本发明涉及l-丙氨酸生产
技术领域：
，特别是涉及一种l-丙氨酸的发酵生产方法。
背景技术：
：l-丙氨酸，外观呈白色结晶性粉末，无臭，有甜味。它是制造维生素b6、合成泛酸钙和其它有机化合物的原料。添加于食品中具有增加调味效果、改善甜味剂的味感和有机酸的酸味、提高含酸饮料的质量、防止油类氧化等效果。它还可用作生化试剂，用于生物化学和微生物研究方面。l-丙氨酸在医药上用途很广，是营养剂“补精氨基酸营养输液”的组成成份之一，由该产品所组成的复合氨基酸注射液是治疗肝病的新药，可治疗肝功能不全引起的氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒，并且具有良好的利尿作用。l-丙氨酸具有甜味，其甜味为蔗糖的1.2倍，可用于清凉饮料、合成酒和其它食品的调味品，对改良风味有一定的效果，它还可做为化妆品的添加剂。l-丙氨酸是一种非必需氨基酸，但却是人体血液中含量最高的氨基酸。它可为转氨酶提供氨基供体，在临床上常添加到输液中；在食品工业中，l-丙氨酸可作为甜味剂和鲜味剂，正越来越受到人们的欢迎和重视；在医药行业，l-丙氨酸是生产维生素b6及l-氨基丙醇的主要原料；另外在高分子材料领域，近年来发现聚乳酸中添加l-丙氨酸可有效提高聚乳酸的性能。目前，l-丙氨酸的工业化生产方法就是酶法转化，即通过富有l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物(如pseudamonasdacunhae等)细胞催化l-天冬氨酸而得到，其中日本多采用固定化细胞法，而我国均采用游离完整细胞法。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备投资小，提取工艺简单；但其主要原材料l-天冬氨酸价格较贵，造成其生产成本较高，成本一般为2万元/t左右。近年来有文献报道，利用基因工程手段构建的大肠杆菌(escherichiacoli)以葡萄糖为原料厌氧发酵法生产l-丙氨酸，120g/l的葡萄糖发酵液最终生成1279mmol/l的l-丙氨酸，相对于葡萄糖的质量收率为95％，光学纯度大于99.5％。发酵法主要原料葡萄糖廉价易得，培养基成分简单，厌氧发酵动力消耗低，成本低，发酵法l-丙氨酸的生产成本约为1.2万元/t。现有发酵法采用连续流加发酵生产的方式，整个发酵周期较长，产酸较低，转化率也较低。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种l-丙氨酸的发酵生产方法，具有发酵周期短，l-丙氨酸产率高的优点。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种l-丙氨酸的发酵生产方法，采用一次性投料方式将发酵培养基投入发酵罐内，之后高温灭菌，降温至32～37℃后向发酵罐内再移入od值为0.5～0.7的种子，发酵培养生产l-丙氨酸；所述发酵培养基的配方为：葡萄糖浓度10～15％，磷酸氢二铵浓度0.0015～0.0025％，磷酸二氢铵浓度0.0005～0.0015％，甜菜碱浓度0.0001～0.0003％，七水硫酸镁浓度0.0003～0.0005％；ph值为6.7～7.0；以上浓度均为质量百分比浓度；发酵培养的条件为：培养温度36～38℃，压力0.02～0.04mpa，ph值6.7～7.0，通风量2600～2900m3/h；其中，种子的接入量为发酵培养基重量的8～12％。优选地，所述种子的培养方法为：将种子培养基泵入空消的种子罐，空消温度123-125℃，经高温灭菌，之后降温至34～36℃，然后按8～12％的重量比例接入菌种，培养至od值为0.5～0.7，结束培养，得到培养好的种子。优选地，所述种子培养基配方组成为：酵母膏1～3重量份，蛋白胨3～5重量份，氯化钠3～5重量份，自来水900～1100重量份；ph值6.0～7.0。优选地，种子的培养条件为：培养温度36.5～37.5℃，ph值6.5～7.5，压力0.4～0.6mpa，通风量7.0～11.0m3/h。优选地，所述发酵培养基中葡萄糖浓度为14～15％；发酵培养时，通风量为2700～2900m3/h。优选地，所述发酵罐内发酵液中l-丙氨酸浓度大于10g/dl，残还原糖质量百分比含量小于0.2％，发酵培养结束。本发明提供的l-丙氨酸的发酵生产方法，采用一次性投料发酵工艺，将发酵所需的糖源、氮源、无机盐等一次性投入发酵罐，灭菌降温后，再移入培养好的种子，发酵培养生产l-丙氨酸。通过对发酵条件的优化，例如提高投糖量(即提高发酵培养基配方中葡萄糖的浓度)、控制培养风量，在保证培养所需的氧气量同时，通过控制发酵过程中培养温度、ph值等，突破性的提高了l-丙氨酸发酵产酸率，缩短了发酵周期。此外，采用本发明发酵方法，还可以降低发酵罐的染菌风险。当发酵罐内发酵液产酸浓度大于10g/dl，且残还原糖小于0.2％(w/w)，产酸浓度趋于稳定后，即停止培养，将发酵液进一步提取可得到l-丙氨酸产品。采用本发明发酵方法发酵生产l-丙氨酸，周期小于60小时，发酵转化率大于84％，产酸大于10％，效果显著，是一种周期短、产率高的l-丙氨酸发酵方法。具体实施方式下面对本发明的技术方案进行详细说明。本发明提供的l-丙氨酸的发酵生产方法，采用一次性投料方式将发酵培养基投入发酵罐内，之后高温灭菌，降温至32～37℃后向发酵罐内再移入培养好的种子，发酵培养生产l-丙氨酸；其中，发酵培养基的配方为：葡萄糖浓度10～15％，磷酸氢二铵浓度0.0015～0.0025％，磷酸二氢铵浓度0.0005～0.0015％，甜菜碱浓度0.0001～0.0003％，七水硫酸镁浓度0.0003～0.0005％；ph值为6.7～7.0；以上浓度均为质量百分比浓度；发酵培养的条件为：培养温度36～38℃，压力0.02～0.04mpa，ph值6.7～7.0，通风量2600～2900m3/h；种子的接入量为发酵培养基重量的8～12％。其中，种子的培养方法为：将种子培养基泵入空消的种子罐，经高温灭菌，之后降温至34～36℃，然后按8～12％的重量比例接入菌种，培养至od值为0.5～0.7，优选为培养至od值为0.5～0.6，结束培养，得到培养好的种子。种子培养基配方为：酵母膏1～3重量份，蛋白胨3～5重量份，氯化钠3～5重量份，自来水900～1100重量份；ph值6.0～7.0。种子的培养条件为：培养温度36.5～37.5℃，ph值6.5～7.5，压力0.4～0.6mpa，通风量7.0～11.0m3/h。下面通过具体实施例说明。实施例1本实施例提供的l-丙氨酸发酵生产方法，采用的发酵培养基的配方为：葡萄糖浓度14％，磷酸氢二铵浓度0.002％，磷酸二氢铵浓度0.001％，甜菜碱浓度0.0002％，七水硫酸镁浓度0.0004％；ph值为6.9；以上浓度均为质量百分比浓度。采用一次性投料方式将发酵培养基投入空消的发酵罐内，发酵罐容积240m3，发酵液体积180m3，空消温度123-125℃，之后发酵罐内物料于121℃下灭菌30min，然后降温至35℃，之后向发酵罐内再移入培养好的种子，然后在下述发酵培养条件下培养发酵：培养温度36～38℃，压力保持在0.02～0.04mpa，ph值6.7～7.0，通风量控制为2700m3/h；当发酵罐内发酵液中l-丙氨酸产率浓度大于10g/dl，残还原糖质量百分比含量小于0.2％且不呈下降趋势时，发酵培养结束。向发酵罐内移入培养好的种子时，培养好的种子的接入量为发酵培养基重量的10％。移入的培养好的种子的培养过程为：将种子培养基泵入空消的种子罐，空消温度123-125℃，之后种子罐内物料于121℃下灭菌30min，之后降温至35℃，然后按10％(质量百分数)的比例接入菌种，所用菌种为德氏乳杆菌突变菌株，商业途径购买得到，培养至od值为0.6，结束培养，得到培养好的种子。其中，种子培养基的配比为：酵母膏2g，蛋白胨4g，氯化钠4g，自来水1l；ph值6.9。种子的培养条件为：培养温度约37℃，ph值控制在6.5～7.5，压力0.5mpa，通风量7.0～8.0m3/h。其中，向发酵罐内移入培养好的种子时，种子罐压力0.5±0.1mpa，发酵罐压力0.03±0.01mpa，可以保证移种顺利进行，二级种子罐内发酵液平板实验结果为非染菌状态方可移种。本实施例发酵试验，发酵周期为57小时，l-丙氨酸产率10.55％，转化率达到84.82％。实施例2参照实施例1的方法，采用的发酵培养基的配方为：葡萄糖浓度15％，磷酸氢二铵浓度0.002％，磷酸二氢铵浓度0.001％，甜菜碱浓度0.0002％，七水硫酸镁浓度0.0004％；ph值为6.9；其中的百分数(％)均为质量百分数。发酵培养条件为：培养温度36～38℃，压力保持在0.02～0.04mpa，ph值6.7～7.0，通风量控制为2700m3/h。得到实施例2，实施例2的发酵周期、l-丙氨酸产率和转化率见下表所示。表1实施例发酵周期(h)l-丙氨酸产率(％)转化率(％)254.511.5982.77实施例2相比实施例1增加了初糖量，即发酵培养基配方中葡萄糖浓度提到15％，但发酵培养条件不变，通风量控制为2700m3/h，转化率降低，说明在提高初糖量时，还需要提高培养风量，以保证培养所需的氧气量。实施例3参照实施例1的步骤，采用的发酵培养基的配方为：葡萄糖浓度15％，磷酸氢二铵浓度0.002％，磷酸二氢铵浓度0.001％，甜菜碱浓度0.0002％，七水硫酸镁浓度0.0004％；ph值为6.8；其中的百分数(％)均为质量百分数。发酵培养条件为：培养温度36～38℃，压力保持在0.02～0.04mpa，ph值6.7～7.0，通风量控制为2900m3/h。得到实施例3，实施例3的发酵周期、l-丙氨酸产率和转化率见下表所示。表2实施例发酵周期(h)l-丙氨酸产率(％)转化率(％)35012.6585.31实施例3相比实施例2提高了通风量，通风量控制为2900m3/h，转化率明显提升。说明发酵培养基配方中葡萄糖浓度提到15％，控制通风量为2900m3/h，培养效果最佳，发酵周期短，为50小时，l-丙氨酸产率达到12.65％，转化率提高到85.31％。此外还发现，采用流加物料的发酵方式，在常规l-丙氨酸发酵中，使用本实验室的相同设备，从一级种子罐到发酵罐因染菌而无法继续进行发酵的批次占总试验批次的3.6％。而采用一次性投料的发酵方式，一级种子罐到发酵罐因染菌而无法继续进行发酵的批次仅占总试验批次的0.8％。由此可见，采用本发明的一次性投料发酵方法能够有效降低种子罐的染菌风险。当前第1页12