Fuchs角膜内皮营养不良基因TCF4的CTG重复快速筛查试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学诊断领域，具体涉及一种快速筛查fuchs角膜内皮营养不良风险基因tcf4的三号内含子中ctg重复数目的方法及试剂盒。
背景技术：
：fuchs角膜内皮营养不良(fuchsendothelialcornealdystrophy，fecd)，又称为滴状角膜，是角膜内皮进行性的损伤，角膜后弹力层增厚，细胞外基质赘疣沉积，最终发展成为角膜内皮失代偿为特征的遗传性角膜疾病。fuchs角膜内皮营养不良是角膜移植最主要的原因，40岁以上的美国人约有5％患有此病。特征性表现为角膜滴状赘疣的形成、角膜后弹力层局限性增厚、角膜内皮细胞密度及离子转运功能不断下降。当所剩角膜内皮细胞的数目很少而致内皮功能失代偿时，角膜基质和上皮水肿引起视力下降，逐渐发展为大泡性角膜病变，最终可能导致失明。大约70％fuchs角膜内皮营养不良患者含有tcf4的重复序列扩增，而且含有ctg重复扩增的患者表型更严重，这一扩增将使患病风险增加30倍以上。这一重复扩增不但在欧美人群发生率很高，在亚洲人群发生率也很高。通常40岁之前发病较少，女性与男性患病率约为2.5-3∶1，fecd的临床进程通常为10至20年，角膜移植是目前挽救患者视力的惟一方法，与没有ctg重复扩增的fuchs角膜内皮营养不良患者相比，含有ctg重复扩增的患者约55.3％会接受角膜移植，可能性高1.6倍。含有ctg重复扩增患者平均中心角膜厚度为605.9微米，没有ctg扩增的则为581.3微米。角膜移植风险包括急性和慢性的排斥反应、角膜内皮移植失败、感染和伤及眼睛等。大多数移植后受体视力仅能达到20/20，需要六个月恢复期，患者需要在术后需要连续使用至少两年的免疫抑制剂滴眼液，长期使用易患白内障或青光眼。fuchs角膜内皮营养不良最高发的遗传因子为tcf4三号内含子的ctg重复扩增。ctg重复数目小于或等于37为正常，在37-52之间表明与fuchs角膜内皮营养不良相关，超过52为fuchs角膜内皮营养不良高风险。研究发现fuchs角膜内皮营养不良患者tcf4的mctg转录子和mbnl1的核内包涵体主要积累在角膜内皮，这一ctg重复扩增会引起tcf4rna的聚集，捕获关键rna剪切因子，造成一系列关键分子差异性剪切，从而导致广泛的基因表达谱改变，最终导致细胞死亡。与其他重复扩增疾病类似，在患者的角膜内皮也存在非aug起始翻译造成的细胞毒性。tcf4突变也与原发硬化性胆管炎和精神分裂症相关。对于不同年龄阶段人群(包括婴儿、儿童、青少年、年轻人或中老年)均可进行该检测，从而确定是否为fuchs角膜内皮营养不良高风险。fuchs角膜内皮营养不良临床高风险可以在i期无明显症状时就积极进行干预，当发生角膜水肿时可使用高渗滴眼液或高渗软膏，例如睡前可使用5％氯化钠眼膏来增加泪液渗透压，使角膜上皮脱水，减轻清晨时眼部症状，必要时配合局部消炎抗感染药物。鉴定出的fuchs角膜内皮营养不良高风险者可提早与医生选择眼睛治疗方案，减少错误操作。在激光原位角膜磨镶术、屈光性角膜切削术或不同类型的激光屈光术之前，可以评估受试者是否存在fuchs角膜内皮营养不良高发风险。如果受试者存在该高发风险，则应避免选择以上治疗方案，因为这将增加将来治疗的复杂性并在角膜移植后带来副作用。准备通过眼内手术矫正近视、远视和散光的人应进行该检测是否存在fuchs角膜内皮营养不良高发风险，因为眼内手术会加速角膜内皮细胞的减少。眼内手术矫正近视、远视和散光包括去除和跟换天然晶状体，以及在已有晶状体上再移植一个晶状体从而保持原有晶状体的完整。该检测鉴定出fuchs角膜内皮营养不良高风险还有助于帮助角膜库避免这种高风险的捐赠者。技术实现要素：本发明提供一种用于检测fuchs角膜内皮营养不良致病基因tcf4三号内含子的ctg重复扩增的试剂盒，从而区分fuchs角膜内皮营养不良高风险。为了实现发明目的，我们采用了以下技术方案：设计一高cg含量pcr扩增体系，包括选择热启动的超高热稳定性的dna聚合酶，设计特异引物，优化出独特的pcr体系增强剂，增加50个ctg重复的标准品对照以准确区分ctg正常和扩增样本。本发明提供了用于检测fuchs角膜内皮营养不良致病基因tcf4的ctg重复数目的pcr试剂盒，包括dna聚合酶、反应溶液、增强剂、dntps、特异引物和标准品对照。本发明的引物包括：用于检测ctg重复数目pcr系统i反应体系的引物tcf4-f1、tcf4-r1，及用于检测扩增的ctg重复的pcr系统ii反应体系引物tcf4-t1、tcf4-tgc7、tcf4-r2、tcf4-f2、tcf4-t2和tcf4-gca7。所述pcr系统i反应体系上游引物tcf4-f1核苷酸序列为seqidn0：1，下游引物tcf4-r1的核苷酸序列为seqidno：2。所述pcr系统ii反应体系中，针对ctg重复序列的上游引物为tcf4-t1和tcf4-tgc7，引物tcf4-t1为一段与人类基因组无关的序列，其核苷酸序列为seqidn0：3，引物tcf4-tgc7包含5’端的与tcf4-t1相同的序列和7个tgc三核苷酸重复，其核苷酸序列为seqidno：4；下游引物tcf4-r2核苷酸序列为seqidno：5。所述pcr系统ii反应体系中，针对ctg重复序列的上游引物为tcf4-f2，其核苷酸序列为seqidno：6；下游引物为tcf4-t2和tcf4-gca7，tcf4-t2为一段与人类基因组无关的序列，其核苷酸序列为seqidno：7，引物tcf4-gca7包含5’端的与tcf4-t2相同的序列和7个gca三核苷酸重复，其核苷酸序列为seqidno：8。以上引物信息详见下表表1：表1引物序列信息seqidno：1tcf4-f1cctaaaccaagtcccagacatgtseqidno：2tcf4-r1tggcaaaacttccgaaagccatttcseqidno：3tcf4-t1gtggcatgccagtattgagacgseqidno：4tcf4-tgc7gtggcatgccagtattgagacgtgctgctgctgctgctgctgcseqidno：5tcf4-r2caaaagaaggtctagaagaggaggseqidno：6tcf4-f2gagaatgaattcatttttaatgcseqidno：7tcf4-t2cagtaaacagctatgaccattseqidno：8tcf4-gca7cagtaaacagctatgaccattgcagcagcagcagcagcagca本发明还提出了一种针对ctg重复扩增pcr体系的增强剂，其成分包括乙酰胺、丙酰胺、吡咯烷酮、异丁酰胺，甲酰胺和bsa中的三种。本发明采用的检测设备需要区分样本的尺寸范围，可为琼脂糖凝胶电泳，毛细管电泳abi3130、3500、3730系列均可，或者安捷伦2100生物分析仪。pcr体系中高热稳定性的dna聚合酶可以是：taqdnapolymerase(thermofisher公司)、phusionhigh-fidelitydnapolymerase(thermofisher公司)、iprooftmhighfidelitydnapolymerase(bio-rad公司)、deepdnapolymerase(newenglandbiolabs公司)和masteramptmdnapolymerase(epicentre公司)等，但不限制在以上种类的高热稳定性dna聚合酶。扩增后的产物进行荧光扫描，读取产物尺寸，利用公式，计算重复次数。本发明通过高cg含量pcr体系，高热稳定性dna聚合酶扩增ctg重复经荧光扫描后，与标准品比较可准确确定待测样品的ctg重复所在区间。本发明所需生物样本可以来源于人的血液、体液和各种组织或细胞系。用来检测fuchs角膜内皮营养不良位点tcf4的ctg重复数目的dna可选择以上来源的样本提取的基因组dna。本发明优选荧光扫描的方法来分离核酸片段大小，在临界位置的样本确定范围时，进一步参考标准品尺寸，即可确定ctg重复是在正常还是扩增范畴。本试剂盒可进行少量样本检测，也适用于大规模高通量人群筛选，在使用96孔板或384孔板时，加入50个ctg重复的标准品，板间可进行平行比较，同时可确定试剂盒的准确性和检测精确度。本发明的试剂盒用于快速筛查fuchs角膜内皮营养不良位点tcf4的ctg重复扩增，确定重复数目属于正常还是扩增范围，筛查出fuchs角膜内皮营养不良高风险，该方法可应用于打算进行眼内手术矫正近视、远视和散光的人，晶状体捐献者，有fuchs角膜内皮营养不良家族史的人等。试剂盒具有准确、高通量、样本量少、快速价廉的特点。附图说明图1：ctg重复序列两侧引物示意图。图2：fuchs角膜内皮营养不良tcf4的ctg重复位点快速筛查流程图。图3：pcr系统i筛查ctg重复扩增结果图。图4：pcr系统ii筛查ctg重复扩增结果图。具体实施方式以下通过实施例来进一步阐述本发明。但是应该理解，所述实施例只是用于举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。实施例1：制备fuchs角膜内皮营养不良快速筛查试剂盒1、引物设计在tcf4基因ctg重复序列上游5’端和下游3’端200bp内设计一对pcr系统i特异上游引物tcf4-f1和下游引物tcf4-r1，扩增目的基因组包括ctg重复区、5’侧翼区和3’侧翼区。5’侧翼区为149bp，3’侧翼区为30bp，扩增片段长度为(231+3xn)bp，n代表ctg重复数。计算ctg重复数的公式为：ctg重复数＝(pcr产物长度-231)/3。在tcf4基因ctg重复区设计与ctg重复序列特异结合上游引物tcf4-tgc7，并在其5’端添加人类基因组无关序列gtggcatgccagtattgagacg，引物tcf4-t1序列为该添加序列gtggcatgccagtattgagacg；在tcf4基因ctg重复序列3’端侧翼区200bp内设计特异下游引物tcf4-r2；tcf4-tgc7、tcf4-t1和tcf4-r2扩增片段长度为(77+3×n)bp，n代表ctg重复数。在tcf4基因ctg重复序列5’端侧翼区200bp内设计特异上游引物tcf4-f2；在tcf4基因ctg重复区设计与ctg重复序列互补结合的下游引物tcf4-gca7，并在其5’端添加人类基因组无关序列cagtaaacagctatgaccatt，引物tcf4-t2序列为该添加序列cagtaaacagctatgaccatt；tcf4-f2、tcf4--gca7和tcf4-t2扩增片段长度为(144+3×n)bp，n代表ctg重复数。2、准备2×pcr增强剂2×pcr增强剂组分如下：乙酰胺、丙酰胺、吡咯烷酮、异丁酰胺，甲酰胺和bsa的三种。2×pcr增强剂各组分终浓度如下：乙酰胺为1.8mol/l；丙酰胺为1.2mol/l；吡咯烷酮为1.6mol/l；异丁酰胺为15％；甲酰胺为1.8mol/l；bsa为10μg/ml。3、准备pcr反应液pcr系统i反应液组分如下：10×pgr缓冲液，缓冲液包括浓度为100mmol/l、ph值为8.9的tris-hcl和500mmol/lkcl；浓度为50mmol/l的mgcl2；浓度为10mmol/l的dntp；浓度为10μmol/l的上游引物tcf4-f1；浓度为10μmol/l的下游引物tcf4-r1；活性为5u/μl的dna聚合酶taqdnapolymerase(thermofisher公司)；2×pcr增强剂(1.6mol/l吡咯烷酮、1.8mol/l甲酰胺、10μg/mlbsa)；双蒸水。pcr系统ii反应液组分如下：10×pcr缓冲液，缓冲液包括浓度为100mmol/l、ph值为8.9的tris-hcl和500mmol/lkcl；浓度为50mmol/l的mgcl2；浓度为10mmol/l的dntp；活性为5u/μl的dna聚合酶deepdnapolymerase(newenglandbiolabs公司)；2×pcr增强剂(1.8mol/l乙酰胺、1.2mol/l丙酰胺为、15％异丁酰胺)；双蒸水；引物组可单独使用引物组①或引物组②。引物组①(浓度为0.5μmol/l的目的dna序列上游引物tcf4-tgc7，浓度为10μmol/l的tcf4-t1；浓度为10μmol/l的目的dna序列下游引物tcf4-r2，)；引物组②(浓度为10μmol/l的目的dna序列上游引物tcf4-f2，浓度为0.5μmol/l的目的dna序列下游引物tcf4-gca7，浓度为10μmol/l的tcf4-t2)。实施例2：正常ctg重复用市售基因组dna提取试剂盒，提取样本外周血基因组dna，浓度至少为50ng/μl，260/230值大于2.0，260/280值大于1.8。使用实施例1的试剂盒准备的pcr系统i反应体系：在200μlpcr薄壁管中配制20μlpcr体系。pcr反应体系如下：10×pcr缓冲液2μlmgcl2(50mmol/l)2μldntp(10mmol/l)0.4μltcf4-f1(10μmol/l)1μltcf4-r1(10μmol/l)1μldna聚合酶0.1μldna1μl2×pcr增强剂10μl双蒸水补足至20μl其中引物tcf4-f1和tcf4-r1序列分别为：seqidno：1和seqidno：2。pcr扩增程序：95℃预变性10分钟；95℃45秒→57℃45秒→72℃5分钟，35个循环；72℃延伸7分钟。反应结束后，取1μlpcr产物，与10μl去离子甲酰胺和0.5μldna分子内标500lizsizestandard混合，100℃变性5分钟，冰上冷却。混合物用abi3500geneticanalyzer进行pcr产物片段长度分析，进样电压为2.5kv，20秒，毛细管电泳时间为4000秒。pcr产物毛细管电泳图如图3所示。结果显示，pcr系统i毛细管电泳检测结果为303bp和315bp的两条峰，分别代表24和28个ctg重复；pcr系统ii锯齿峰未超过正常单峰尺寸，说明没有ctg重复未发生扩增，属于正常范围。实施例3：ctg重复扩增使用实施例1的试剂盒准备pcr系统i和pcr系统ii反应体系：在200μlpcr薄壁管中配制20μlpcr体系。pcr反应体系如下：其中引物tcf4-f2序列为：seqidno：6；tcf4-r2序列为：seqidno：5；tcf4-tgc7序列为seqidno：4；tcf4-gca7序列为seqidno：8；tcf4-t1序列为seqidno：3；tcf4-t2序列为seqidno：7。pcr扩增程序：95℃预变性10分钟；97℃45秒→57℃45秒→72℃8分钟，40个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，取1μlpcr产物，与10μl去离子甲酰胺和0.5μldna分子内标500lizsizestandard混合，100℃变性5分钟，冰上冷却。混合物用abi3500geneticanalyzer进行pcr产物片段长度分析，进样电压为2.5kv，20秒，毛细管电泳时间为4000秒。pcr产物毛细管电泳图如图4所示。结果显示，pcr系统i毛细管电泳检测结果在单峰最大值接近400bp，为390bp，计算得出ctg重复为53；pcr系统ii锯齿峰超过正常单峰尺寸，验证ctg重复扩增片段的存在，保证对于超长ctg重复扩增片段或微量嵌合等特殊情况避免误诊和漏诊。当前第1页12