与猪肌肉pH和滴水损失性状相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明属于猪的分子标记制备技术领域，涉及一种与猪肌肉ph和滴水损失性状相关的snp分子标记及其应用，尤其涉及一种猪klf5基因的单核苷酸多态位点作为猪ph和滴水损失性状相关的分子标记及应用。

背景技术：

改革开放以来，我国生猪育种工作取得了显著成就，商品猪的生长速度持续加快，胴体瘦肉率不断提高。但随之而来的是肉质口感粗糙，肌肉品质下降。随着人们生活水平的提高和营养观念的转变，我国的猪肉市场正在向优质肉需求发展。因此，选育出较好的优质肉猪是摆在育种科学家面前的一项重要课题。

猪肉质性状受一个或多个数量性状位点的影响，采用常规育种方法难以进行选择。随着分子生物学技术的发展，蛋白质标记、dna指纹标记、微卫星标记、单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)等技术越来越多的应用到猪育种实际生产中。snp主要是指在基因组上由于单个核苷酸的变异而形成的遗传标记，其数量多，多态性丰富，pcr-rflp是主要检测方法之一。这些技术与常规育种技术结合，减少了人力物力、提高了育种效率、加快了育种进程。

krüpple样因子(krüpple-likefactors，klfs)是一类含c2h2锌指结构的转录因子家族，klf家族成员在非dna结合区域的氨基酸序列的差异造成klfs的功能各不相同，作为转录因子参与细胞的生长、增殖和分化，进而参与多种组织器官的发育和分化。研究表明，klf5通过调控下游众多靶基因的表达，从而参与血管平滑肌细胞的增殖。然而klf5在骨骼肌中的调控机制还未见报道。

猪肉的ph值、滴水损失等指标与肌肉品质密切相关，因此与ph值等肉质指标相关的基因可作为提高肉质性状的候选基因。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明从猪klf5基因外显子区克隆得到一个特异的dna片段，寻找snp位点，并建立相应的检测方法，为猪的肉质性状选育提供一种新的分子标记。

一种与猪肌肉ph以及滴水损失性状相关的snp分子标记，所述snp分子标记的核苷酸序列是从猪klf5基因外显子区克隆得到一个特异的dna片段，该dna片段共528bp，其中在该序列中第160bp处以及第436bp处均为a/g突变。

扩增上述分子标记的引物对，所述引物对是：

f：cgtaacccacatcaagacc；

r：gcaatcgtagcagcatag。

上述分子标记在选育优质猪肉时的应用。

上述分子标记在猪肌肉ph和滴水损失含量检测中的应用。

上述引物对在选育优质猪肉时的应用。

上述引物对在猪肌肉ph和滴水损失含量检测中的应用。

本发明的优点是：

本发明提供了一种与猪肌肉ph以及滴水损失性状相关的snp分子标记及其应用，snp分子标记的核苷酸序列是从猪klf5基因外显子区克隆得到一个特异的dna片段，该dna片段共528bp，其中在该序列中第160bp处以及第436bp处均为a/g突变。本发明的方法在保守去设计引物扩增猪基因组dna的外显子序列，获得的片段上包含两处a/g突变，且两处突变同时进行。并利用一处突变位点引起的tsp45i酶切位点的多态性检测猪重要经济性状-肉质性状。实验证明了该突变位点与猪肉质性状存在显著相关，表明本发明利用该突变位点检测猪的肉质性状的方法是非常准确简便的方法。本发明的方法可用于检测猪的ph和滴水损失含量等反映肌肉品质的性状，从而为猪的分子育种提供了一个新的检测其遗传性状的方法，并将在猪的育种中发挥重要作用。本发明采用简便、快捷的测序方法寻找klf5目的基因片段所存在的snps突变位点，通过引物设计、pcr扩增、片段测序以及数据结果的对比分析来寻找目的片段上存在的突变位点，并与猪的ph值、滴水损失肌内脂肪等肉质指标进行关联分析，为优质猪肉选育提供一种新的分子标记。

附图说明

图1是本发明中klf5基因目的片段的pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测的结果图：图中：m：100bpdnaladdermarker，泳道1-4：扩增片段；

图2是大约克猪、巴克夏猪、沙子岭猪、巴马香猪和大围子猪klf5基因目的片段序列对比结果，图中加粗的英文字母表示snp位点；

图3是本发明中klf5基因突变位点的tsp45i酶切电泳图：图中：m：100bpdnaladdermarker，泳道1：aa-gg基因型，泳道2、3：ag-ag基因型，泳道4：gg-aa基因型。

图4是本发明中检测klf5基因目的片段160bp处突变位点的测序图谱；

图5是本发明中检测klf5基因目的片段436bp处突变位点的测序图谱。

具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明作进一步地解释，但具体实施并不对本发明做任何限定。

本发明提供了一种与猪肌肉ph以及滴水损失性状相关的snp分子标记，snp分子标记的核苷酸序列是从猪klf5基因外显子区克隆得到一个特异的dna片段，该dna片段共528bp，其中在该序列中第160bp处以及第436bp处均为a/g突变。

同时，本发明还提供了一种检测方法，是检测猪klf5基因528bp扩增片段上存在的两个碱基突变位点，一处在目的片段160bp处，另一处在目的片段436bp处，均为a/g突变，且两处突变存在相关性，通过碱基确定猪的基因型，然后通过基因型确定肉质性状。确定猪的基因型的方法为：当160bp处碱基为a时，在436bp处碱基为g；当160bp处碱基为g时，在436bp处碱基为a。两处碱基同时改变，存在三种类型，分别为aa-gg、ag-ag、gg-aa。检测目的片段160bp和436bp处碱基是a还是g以确定基因型种类，方法包括pcr扩增获得目的片段的扩增产物，对扩增产物进行测序或用tsp45i酶(436bp碱基为g时附近存在的一种限制性内切酶)切扩增产物。tsp45i酶切扩增片段，若得到92bp、436bp两个片段，其基因型为aa-gg，若得到528bp一个片段，其基因型为gg-aa；若得到92bp、436bp和528bp三个片段，其基因型为ag-ag。

为了使方法更简便，具有更高的效率，上述酶切后获得片段的检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测。

1、rflp多态性检测猪肉质性状的方法的建立

在该基因突变位点设计引物，采用tsp45i-rflp方法进行snp分型，引物序列如表1。

表1引物序列

用于基因多态性检测的dna样品来自5个猪群，见表2。采用试剂盒提取基因组dna，并置于-20℃保存。

表2猪群和样品数

pcr扩增条件：

pcr扩增体系20μl：dna模板1μl，上下游引物各0.5μl，双蒸水8μl，2×taqpcrmastermix10μl；pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，2-4步34个循环，72℃后延伸5min，4℃保存；pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

目的片段测序：

将上一步扩增得到的目的片段送公司测序，得到目的片段的序列。大约克猪、巴克夏猪、沙子岭猪、巴马香猪和大围子猪等不同猪种klf5基因目的片段序列对比结果见图2，其中，图中加粗的英文字母表示snp位点。

tsp45i-rflp检测：

pcr产物用tsp45i酶切，酶切反应体积是31μl，其中pcr扩增产物10μl，nuclease-freewater18μl，10×bufferr2μl，限制性内切酶1μl(10u)，将样品混匀后离心，37℃温浴16h。

用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，凝胶成像系统照像，结果见图3。

结果表明，利用引物对klf5基因扩增得到长度为528bp的dna片段。通过测序，在目的片段160bp和436bp处碱基为a或g的突变位点，测序图谱见图4、图5，依据436bp处碱基为a或g寻找适合的限制性内切酶tsp45i，随后进行tsp45i-rflp检测多态位点。

以猪klf5基因为研究对象，以5个猪群(共计270头)作为试验对象，采集耳组织提取dna，其中，大约克猪78头、巴克夏猪62头、沙子岭猪45头、巴马香猪30头、大围子猪55头。对klf5基因436bp处a/g位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传结构。

tsp45i-rflp检测多态位点结果见表3。由表3可知，在所检测的5个猪种中，aa-gg基因型和a-g等位基因均占绝对优势，但是在沙子岭猪中暂未检测到gg-aa型。

表3tsp45i-rflp多态性在5个猪群中的分布

2、基因型与肉质性状的关联分析

试验猪群：选择三元杂交品种，即大白猪×巴克夏猪×沙子岭猪(简称大巴沙)，仔猪断奶后，选择200头出生日期相近、生长较为一致的仔猪做为试验猪群。当试验猪群体重达到100kg左右，进行屠宰，并按照步骤1)的方法检测基因型，按照下述方法检测肉质性状。

肉质性状检测方法：

ph：在屠宰后45分钟(ph1)和24小时(ph24)分别用酸度计测量背最长肌胸腰椎结合处ph值。

滴水损失：屠宰后2小时内取倒数第3-4胸椎处背最长肌，除去筋膜、脂肪组织，顺肌纤维方向切成2cm×2cm×4cm(高×宽×长)的肉样，置于电子天平上称重，用扎丝钩住肉样一端，使肌纤维垂直向下吊挂于一次性塑料杯中，并置于充气的聚乙烯食品袋中，扎紧袋口，避免肉样与杯壁接触。在2-4℃条件下储存48小时，取出肉样，轻轻用滤纸吸干肉样表层残留的液体，置于电子天平上称重，前后重量之差除以鲜肉重的百分比即为滴水损失。

不同基因型与猪肉质性状(ph、滴水损失)的关联分析应用sas9.4版本的glm程序进行数据处理和统计分析，采用模型为：yijk＝μ+bi+gj+εijk。其中，yijk为性状表型值，μ为平均值，bi为组合效应，gj为基因型效应，εijk为随机误差。

结果显示：aa-gg基因型的ph1与ph24显著高于gg-aa型(p<0.05)，但aa-gg和gg-aa型均与ag-ag型差异不显著(p>0.05)；aa-gg基因型的滴水损失显著高于ag-ag和gg-aa型(p<0.05)。(本发明还统计分析了其他肉质性状指标，只列出了差异显著指标)。

表4猪的基因型与肉质性状的关联分析

同列数据肩标不同字母表示差异显著(p<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(p>0.05)。

序列表

<110>湖南省畜牧兽医研究所

<120>与猪肌肉ph和滴水损失性状相关的snp分子标记及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cgtaacccacatcaagacc19

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcaatcgtagcagcatag18