一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法与流程

本发明涉及血液感染病原菌的检测技术领域，具体涉及一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法。

背景技术：

肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，已成为医院获得性感染的重要条件致病菌之一。肺炎克雷伯菌导致的血流感染在革兰氏阴性菌引起的血流感染中位列前茅。肺炎克雷伯菌引起的血流感染不仅伴随着多种如肺炎感染等的并发症，而且具有极高的发病率和死亡率。

目前，针对临床血液中肺炎克雷伯菌的检测，传统的院内检验方法需要经过24-48h的菌种培养步骤，再到后续的生理生化或耐药性分析等，会经过一系列耗时和复杂的中间检测步骤。这种临床传统检测方法往往会错过已感染病人的及时诊断，而不能实时地为临床医师提供用药指导，从而错过感染病人的最佳治疗时间。所以，寻找一种快速简单和高效率的检测血样中肺炎克雷伯菌的方法具有重大的临床意义和广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，解决了医院传统的临床血液中肺炎克雷伯菌感染检测周期长的技术局限，同时在检测效率上也有了较大的提升；本发明为简单快速、特异和高效的临床血液检测肺炎克雷伯菌感染的方法，首先简单快速地提取出血样中肺炎克雷伯菌的基因组dna；再利用待测肺炎克雷伯菌的特异基因设计特异性pcr扩增引物，通过pcr反应快速高效地检测出临床血液中肺炎克雷伯菌感染。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，包括以下步骤：

s1、血液中肺炎克雷伯菌基因组dna的提取；

s2、血液中肺炎克雷伯菌pcr检测：

s2.1、利用肺炎克雷伯菌基因组dna序列设计一段特异性的pcr引物，该特异性的pcr引物包括如seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物；其中，

seqidno.1：5’-gttgttcccgttatgtctggtgc-3’；

seqidno.2：5’-gctatcagcgccacgttagc-3’；

引物所扩增的目的片段长度为411bp；

s2.2、以步骤s1中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组dna为模板，采用步骤s2.1中的特异性的pcr引物进行pcr扩增；

s2.3、对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。

优选地，步骤s1中，血液样品中肺炎克雷伯菌病原菌基因组dna的提取具体包括以下步骤：

s1.1、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；

s1.2、步骤s1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；

s1.3、步骤s1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；

s1.4、轻轻吸取上层悬液至dna吸附柱中，并将dna吸附柱套在2ml离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱；

s1.5、向dna吸附柱内加入500μl的0.4mki与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱；

s1.6、再向dna吸附柱内加入700μl的80％v/v无水乙醇和10mmtris-hcl(ph8.0)混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱；

s1.7、重复步骤s1.61次；

s1.8、空dna吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将dna吸附柱转移至1.5ml离心管内；

s1.9、向空dna吸附柱膜中央加入30μl10mmtris-hcl和1mmedta混合液，ph为8.0-8.5；12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组dna。

优选地，步骤s1.1中，酶裂解液中含有：0.1mg/ml核糖核酸酶a、1mg/ml蛋白酶k、0.05mg/ml广谱裂解酶clyh、10mg/ml溶菌酶、25mmtris-hcl、10mmedta，ph8.0-8.5。

优选地，步骤s1.2中，碱裂解液中含有：0.2mnaoh，1％sds，ph12-14。

优选地，步骤s1.3中，去杂液中含有：4mnh4ac-hac，ph4.5-4.8。

优选地，步骤s2.2中，pcr的反应体系为：2倍flashhotstartmastermix5μl，2μmol/l的正向引物1μl，2μmol/l的反向引物1μl，基因组dna模板1μl，双蒸水补足至10μl。

优选地，步骤s2.2中，pcr的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性5s，50℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。

步骤s2中，提供肺炎克雷伯菌基因组dna提取的菌含量≥10cfu/ml。

本发明的有益效果是：

本发明技术方案从血流感染的病原菌的临床检测实际出发，研发和建立了一种快速高效的血液中肺炎克雷伯菌感染的检测方法。利用该发明方法可成功检测出临床血液样品中感染的肺炎克雷伯菌。本发明方法不仅可以极大的提高血液中肺炎克雷伯菌感染的检测效率，简化了临床上传统的通过培养增菌等复杂的检测方法。而且，本发明对血液中肺炎克雷伯菌的检测极限达到10cfu/ml，临床检测应用的灵敏度高。

本发明所建立的pcr检测方法具有重要的临床应用价值，不仅大幅度提高检测效率，临床上对血液中肺炎克雷伯菌感染检测的特异性和灵敏度都有提高；而且检测周期也极大的缩短。本发明实现了临床血液样品中肺炎克雷伯菌感染的快速特异检测诊断，为进一步临床治疗以及指导医师用药提供及时的参考数据，而为感染病人提供宝贵的早期及时治疗。该发明方法具有操作简单方便，检测速度快，特异性高，灵敏度高，稳定性强等显著优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中的所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为肺炎克雷伯菌引物检测的特异性实验结果图；其中，1：marker(100bp)；2：沙门氏菌；3：绿脓杆菌；4：单核细胞增生李斯特菌；5：金黄色葡萄球菌；6：大肠埃希菌；7：肺炎克雷伯菌；8：阴性对照组。

图2为血液中肺炎克雷伯菌检测的灵敏度实验结果图；其中，1：marker(100bp)；2：阴性对照；3：阴性血样；4-8：分别为10⁹，10⁷，10⁵，10³，10cfu/ml菌量的肺炎克雷伯菌。

图3为血液中肺炎克雷伯菌检测方法的临床应用实例；其中，1：marker(100bp)；2-7：分别为临床血液实验组，8：阴性对照。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：pcr引物的设计

利用肺炎克雷伯菌基因组dna序列设计一段特异性的pcr引物，该特异性的pcr引物包括如seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物；其中，

seqidno.1：5’-gttgttcccgttatgtctggtgc-3’；

seqidno.2：5’-gctatcagcgccacgttagc-3’；

引物所扩增的目的片段长度为411bp。

实施例二：

利用肺炎克雷伯菌特异引物检测血液中加入的肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠埃希菌等病原菌。本实施例向每100μl血液中加入od600为0.1的上述各类致病菌。本实施列包括了血液中各细菌基因组dna的提取和肺炎克雷伯菌特异基因的pcr扩增检测。本方法包括以下步骤：

(一)血液中肺炎克雷伯菌基因组dna的提取

(1)收取100μl培养的od600＝0.1的肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、单核细胞增生李斯特菌和肺炎克雷伯菌。12000转/分钟离心1分钟，收集沉淀的菌体。

(2)取6组100μl新鲜的血液，6组100μl新鲜的血液中分别加入经步骤(1)沉淀的肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠埃希菌，重悬沉淀的菌体，充分吹打混合均匀；

(3)向每组血液中加入100μl酶裂解液，37℃孵育15分钟。其中酶裂解液中含有：0.1mg/ml核糖核酸酶a、1mg/ml蛋白酶k、0.05mg/ml广谱裂解酶clyh、10mg/ml溶菌酶、25mmtris-hcl、10mmedta，ph8.0-8.5。

(4)再加入200μl碱裂解液，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟。碱裂解液中含有：0.2mnaoh，1％sds，ph12-14。

(5)再加入200μl去杂液，立即混匀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟。去杂液中含有：4mnh4ac-hac，ph4.5-4.8。

(6)轻轻吸取上清液至dna吸附柱中，并将dna吸附柱套在2ml离心管内。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(7)向dna吸附柱内加入500μl的0.4mki与异丙醇混合液(ki溶于异丙醇中，ki的浓度为0.4m)。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(8)再向dna吸附柱内加入700μl的80％v/v无水乙醇和10mmtris-hcl(ph8.0)混合液(80％v/v无水乙醇中tris-hcl的浓度为10mm)。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(9)重复步骤(8)一次。

(10)空dna吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将dna吸附柱转移至1.5ml离心管内。

(11)向空dna吸附柱膜中央加入30μl10mmtris-hcl和1mmedta混合液(混合液中tris-hcl的浓度为10mm，edta的浓度为1mm)，ph8.0-8.5。12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组dna。

(二)血液中肺炎克雷伯菌pcr检测

(1)以步骤(一)中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组dna为模板，采用上述特异性的pcr引物进行pcr扩增，具体为：

pcr反应体系：2倍flashhotstartmastermix5μl，2μmol/l的如seqidno.1所示的正向引物1μl，2μmol/l的如seqidno.2所示的反向引物1μl，基因组dna模板1μl，双蒸水补足至10μl。

pcr反应程序：98℃预变性2min；98℃变性5s，50℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。

(2)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物(见图1)，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。

由图1可以看出，肺炎克雷伯菌特异性引物仅扩增出特定的肺炎克雷伯菌基因，而在其他致病菌中未扩增出目的条带。说明本发明中设计的肺炎克雷伯菌引物的特异性高。

实施例三：

利用肺炎克雷伯菌特异引物检测血液中加入的肺炎克雷伯菌。本实施例向每100μl血液中分别加入10⁹，10⁷，10⁵，10³，10cfu菌量的肺炎克雷伯菌。本实施列包括了血液中细菌基因组dna的提取和pcr扩增检测。本方法包括以下步骤：

(1)收取培养的10⁹，10⁷，10⁵，10³，10cfu的肺炎克雷伯菌。12000转/分钟离心1分钟，收集沉淀的菌体。

(2)取5组100μl新鲜的血液，5组100μl新鲜的血液中分别加入经步骤(1)沉淀的不同菌落数目的肺炎克雷伯菌菌体，重悬沉淀的菌体，充分吹打混合均匀。

(3)向每组血液中加入100μl酶裂解液，37℃孵育15分钟。其中酶裂解液中含有：0.1mg/ml核糖核酸酶a、1mg/ml蛋白酶k、0.05mg/ml广谱裂解酶clyh、10mg/ml溶菌酶、25mmtris-hcl、10mmedta，ph8.0-8.5。

(4)再加入200μl碱裂解液，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟。碱裂解液中含有：0.2mnaoh，1％sds，ph12-14。

(5)再加入200μl去杂液，立即混匀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟。去杂液中含有：4mnh4ac-hac，ph4.5-4.8。

(6)轻轻吸取上清液至dna吸附柱中，并将dna吸附柱套在2ml离心管内。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(7)向dna吸附柱内加入500μl的0.4mki与异丙醇混合液。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(8)再向dna吸附柱内加入700μl的80％v/v无水乙醇和10mmtris-hcl(ph8.0)混合液。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(9)重复步骤(8)一次。

(10)空dna吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将dna吸附柱转移至1.5ml离心管内。

(11)向空dna吸附柱膜中央加入30μl10mmtris-hcl和1mmedta混合液，ph8.0-8.5。12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组dna。

(二)血液中肺炎克雷伯菌pcr检测

(1)以步骤(一)中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组dna为模板，采用上述特异性的pcr引物进行pcr扩增，具体为：

pcr反应体系：2倍flashhotstartmastermix5μl，2μmol/l的如seqidno.1所示的正向引物1μl，2μmol/l的如seqidno.2所示的反向引物1μl，基因组dna模板1μl，双蒸水补足至10μl。

pcr反应程序：98℃预变性2min；98℃变性5s，50℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。

(2)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物(见图2)。由图2可知，本发明的临床血液中肺炎克雷伯菌检测下限值可以达到10cfu/ml。

实施例四：

6组不同的临床血液样品中大肠埃希菌感染的快速检测实例，具体包括以下步骤：

(1)取6组不同的100μl新鲜的临床血液样本。

(2)向每组血液中加入100μl酶裂解液，37℃孵育15分钟。其中酶裂解液中含有：0.1mg/ml核糖核酸酶a、1mg/ml蛋白酶k、0.05mg/ml广谱裂解酶clyh、10mg/ml溶菌酶、25mmtris-hcl、10mmedta，ph8.0-8.5。

(3)再加入200μl碱裂解液，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟。碱裂解液中含有：0.2mnaoh，1％sds，ph12-14。

(4)再加入200μl去杂液，立即混匀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟。去杂液中含有：4mnh4ac-hac，ph4.5-4.8。

(5)轻轻吸取上清液至dna吸附柱中，并将dna吸附柱套在2ml离心管内。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(6)向dna吸附柱内加入500μl的0.4mki与异丙醇的混合液。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(7)再向dna吸附柱内加入700μl的80％v/v无水乙醇和10mmtris-hcl(ph8.0)混合液。12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2ml离心管重新套入dna吸附柱。

(8)重复步骤(8)一次。

(9)空dna吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将dna吸附柱转移至1.5ml离心管内。

(10)向空dna吸附柱膜中央加入30μl10mmtris-hcl和1mmedta混合液，ph8.0-8.5。12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组dna。

(二)血液中肺炎克雷伯菌pcr检测

(1)以步骤(一)中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组dna为模板，采用上述特异性的pcr引物进行pcr扩增，具体为：

pcr反应体系：2倍flashhotstartmastermix5μl，2μmol/l的如seqidno.1所示的正向引物1μl，2μmol/l的如seqidno.2所示的反向引物1μl，基因组dna模板1μl，双蒸水补足至10μl。

pcr反应程序：98℃预变性2min；98℃变性5s，50℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。

(1)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物(见图3)。由图3可知，2号孔临床血液实验组检测出411bp肺炎克雷伯菌特异基因。3-7号孔临床血液实验组未检测出肺炎克雷伯菌。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110>卓源健康科技有限公司

<120>一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法

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