一种维生素A代谢相关基因突变位点的检测方法与流程

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种维生素a代谢相关基因突变位点的检测方法。

背景技术：

维生素a(vitamina)又称视黄醇(其醛衍生物视黄醛)或抗干眼病因子，是一个具有脂环的不饱和一元醇，包括动物性食物来源的维生素a1、a2两种，是一类具有视黄醇生物活性的物质。维生素a维持正常视觉功能，维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成，维持骨骼正常生长发育，抑制肿瘤生长等，但是过量摄入维生素a可引起头痛、皮肤干燥、脱屑和脱发等症状。

bcm01是类胡萝卜素转化成视黄醇过程中的一个关键酶，bcm01基因的多态性影响维生素a的转化效率，从而影响该营养素正常需求。

bcm01基因多态性的筛查能帮助个体充分了解自己的遗传状况，提前采取相应的健康管理措施。

bcm01基因多态性的筛查一般采用传统的snp位点检测技术，该技术一次只能对一个基因进行检测，对于需要检测多种基因来说，该方式存在工作量大且效率低的问题。

技术实现要素：

为了传统的snp位点检测技术存在的一次只能对一个基因进行检测，对于需要检测多种基因来说，该方式存在工作量大且效率低的问题；本发明提供了一种维生素a代谢相关基因突变位点的检测方法。

本发明所采用的技术方案为：一种维生素a代谢相关基因突变位点的检测方法，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重pcr扩增反应得到目标片段，目标片段经过限制性内切酶消化，然后再利用单碱基延伸技术对经过限制性内切酶消化的目标片段进行双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标dna序列；

其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。

在其中一个实施例中，所述目标位点特异性引物包括：

用于扩增维生素a代谢相关基因bcm01-rs6420424片段的第一特异性引物，第一特异性引物的正向引物的核苷酸序列如seqidnos：1所示，第一特异性引物的反向引物的核苷酸序列如seqidnos：2所示；

用于扩增维生素a代谢相关基因bcm01-rs11645428片段的第二特异性引物，第二特异性引物的正向引物的核苷酸序列如seqidnos：3所示，第二特异性引物的反向引物的核苷酸序列如seqidnos：4所示；

用于扩增维生素a代谢相关基因bcm01-rs6564851片段的第三特异性引物，第三特异性引物的正向引物的核苷酸序列如seqidnos：5所示，第三特异性引物的反向引物的核苷酸序列如seqidnos：6所示。

在其中一个实施例中，所述单碱基延伸技术所用的引物包括：

用于扩增维生素a代谢相关基因bcm01-rs6420424片段的第一单碱基延伸引物，第一单碱基延伸引物的核苷酸序列如seqidnos：7所示；

用于扩增维生素a代谢相关基因bcm01-rs11645428片段的第二单碱基延伸引物，第二单碱基延伸引物的核苷酸序列如seqidnos：8所示；

用于扩增维生素a代谢相关基因bcm01-rs6564851片段的第三单碱基延伸引物，第三单碱基延伸引物的核苷酸序列如seqidnos：9所示。

在其中一个实施例中，在第一单碱基延伸引物的5`端、第二单碱基延伸引物的5`端以及第三单碱基延伸引物的5`端均加入10个核苷酸，10个核苷酸的固定序列为acgttggatg。

在其中一个实施例中，所述单管多重pcr扩增的反应程序为：95℃2分钟，95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保温。

在其中一个实施例中，所述限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。

在其中一个实施例中，所述限制性内切酶消化处理的程序为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。

在其中一个实施例中，所述双向延伸反应的程序为：94℃30秒；94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒，5个循环，40个循环；72℃3分钟，4℃保温。

在其中一个实施例中，所述核酸质谱分析的具体步骤为：

所述核酸质谱分析的具体步骤为：

s1：在树脂板上铺好待用树脂，风干3-8分钟；

s2：向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充41μlddh2o，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬时离心；

s3：除去封口膜，将样本板倒扣在步骤s1中的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬时离心；

s4：将步骤s3中的样本板置于旋转器上在800rpm/min的转速下旋转30分钟，在3000rpm/min，离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

通过设计的目标位点特异性引物的单管多重pcr扩增反应得到目标片段，然后再利用单碱基延技术，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标dna序列。本发明所述的检测基因突变的方法与传统的snp位点检测技术相比，可以在一个反应中实现多个snp位点的检测，具有较高的应用价值。

附图说明

图1是实施例1中人类维生素a代谢相关基因bcm01-rs6420424的核酸质谱分析图；

图2是实施例1中人类维生素a代谢相关基因bcm01-rs11645428的核酸质谱分析图；

图3是实施例1中人类维生素a代谢相关基因bcm01-rs6564851的核酸质谱分析图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐述。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明的描述中，有的结构或器件未作具体描述的，理解为现有技术中有能实现的结构或器件。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1

一种人类维生素a代谢相关基因突变位点的检测方法，包括以下步骤：

1.提取血液样本dna

1.1将离心管中的500ul血液样品10000rpm离心2min，去除上清液，留沉淀备用；

1.2向上述离心管中加入350μlbuffermcl和20μlproteinasek，震荡混匀，65℃水浴20min，间或混匀；

1.3水浴完成之后向离心管中加入350μlbufferma和25μlsanmagbeads，振荡或者颠倒混匀，室温静置3min，间或混匀；

1.4将离心管置于磁力架上30s，待sanmagbeads完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管；

1.5向离心管中加入700μl70％乙醇，吸打或者点振混匀，将离心管置于磁力架上30s，吸弃上清，从磁力架上取出离心管；

1.6重复步骤1.5一次，室温开盖干燥10min至管内无液体残留；

1.7向离心管中加入50μltebuffer(ph8.0)，间或混匀；

1.8取出离心管并置于磁力架上30s，待sanmagbeads完全吸至管壁上之后，小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组dna。

2.设计出特异性引物

ncbi网站上查询并下载维生素a代谢相关基因bcm01-rs6420424、bcm01-rs11645428、bcm01-rs6564851的序列信息，在待测的位点的上下游选取20个核苷酸的特异性序列作为扩增引物。

设计原则为：包含待测位点的dna片段长度100bp-300bp均可，避免发夹结构和重复序列。设计完成以后，在bcm01-rs6420424的特异性引物5的'端、bcm01-rs11645428片段的特异性引物的5'端以及bcm01-rs6564851片段的特异性引物的5'端均加入一段固定序列acgttggatg。所设计的pcr引物序列如表1所示：

表1特异性引物序列表

3.设计出单碱基延伸引物

单碱基延伸引物的设计同样是在该基因序列上设计，选择待测碱基位点上游和下游紧临的碱基，并根据质谱检测范围(4000道尔顿～9000道尔顿)，设计引物长度，设计原则引物扩增的第一个碱基即为待测碱基，而且避免发夹结构和重复序列。所设计的单碱基延伸引物序列如表2所示：

表2单碱基延伸引物序列表

4.核酸质谱分析

4.1配制1μm的pcr引物混合物，bcm01-rs6420424、bcm01-rs11645428、bcm01-rs6564851基因的目的片段的多个snp位点正向引物和反向引物；

4.2根据说明书配制pcr反应液，每个pcr反应中分别加入dna样本和对照样本；

4.3加入dna样本后，96孔样本板于漩涡振荡器混匀，贴上封口膜；

4.4将96孔样本板放上pcr仪进行以下热循环：95℃2分钟；95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45个循环；72℃5分钟，4℃保温；

4.5向pcr产物中加入0.75μl的虾碱性磷酸酶，用0*tris-buffer调节缓冲液浓度，每个反应加入10*tris-buffer0.5μl，然后在预热的水浴锅内进行37℃消化处理45分钟，然后85℃加热变性5分钟，最后冰浴10分钟；

4.6将各个位点的延伸引物稀释到10μm，计算在体系中的比例，然后在1.5ml管中配制iplex延伸引物反应液；

4.796孔样本板的每一个反应孔中加入2μliplex延伸反应液且补充41μlddh2o，混匀；

4.8把96孔样本板用膜密封，涡旋震荡和然后离心3000rpm/min5秒；

4.9将96孔样本板放上pcr仪进行以下热循环：

4.10树脂板上铺好待用树脂，风干3-8分钟；

4.11反应结束后，向96孔样本板的每一个反应孔中加入41μl水且倒扣于步骤4.10中的风干的树脂板上，然后96孔样本板与树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000rpm/min，瞬时离心；

4.12将96孔样本板置于旋转器上以800rpm/min的速度旋转30分钟，随后在3000rpm/min的速度下离心5分钟；

4.13将96孔样本板放入质谱仪，打开点样程序，进行自动点样操作。

4.14打开飞行质谱软件，设置好参数，进行检测；

4.15检测完成后，在软件中自动生成结果，导出即可；

维生素a代谢相关基因bcm01-rs6420424、bcm01-rs11645428、bcm01-rs6564851的核酸质谱分析结果具体见图1-3。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>杭州云鼎基因生物科技有限公司

<120>一种维生素a代谢相关基因突变位点的检测方法

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acgttggatggggacatttctatgctcaag30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

acgttggatgactttggaaacctgtgtccg30

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

acgttggatggaacacgcctcagagttatc30

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acgttggatgactctcaaccttgactgagc30

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

acgttggatgagaatgctctgagtgcctac30

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acgttggatgacatctgcctcattgactgg30

<210>7

<211>15

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gggactcaccttccc15

<210>8

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gcgttatcttcaggagtcaggg22

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tcctactgtattttaagcactg22