一种防治西瓜枯萎病的木霉菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物菌种技术领域，特别是指一种防治西瓜枯萎病的木霉菌及其应用。

背景技术：

近年来，由于化学农药的公害问题日趋严重，生物防治因其具有无污染、无残留、对生态环境和人类健康较安全等优点而日益受到人们重视，其中拮抗微生物在植物病害生物防治中的应用备受关注。木霉菌是众多拮抗微生物中最具有竞争力的生防菌之一，是自然界中广泛存在的一类丝状真菌，具有适应性强、产生的拮抗物多、寄生性广及对环境影响小等诸多特点，在植病生防中的应用潜力日趋重视，并且不断有所突破。

西瓜枯萎病称死秧病、麦割病、萎凋病，是由西瓜专化型尖孢镰刀菌(fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染所引起的土传性病害。西瓜整个生育期都会受到枯萎病的危害，可造成西瓜产量下降甚至绝产，随着西瓜种植面积的扩大，西瓜重茬也不断增加了西瓜枯萎病的发生。目前国内外针对西瓜枯萎病的防治没有特别有效的办法，所以称枯萎病是西瓜生产中的癌症。采用其它多种方法效果也不够理想，或者成本高、技术要求严格或者投入大效果不明显污染严重。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种防治西瓜枯萎病的木霉菌及其应用，用于抑制西瓜枯萎病。

基于上述目的本发明提供的一种木霉菌，所述木霉菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno.m2019337。

可选的，所述木霉菌的筛选方法包括如下步骤：

从西瓜种植田间的作物根部取土壤，加入无菌水进行稀释，然后将稀释液涂布在pda分离平板上，培养成可见单菌落后，再将单菌落挑出，重复涂布培养，重复3～5次，筛选出抗病原始菌株；

将抗病原始菌株使用40～60kev的高能射线进行诱变，诱变菌种进行pda培养基的摇瓶培养，培养得到成熟孢子，再涂布到pda平板上培养，取涂布菌种的平板，放置在恒温培养箱中，培养箱里放置活度为40mci的放射源锶90进行辐照诱变培养，5～7天取出平板，跳出单菌落进行摇瓶发酵，得到菌株。

可选的，所述木霉菌的菌丝呈卷毛状，菌落开始为致密的白色至灰色圆形状，向四周发散，产孢区起初呈颗粒或粉状，颜色由淡绿色转为深绿色，菌丝白色或灰色，整个菌落直径可达到5cm。

可选的，所述木霉菌的菌落生长的ph为5.0～8.0，温度为26～50℃。

可选的，所述木霉菌可用于制备防治西瓜枯萎病的微胶囊粉颗粒。

可选的，所述微胶囊粉颗粒制备方法包括如下步骤：

木霉菌孢子液的制备，挑选出成熟的木霉孢子，接种到pad液体培养基中进摇床培养，得到种子液；

将种子液依次经过一级种子扩大培养和二级罐培养后，降温至不高于10℃，向发酵罐里添加硅藻土得到含有硅藻土和菌体孢子的悬浮液，再把悬浮液与玉米淀粉或葡萄糖或海藻酸钾通过低温真空喷射造粒技术制作成微胶囊颗粒。

可选的，所述微胶囊粉颗粒有效活菌数为2亿cfu/ml。

可选的，所述微胶囊粉颗粒的粒径为100～200μm。

一种木霉菌的应用，主要应用于对西瓜枯萎病的防治。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种木霉菌，从安徽怀远县西瓜种植田间土壤中分离、筛选，经射线诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年5月23日，保藏编号：cctccno.m2019337。本发明获得木霉菌产生分生孢子和厚垣孢子均较为丰富，菌株适应性能力非常强大，孢子在pda平板培养基上26℃即可复活萌发，菌落生长迅速，培养40h后菌落直径就可达到3cm～4cm；培养至72h以后，菌落能够布满整个平板，菌丝呈不规则的网格状互相交错；菌落在培养基平板上生长快，菌丝层细密厚实。提取本发明菌株的菌株核糖体its基因区段进行鉴定、检测，再使用通用引物its1/its4进行pcr扩增，获得扩增片段并测序，该序列经过详细比对结果表明本发明菌株属为木霉菌。

本发明菌株对西瓜枯萎病防治效果较为明显，既有较强的抗病抑菌抗重茬效果，同时对西瓜产量和口感的提升均有较为明显的特性。既可以改良土壤降低化肥农药使用量，又能降低农民投入和增多农民收入，对环境污染治理方面有起到积极作用。

附图说明

图1为本发明实施例菌株核糖体its基因区段pcr产物凝胶电泳图。

具体实施方式

为下面通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

为了解决现有技术中全部或者部分不足，本发明提供的一种木霉菌，从安徽怀远县西瓜种植田间土壤中分离、筛选，经射线诱变获得，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2019年5月23日，保藏编号：cctccno.m2019337，保藏生物分类名称：哈茨木霉(trichodermaharzianum)。提取本发明菌株的菌株核糖体its基因区段进行鉴定、检测，再使用通用引物its1/its4进行pcr扩增，获得扩增片段并测序，该序列经过详细比对结果表明本发明菌株属为木霉菌。上述鉴定、检测过程均有生工生物工程(上海)股份有限公司进行。

本发明菌株对西瓜枯萎病防治效果较为明显，既有较强的抗病抑菌抗重茬效果，同时对西瓜产量和口感的提升均有较为明显的特性。既可以改良土壤降低化肥农药使用量，又能降低农民投入和增多农民收入，对环境污染治理方面有起到积极作用。

具体的，本发明实施例提供的一种木霉菌分离提取包括如下步骤：霉菌纯种分离技术

安徽怀远县西瓜种植田间取得土壤称取少许后，加入无菌水进行系列稀释(10^-7倍)，涂布在pda分离平板上，经过一段时间的培养成可见单菌落后，再降单菌落挑出重复涂布培养，以上操作重复3～5次，筛选出抗病原始菌株。

木霉菌的高能离子束和放射线诱变，取5～10块含木霉菌菌落的培养平板使用40～60kev的高能射线放置1h进行诱变后，进行pda培养基的摇瓶培养，培养3天后得到成熟孢子，再涂布到pda平板上培养，取10块涂布菌种的平板，放置在恒温培养箱中，培养箱里放置活度为40mci的放射源锶90(编号：ru15sy000155-038)进行辐照诱变培养，一周后取出所有平板，跳出单菌落进行摇瓶发酵，得到优质菌株。

获得的木霉菌在pda培养基上生长，产生菌丝呈卷毛状，菌落开始为致密的白色至灰色圆形状，向四周发散，产孢区起初呈颗粒或粉状，颜色由淡绿色转为深绿色，菌丝白色或灰色，整个菌落直径可达到5cm，产生分生孢子和厚垣孢子均较为丰富。本发明所述的菌株适应性能力非常强大，孢子在pda平板培养基上26℃即可复活萌发，菌落生长迅速，培养40h后菌落直径就可达到3cm～4cm，；培养至72h以后，菌落能够布满整个平板，菌落生长的酸碱度在5.0～8.0，但是ph＝6.5的时候生长最优。

通过普通光学显微镜观察，可以看到菌丝呈不规则的网格状互相交错；菌落在培养基平板上生长快，菌丝层细密厚实，随着孢子的生成色泽由白色逐渐变为绿色或深绿色。电镜观察孢子光滑平坦。在培养箱里培养15天后发现菌落呈黑绿色，平板反面观察呈深绿色，孢子环状布局梗丛稀松。

本发明实施例获得的木霉菌菌株可产多种生物活性酶，比如几丁质酶、纤维素酶、蛋白水解酶、葡聚糖酶、果胶酶等。提取本发明菌株的菌株核糖体its基因区段进行鉴定、检测，再使用通用引物its1/its4进行pcr扩增，获得扩增片段并测序，该序列经过详细比对结果表明本发明菌株属为木霉菌。电泳检测条带如图1所示，相似度达到99％。

本发明实施例木霉菌可用于制备防治西瓜枯萎病的微胶囊粉颗粒，具体的制备步骤如下：

木霉菌孢子液的制备，从pda培养基平板中挑选培养成熟木霉孢子后，接入到250ml的pda液体三角瓶中进行摇瓶培养，作为种子液等待使用；

使用50l全自动发酵罐做为一级种子扩大培养，则一级培养条件是，葡萄糖500g、硫酸铵100g、kh2po410g、酵母粉100g、土豆泥500g、硫酸镁20g、vh0.05g、消泡剂微量；ph5.5～7.5、搅拌转速100～500r/min、通气量0～0.5l/h、p＝0.05mpa、t＝25～32℃，培养周期38h后，通过镜检无染杂菌后转接入到500m3的灭菌降温待发酵的二级罐；

二级罐培养条件如下，土豆泥5kg、葡萄糖500g、糖蜜液5l、豆粕粉2kg(100目以上)、kh2po41kg、消泡剂100ml；ph5.5～7.5、搅拌转速100～500r/min、通气量0～100l/h、p＝0.05mpa、t＝25～32℃，培养周期48h后，通过镜检观察和化学检测，结果符合：无污染、总糖含量＜0.1、菌丝呈粗壮墨绿色，产生大量均匀分布的孢子的时候，停止发酵，降温至10℃以下待用；

微胶囊颗粒的制备，向发酵罐里添加10kg～200kg的硅藻土得到含有硅藻土和菌体孢子的悬浮液，再把该悬浮液与玉米淀粉或葡萄糖或海藻酸钾通过低温真空喷射造粒技术制作成小于200μm的微胶囊颗粒，外观绿色粉末状，根际发酵终点检测发酵指数为20亿cfu/ml；制成的微胶囊颗粒的有效活菌数为2亿cfu/ml。

本发明实施例还提供一种木霉菌在防治西瓜枯萎病的应用，具体步骤如下，

在安徽省怀远县有西瓜枯萎病发病症状的田间土壤中进行。试验设不使用任何药剂的对照(ck)和4种药剂处理：(1)不使用任何药剂的土壤(ck)，(2)2亿cfu/g枯草芽孢杆菌微囊粒剂300倍液，(3)2亿cfu/g木霉菌微囊粒剂300倍液，(4)2亿cfu/g芽孢杆菌微囊粒剂和2亿cfu/g木霉菌微囊粒剂复配300倍液，随机排列，每个处理2次重复。各处理区施药均使用量杯每株灌根500ml，自第一次施药的7d后按相同方法和药量进行第二次施药，(5)使用嘧菌酯处理试验区周边西瓜苗土壤做化学药剂对照，其它常规管理。

预防效果测定，发现西瓜田里面已经开始爆发枯萎病后，开始第一次施药前(5月18日)和第二次施药后的第20d(6月14日)时观察并记录各处理区西瓜的发病情况，并参照王汉荣方法，病害分级标准：0级：无病症；1级：1片或2片子叶轻微发黄，但生长正常；2级：1～2片叶片黄化或1片子叶出现坏死斑，真叶稍变黄，出现轻微萎蔫；3级：子叶全部枯死，真叶明显萎蔫，生长受阻；4级：全株严重萎蔫或死亡。根据调查结果并按照以下公式计算病情指数、发病率、防治效果。

发病率＝病株数/调查总株数×100％

病情指数＝[∑(各级病株数×相应级数)/(调查总植株数×最高级数)]×100％

防治效果＝[(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数]×100％

西瓜主要生长指标的测定

试验结束后测定各处理区西瓜植株主蔓长度、主蔓直径、叶面纵径、叶面横径、坐果数。每处理随机抽取3株，利用卷尺测定主蔓长度、叶面纵径、叶面横径，利用游标卡尺测定主蔓直径。主蔓长度为子叶到主蔓顶端的长度。主蔓直径为主蔓第十节间中间部位直径。

数据分析

表1不同药剂对西瓜枯萎病的防效

试验结果表明.使用枯草芽孢杆菌300倍液、木霉菌300倍液以及两种制剂的复配药剂500ml对西瓜灌根20d后，西瓜植株枯萎病发病率均比施药前减小，并且每个处理发病率都明显低于空白对照的防治效果(表1)。枯草芽孢杆菌、木霉菌以及枯草芽孢杆菌和木霉菌的复配试验药剂300倍液病情指数分别为10.78、8.14、9.62。空白对照处理区的病情指数为16.49，三种菌剂处理的病情指数明显低于对照处理组。木霉菌微胶囊粉颗粒处理的防效最高，达到50.64％，其次是复合菌种，枯草芽孢杆菌在三种菌剂处理中防效最低，但对西瓜枯萎病也表现出了较好的防治效果。总体来说三种菌剂对西瓜枯萎病防治均有较好的效果，2次施药后均控制住了西瓜枯萎病菌的危害。说明木霉菌对西瓜具有很好的防治作用，特别是治疗作用显著。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。