取上清液至新1.5ml离心管，加等体积氯仿-异戊醇(24:1)，混匀后12000rpm离心10min；
5)取上清液至新1.5ml离心管，加0.6倍体积异丙醇，再加3mol/l醋酸钠至终浓度为0.3mol/l，-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min；
6)弃上清液，用1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min；
7)弃上清液，重复洗涤2-3次；
8)洗涤完毕后，风干沉淀，加100μl无菌水或1×te溶液进行溶解，置于-20℃保存，得到待测样品的dna。
2、its区序列片段的扩增
(1)引物its5和its4的序列如下所示
引物its5(如seqidno.1所示)：5’ggaagtaaaagtcgtaacaagg3’
引物its4(如seqidno.2所示)：5’tcctccgcttattgaataatgc3’
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(2)pcr反应体系：在20μl体系含有2.5mmol/l10×pcrbuffer(含mgcl2)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10μmol/l引物its40.8μl，10μmol/l引物its50.8μl，5u/μlhifidna聚合酶0.1μl，加入dna模板50ng，其余体积用无菌水补足。
3、pcr产物纯化、链接及转化
pcr扩增产物采用dna凝胶回收试剂盒(takaraminibestagarosegeldnaextractionkit)进行割胶回收。钩藤its序列的pcr扩增产物从1％的琼脂凝胶中割胶纯化。纯化产物连接到pmd18-t-vecter(takara)，连接产物转化到escherichiacolijm109感受态细胞，进行氨苄青霉素选择。
4、its区序列测定
挑取单克隆菌落送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序，测序引物与上述pcr引物一致。
5、its区序列分析
(1)选取我国常见的10种钩藤属药用植物，包括一般钩藤(uncariarhynchophylla)、华钩藤(u.sinensis)、毛钩藤(u.hirsuta)、白钩藤(u.sessilifructus)、大叶钩藤(u.macrophylla)、北越钩藤(u.homomalla)、平滑钩藤(u.laevigata)、倒挂钩藤(u.lancifolia)、攀茎钩藤(u.scandens)、云南钩藤(u.yunnanensis)共10种，并在ncbi数据库上查询和下载其its区序列的fasta格式文件，共97条序列，见表2。
表2从genbank下载的钩藤属植物its序列
(2)根据测序结果可知，18条一般钩藤序列存在7个位点的差异，4条华钩藤序列存在3个位点的差异，3条毛钩藤序列完全相同，5条白钩藤序列存在5个位点的差异，5条大叶钩藤序列存在2个位点的差异，3条侯钩藤序列存在一个位点的差异(经过研究验证显示，下述鉴别11个钩藤属植物的位点均不存在种内差异)。实验获取的序列已上传至ncbi，genbank登录号为mf033267-mf033305。
(3)将实验获得的its区序列和从genbank下载的its区序列，一起导入mega(版本7.0)软件进行比对，切除引物端后，去除中间存在高变的插入或缺失的序列，得到用于机器学习的数据集。
(4)以barcodingwithlogic作为机器学习方法，将数据集随机分成训练集和测试集，其中训练集占总集合的90％，测试集占总集合的10％，进行1000次迭代计算，获得鉴定钩藤属植物的特异核苷酸位点。
6、11个钩藤属植物的鉴定
根据机器学习结果可知，训练集和测试集对11个钩藤属物种的鉴定成功率均为100％。鉴定11个钩藤属植物的特异核苷酸位点，具体标准是：
若第486位碱基为g，则鉴定为平滑钩藤u.laevigata；
若第497位碱基为t，则鉴定为华钩藤u.sinensis；
若第631为碱基为a，则鉴定为云南钩藤u.yunnanensis；
若第589位碱基为t，则鉴定为侯钩藤u.rhynchophylloides；
若第118位碱基为t，则鉴定为一般钩藤u.rhynchophylla；
若第608位碱基为t，则鉴定为北越钩藤u.homomllla；
若第468位碱基为c，则鉴定为毛钩藤u.hirsuta；
若第651位碱基为a，则鉴定为白钩藤u.sessilifructus；
若第574位碱基为c，则鉴定为大叶钩藤u.macrophylla；
若第485位碱基为c且第589位碱基为c，则鉴定为倒挂钩藤u.lancifolia；
若第482位碱基为t，则鉴定为攀茎钩藤u.scandens。
实施例2：白钩藤、大叶钩藤、北越钩藤、平滑钩藤的鉴定试验
1、基因组dna的提取
从不同产地收集多份根据形态分别鉴定为白钩藤、大叶钩藤、北越钩藤、平滑钩藤的样品，如表3所示：
表34个钩藤属物种样品采集地点
分别按照下述方法进行鉴定：
步骤1：
将待测样品浸泡在75％乙醇中5min，取出，放置在无菌环境中自然风干，取2g待测样品，加液氮研磨至粉末状，置于10ml离心管中，然后加入65℃预热的3×ctab提取液5ml，混匀后65℃水浴2h，期间每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述3×ctab提取液配方为：4％ctab，0.1mol/ltris-hcl，1.4mol/lnacl，2％pvpp，25mmol/ledta，高温高压灭菌；其中2％β-巯基乙醇于灭菌、冷却后加入；体系中的“％”代表体积分数。
水浴结束后，12000rpm离心5min，取上清分装至1.5ml离心管，加等体积tris饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，混匀后12000rpm离心10min，取上清液至新1.5ml离心管，加等体积氯仿-异戊醇(24:1)，混匀后12000rpm离心10min。
取上清液至新1.5ml离心管，加0.6倍体积异丙醇，再加3mol/l醋酸钠至终浓度为0.3mol/l，-20℃沉淀1h，12000rpm离心10min，弃上清液，用1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，弃上清液，重复洗涤2-3次，洗涤完毕后，风干沉淀，加100μl无菌水或1×te溶液进行溶解，置于-20℃保存，得到待测样品的dna。
步骤2：
以步骤1提取的dna为模板，用引物its4和its5进行pcr扩增。
pcr反应体系：在20μl体系含有2.5mmol/l10×pcrbuffer(含mgcl2)2μl，2.5mmol/ldntp1.6μl，10μmol/l引物its40.8μl，10μmol/l引物its50.8μl，5u/μlhifidna聚合酶0.1μl，加入dna模板50ng，其余体积用无菌水补足。
pcr扩增反应过程：95℃预变性3min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
采用takara的pcr产物回收试剂盒纯化税收扩增产物并送交测序。
步骤3：
将步骤2获得的序列和从genbank下载的序列一起导入mega(版本7.0)软件进行比对，切除引物端后，去除中间存在高变的插入或缺失的序列。其中，将步骤2得到作为测试集，将从genbank下载的序列作为训练集，以barcodingwithlogic作为机器学习方法，进行1000次迭代计算，获得鉴定钩藤属植物的特异核苷酸位点。
根据机器学习结果可知，训练集的鉴定成功率为100％，从训练集中获取的鉴别钩藤属植物的核苷酸规则如下：
若第486位碱基为g，则鉴定为平滑钩藤u.laevigata；
若第497位碱基为t，则鉴定为华钩藤u.sinensis；
若第631为碱基为a，则鉴定为云南钩藤u.yunnanensis；
若第589位碱基为t，则鉴定为侯钩藤u.rhynchophylloides；
若第118位碱基为t，则鉴定为一般钩藤u.rhynchophylla；
若第608位碱基为t，则鉴定为北越钩藤u.homomllla；
若第468位碱基为c，则鉴定为毛钩藤u.hirsuta；
若第651位碱基为a，则鉴定为白钩藤u.sessilifructus；
若第574位碱基为c，则鉴定为大叶钩藤u.macrophylla；
若第485位碱基为c且第589位碱基为c，则鉴定为倒挂钩藤u.lancifolia；
若第482位碱基为t，则鉴定为攀茎钩藤u.scandens。
根据机器学习结果可知，测试集的鉴定成功率为100％，说明训练集生成的核苷酸规则适用于测试集，4个钩藤属待测物种得到了准确的鉴定。
本发明上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。