本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法。
背景技术：
寡聚透明质酸钠是由透明质酸降解制备的一种分子量极低的透明质酸钠分子片段，并且是人体内一种固有的成份，具有较强的皮肤渗透性，可渗透到皮肤角质层；同时具有全方位保湿性和抗衰老性，在化妆品领域具有广泛的应用性。而注射剂寡聚透明质酸钠相较于透明质酸钠更易被吸收，可用于注射修复骨关节创伤和除皱等。
内毒素是革兰氏阴性菌释放的一种物质，且人体对内毒素极为敏感，内毒素可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。因此，如何取出内毒素，成为当前亟待解决的问题。现有的去除内毒素的方法主要是液相分离法、活性炭吸附法、季铵盐类药品去除法、超滤法，但这些去除内毒素的方法存在处理不彻底、时间长和成本高等问题。
液相分离法利用一些去污剂，如triton-114，脱氧胆酸钠能够和内毒素的脂质部分结合通过萃取的方法去除内毒素，但是去除后的产品中会有去污剂残留，不符合寡聚透明质酸钠医用级质量要求。活性炭利用空隙吸附杂质，同时去除内毒素，但是由于孔径限制，一般寡聚透明质酸中内毒素去除效果在0.5eu/mg，比医用级标准0.05eu/mg大十倍，无法达到医用级的质量要求。季铵盐类物质比如氯化十六烷基吡啶（cpc）与寡聚透明质酸钠相结合形成螯合物，通过洗涤螯合物去除杂质，然后解离出cpc与寡聚透明质酸钠，通过醇沉洗涤去除cpc，得到寡聚透明质酸钠，此方法质量可靠稳定，但是步骤繁琐，氯化钠、酒精用量比较大，成本高。超滤法为比较常用的一种去除内毒素的方法，但是内毒素与寡聚透明质酸钠均为脂多糖，且分子量类似，因此超滤法无法去除寡聚透明质酸中的杂质包括内毒素。因此，迫切需要提供一种简便、处理彻底、成本低地去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题，是提供一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法。本发明利用一定浓度的氢氧化钠可以改变内毒素的分子结构使其失去活性，采用氢氧化钠去除寡聚透明质酸钠中的内毒素。本发明提供的方法处理彻底、步骤简单、成本低廉，且处理后的内毒素含量达到医用级标准（小于0.05eu/mg）。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）原料内毒素限度检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量，当内毒素含量为所要求范围时，进入步骤（2）；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶于水中，浓度为1%~10%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）向上述寡聚透明质酸钠溶液中分别加入氢氧化钠固体和氯化钠固体，使氢氧化钠的最终浓度为0.5%~5%，氯化钠的最终浓度为3%~6%，室温搅拌1~8小时，得到溶液a；
（4）调节溶液a的ph至中性，得到溶液b；
（5）向溶液b中加入乙醇沉淀，脱水，干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
本发明步骤（4）中，调节溶液ph至中性是因为有利于后期寡聚透明质酸钠固体成品的ph值符合质量指标。
上述的方法，优选的，所述步骤（1）中，内毒素含量所要求范围为不大于5eu/mg。本发明步骤（1）中，先进行内毒素检测是因为当原料寡聚透明质酸钠粉末中内毒素含量大于5eu/mg时，采用此方法后期较难去除内毒素。
上述的方法，优选的，所述步骤（4）与步骤（5）之间设有步骤（4-1）内毒素限度检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠溶液中的内毒素含量，当内毒素含量小于0.05eu/mg时进入步骤（5）。内毒素再检测合格则进入下一步骤，不合格则乙醇沉淀后过滤重复步骤（3）-（4），直至合格为止。
上述的方法，优选的，所述步骤（2）中，将寡聚透明质酸钠粉末溶解于经检验符合内毒素检测标准的注射水中。利用符合内毒素检测标准的注射水可以减少溶剂（水）带来的内毒素污染。
上述的方法，优选的，所述方法中所有与寡聚透明质酸钠有接触的器具用0.5%~5%氢氧化钠溶液浸泡1~20小时，然后用注射水淋洗至ph中性。
上述的方法，优选的，所述步骤（4）中，采用冰醋酸调节溶液ph至中性。冰醋酸属于弱酸，不会对寡聚透明质酸钠成品的质量指标产生影响。如果利用盐酸调节，会增加寡聚透明质酸钠质量指标中氯化物含量；利用硫酸调节会增加质量指标中炽灼残渣质量指标。
上述的方法，优选的，所述步骤（5）中，加入7~11倍体积95%乙醇沉淀，3~5次脱水至酒精度数达到90%，40℃~65℃真空干燥。相对于其他溶剂，乙醇属于常用有机溶剂，且价格较便宜，易回收有利于成本控制，且寡聚透明质酸钠成品中几乎无乙醇残留。
本发明的有益效果：
本发明方法中，氢氧化钠用于去除内毒素，氯化钠为乙醇沉淀创造条件。氢氧化钠的最终浓度选用0.5%~5%，是因为氢氧化钠浓度过低无法有效去除内毒素，浓度过高则会使后期的寡聚透明质酸钠粉末呈现黄色。氯化钠的最终浓度选用3%~6%，是因为氯化钠浓度过低对于乙醇沉淀不利，浓度过高则氯化物质量指标会不合格。
本发明方法中直接添加氢氧化钠固体和氯化钠固体形式，相比于添加氢氧化钠和氯化钠溶液形式，不仅减少配制溶液的操作过程，而且减少了溶液占的体积，节约了后期沉淀时的乙醇用量。本发明中寡聚透明质酸钠分子量在1万道尔顿以下，氢氧化钠对寡聚透明质酸钠几乎没有破坏性作用。
综上所述，本发明中的内毒素去除方法成本低、时间较短、去除彻底、污染的风险较低。利用本发明的方法可有效地去除寡聚透明质酸钠中的内毒素，处理后的内毒素含量达到医用级标准（小于0.05eu/mg）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
实施例1
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）内毒素检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量小于5eu/mg；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶解于一定体积的经检验符合内毒素检测标准的注射水中，浓度为8%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为0.5%，氯化钠最终浓度为5%，室温搅拌8小时；
（4）冰醋酸调溶液ph至中性；
（4-1）内毒素再检测：溶液取样，使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠溶液的内毒素含量，当内毒素含量小于0.05eu/mg时，进入步骤（5），如果内毒素含量不小于0.05eu/mg，则重复步骤（3）、（4）；
（5）加入7倍体积95%乙醇沉淀，3次脱水至酒精度数达到90%，55℃真空干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
实施例2
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）内毒素检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量小于5eu/mg；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶解于一定体积的经检验符合内毒素检测标准的注射水中，浓度为10%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为0.5%，氯化钠最终浓度为5%，室温搅拌8小时；
（4）冰醋酸调溶液ph至中性；
（4-1）内毒素再检测：溶液取样，使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠溶液的内毒素含量小于0.05eu/mg时，进入步骤（5），如果内毒素含量不小于0.05eu/mg，则重复步骤（3）、（4）；；
（5）加入11倍体积95%乙醇沉淀，4次脱水至酒精度数达到90%，40℃真空干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
实施例3
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）内毒素检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量小于5eu/mg；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶解于一定体积的经检验符合内毒素检测标准的注射水中，浓度为10%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为5%，氯化钠最终浓度为5%，室温搅拌8小时；
（4）冰醋酸调溶液ph至中性；
（4-1）内毒素再检测：溶液取样，使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠溶液的内毒素含量，当内毒素含量小于0.05eu/mg时，进入步骤（5），如果内毒素含量不小于0.05eu/mg，则重复步骤（3）、（4）；；
（5）加入9倍体积95%乙醇沉淀，5次脱水至酒精度数达到90%，65℃真空干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
实施例4
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）内毒素检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量小于5eu/mg；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶解于一定体积的经检验符合内毒素检测标准的注射水中，浓度为1%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为4%，氯化钠最终浓度为3%，室温搅拌8小时；
（4）冰醋酸调溶液ph至中性；
（4-1）内毒素再检测：溶液取样，使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠溶液的内毒素含量，当内毒素含量小于0.05eu/mg时，进入步骤（5），如果内毒素含量不小于0.05eu/mg，则重复步骤（3）、（4）；
（5）加入7倍体积95%乙醇沉淀，3次脱水至酒精度数达到90%，55℃真空干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
实施例5
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）内毒素检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量小于5eu/mg；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶解于一定体积的经检验符合内毒素检测标准的注射水中，浓度为5%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为2%，氯化钠最终浓度为6%，室温搅拌8小时；
（4）冰醋酸调溶液ph至中性；
（4-1）内毒素再检测：溶液取样，使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠溶液的内毒素含量，当内毒素含量小于0.05eu/mg时，进入步骤（5），如果内毒素含量不小于0.05eu/mg，则重复步骤（3）、（4）；；
（5）加入11倍体积95%乙醇沉淀，4次脱水至酒精度数达到90%，40℃真空干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
对比例1
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）内毒素检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量小于5eu/mg；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶解于一定体积的经检验符合内毒素检测标准的注射水中，浓度为15%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为6%，氯化钠最终浓度为5%，室温搅拌8小时；
（4）冰醋酸调溶液ph至中性；
（4-1）内毒素再检测，溶液取样检测，内毒素含量小于0.05eu/mg；
（5）加入9倍体积95%乙醇沉淀，5次脱水至酒精度数达到90%，65℃真空干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
由此得出结论：寡聚透明质酸钠溶液浓度太高，碱性条件反应一段时间后溶液呈现黄色，影响产品的外观颜色。
对比例2
一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法，包括依次进行的如下步骤：
（1）内毒素检测：使用鲎试剂检测寡聚透明质酸钠粉末中的内毒素含量小于5eu/mg；
（2）将寡聚透明质酸钠粉末溶解于一定体积的经检验符合内毒素检测标准的注射水中，浓度为10%，室温搅拌，使其完全溶解；
（3）分别加入氢氧化钠和氯化钠固体，使氢氧化钠最终浓度为0.1%，氯化钠最终浓度为5%，室温搅拌8小时；
（4）冰醋酸调溶液ph至中性；
（4-1）内毒素再检测，溶液取样检测，内毒素含量大于0.05eu/mg；乙醇沉淀后重复步骤2-4，内毒素含量仍然大于0.05eu/mg。
（5）加入11倍体积95%乙醇沉淀，4次脱水至酒精度数达到90%，40℃真空干燥，得到寡聚透明质酸钠粉末。
由此得出结论：氢氧化钠浓度较低，内毒素检测结果大于0.05eu/mg，未起到彻底去除内毒素的目的。