用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒与流程

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒霍乱弧菌进行荧光定量pcr检测的方法和相应的检测试剂盒。

背景技术：

弧菌属是革兰氏阴性菌的一种，属于兼性厌氧型细菌，可通过呼吸和发酵代谢产生能量。弧菌属多存在于水中，其中典型代表性的弧菌种类具有致病性，例如：霍乱弧菌(vibriocholerae)、肠炎弧菌(vibrioparahaemolyticus，又称为副溶血弧菌)及创伤弧菌(vibriovulnificus、俗称为海洋弧菌)等。

霍乱弧菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜。霍乱弧菌共分为155个血清群，其中o1群和o139群可引起霍乱。自然情况下，霍乱弧菌主要通过污染的水源或饮食食物经口而引起肠道感染，具体临床症状表现为：剧烈呕吐、严重腹泻、失水乃至死亡。主要病理变化均由严重脱水引起，临床可见指纹皱缩，皮下组织及肌肉干瘪。心、肝、脾等脏器均见缩小。内脏浆膜无光泽。肠腔高度扩张、肠内充满泔水样液体，肠粘膜松弛，但粘膜上皮完整，无溃疡。胆囊内充满粘稠胆汁。肾小球及间质的毛细管扩张，肾小管肿胀、变性及坏死。其他脏器也有出血、变性等变化。

霍乱弧菌包括两个生物型：古典生物型(classicalbiotype)和埃尔托生物型(el-torbiotype)。这两种型别除个别生物学性状稍有不同外，形态和免疫学性基本相同，在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年以来，全球共发生了七次世界性霍乱大流行，造成了人类的大量死亡，前六次病原是古典型霍乱弧菌，第七次病原是埃尔托型霍乱弧菌。霍乱弧菌分泌产生的肠毒素，是一种剧烈的致泄毒素。该毒素作用于肠壁促使肠黏膜细胞极度分泌从而使水和盐过量排出，导致严重脱水虚脱；进而引起代谢性酸中毒和急性肾功能衰竭。由霍乱弧菌引起的腹泻性疾病是引起全球五岁以下儿童死亡的第二大疾病。

霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱，埃尔托生物型抵抗力较强，在河水、井水、海水中可存活1～3周，在鲜鱼、贝壳类食物上可存活1～2周。霍乱是一种烈性肠道传染病，发病急、传染性强、病死率高，属于国际检疫传染病。因此，准确快速地检测霍乱弧菌对于制定疾病预防、治疗和控制方案具有重大意义。目前，国内外对霍乱弧菌进行了大量研究，建立了很多有效的检测方法，其中细菌纯培养、生理生化检测、血清学分型及噬菌体分型已广泛应用，但仍然存在耗时、灵敏度低等问题。近年来，分子生物学技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于霍乱弧菌的检测。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

s1、收集样品；

s2、提取基因组dna；

s3、检测霍乱弧菌属特异性基因rpob、gene1、gene2、gene3以及产毒特异性基因gene4；

s4、读取扩增ct值；当所述霍乱弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的ct值均小于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阳性；当所述霍乱弧菌属特异性基因rpob、gene1、gene2、gene3的ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的ct值大于35时，产毒霍乱弧菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述霍乱弧菌属特异性基因rpob(ncbiaccessionnumber：kx894541.1)的检测引物如seqidno:1～2所示：

seqidno:1(5'-ggtgatgatctggctcctgg-3')；

seqidno:2(5'-acccttgttaccgtgacgac-3')。

所述霍乱弧菌属特异性基因gene1的检测引物如seqidno:3～4所示：

seqidno:3：(5'-ccctcagccagatcttgagc-3')(ncbiaccessionnumber：qbj29380.1)；

seqidno:4：(5'-tacagtgcacggcgtaaact-3')(ncbiaccessionnumber：qbj29381.1)。

所述霍乱弧菌属特异性基因gene2(ncbiaccessionnumber：aea77965.1)的检测引物如seqidno:5～6所示：

seqidno:5：(5'-cactctatttgcatggccgc-3')；

seqidno:6：(5'-tggctaaatctgcggtgatgt-3')。

所述霍乱弧菌属特异性基因gene3(ncbiaccessionnumber：qbj29687.1)的检测引物如seqidno:7～8所示：

seqidno:7：(5'-ccccaacgctatttatgtgcc-3')；

seqidno:8：(5'-catcttctacccgctcagcc-3')。

所述产毒特异性基因gene4(ncbiaccessionnumber：akb08108.1)的检测引物如seqidno:9～10所示：

seqidno:9：(5'-ctaatgctgccaatacgccg-3')；

seqidno:10：(5'-ggatgaggactgtatgcccc-3')。

本发明另一目的是提供一种用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr试剂盒，其包含上述的霍乱弧菌属特异性基因rpob、gene1、gene2、gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过前期对霍乱弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分霍乱弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的霍乱弧菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。

(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。

(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断霍乱弧菌属和其他弧菌属、产毒和非产毒弧菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒霍乱弧菌，结果更加严谨和准确。

(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。

(5)本发明检测方法能够应用于对于环境的水体样品、淤泥样品、水质抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒霍乱弧菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于水产养殖，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。

附图说明

图1是rpob基因检测引物标准曲线。

图2的gene1基因检测引物标准曲线。

图3是gene2基因检测引物标准曲线。

图4是gene3基因检测引物标准曲线。

图5是gene4基因检测引物标准曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

表1

在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。

在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出霍乱弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属，从而准确检测并判断出产毒霍乱弧菌。

在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出霍乱弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属，从而准确检测并判断出产毒霍乱弧菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。

在一些实施方案中，采集养殖场水体、塘泥、河道水体、底泥和生活用水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒霍乱弧菌，方便快捷。

本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。

本发明所描述的用于检测产毒霍乱弧菌荧光定量pcr的方法及试剂盒可以广泛应用于环境土壤监控、水体监控、饮用水监控和食品安全监控等多个检验检疫范畴，能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。

实施例1检测引物扩增标准曲线

1.微生物培养

使用碱性蛋白胨水作为霍乱弧菌的培养基，ph8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。

2.基因组dna提取

按照qiagen的qiaampdnaminikit说明书指示进行基因组dna的提取。

3.扩增产物标准品质粒制作

使用源自霍乱弧菌提取的dna，分别以rpob基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因的引物进行扩增，扩增产物经过加a处理后，使用t4连接酶连入t载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如seqidno:1～10所示，具体如表2。

表2

4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置

分别涂板扩增rpob基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过lb培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照qiagenplasmidmidikit说明书指示进行质粒dna的提取。提取后检测质粒dna的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置6个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μl，100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl。

5.检测引物标准曲线绘制

按照bioradiqsybrgreensupermix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qpcr扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qpcr的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qpcr反应体系和扩增反应条件如表3所示。

表3

6.结果分析

检测引物扩增标准曲线结果显示，rpob基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度r²>0.980，高扩增效率在90-105％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及6个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。

表4

实施例2阳性及阴性样品检测情况

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组dna提取

同实施例1。

3.5个目标基因的qpcr检测

按照bioradiqsybrgreensupermix说明书指示进行样品的qpcr扩增，并且得到每对引物对应的ct值读数。每一个qpcr的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qpcr反应体系和扩增反应条件如表5所示。

表5

4.结果分析

5对引物的qpcr扩增结果显示，霍乱弧菌属呈现rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的一个到多个基因的阳性结果，而其他弧菌属均显示阴性结果。因此，对于霍乱弧菌属和其他弧菌属，进行rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测，能够较好的区分霍乱弧菌属和其他弧菌属。同时，gene4基因的检测结果，产毒的霍乱弧菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒霍乱弧菌属和其他弧菌属呈现阴性。因此，进行gene4基因的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的弧菌属。综上所述，rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的对应引物，能够满足弧菌属中霍乱弧菌属的检测判断，gene4基因的对应引物，能够满足产毒和非产毒弧菌属的检测判断。

表6

表7

实施例3检测体系的灵敏度

1.微生物培养

使用碱性蛋白胨水作为霍乱弧菌的培养基，ph8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml，和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的dna提取实验。

2.基因组dna提取

同实施例1。

3.5个目标基因的qpcr检测

同实施例2。

4.结果分析

5对引物的qpcr扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，霍乱弧菌属呈现rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的一个到多个基因的阳性结果。因此，通过进行rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内霍乱弧菌属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene4基因的检测结果，产毒的霍乱弧菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒霍乱弧菌属呈现阴性。因此，进行gene4基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的弧菌属的检测和区分。综上所述，可以通过rpob基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因的搭配检测，较好的完成产毒霍乱弧菌的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。

表8

表9

实施例4环境样品的检测

1.环境样品收集和基因组dna的提取

分别收集不同的虾塘水和对应底泥、河道污水和对应底泥，以及生活污水和过滤水，按照qiagen的qiaampdnaminikit说明书指示进行基因组dna的提取。

2.5个目标基因的qpcr检测

同实施例2。

3.结果分析

5对引物的qpcr扩增结果显示，除了河道污水和过滤水，其他样品均检出rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因中的1个及以上，证明相应的样品来源中含有霍乱弧菌。而除了河道污水、过滤水、一个河道底泥和一个生活污水样品外，其他样品均检出gene4基因，证明对应的样品来源中含有产毒的霍乱弧菌。最终判断为产毒霍乱弧菌阳性的准则为，rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因中的1个及以上检测得到ct值小于35个循环，同时gene4基因检测得到ct值小于35个循环。如果rpob基因、gene1基因、gene2基因和gene3基因均检测得到ct值大于35个循环，或者，gene4基因检测得到ct值大于35个循环，则判断为产毒霍乱弧菌阴性未检出。

表10

表11

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广州微芯生物科技有限公司

<120>用于检测产毒霍乱弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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