本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胶原的提取方法。
背景技术：
胶原是由动物细胞合成的一种具有三股超螺旋结构的高分子蛋白，具有良好的生物学特性，是结缔组织的主要结构蛋白。在牛、猪和羊等动物真皮中，约70％是胶原。
动物真皮中的胶原提取纯化后可作为组织的支持物，对细胞、组织乃至器官行使正常功能，并对外伤修复有很好的辅助效果。相对于其他年龄段的动物真皮中提取的胶原，胎皮(包含胎牛皮、胎猪皮和胎羊皮等)具有胶原稳定、易提取、胶原含量较高等优点，所以更适用于美容填充、细胞支架、矫形、组织损伤修复、创面止血等生物医用材料领域。
胎皮在提取胶原时，虽然比成年动物皮毛的预处理容易，但是在其他步骤中如果控制不当会导致胶原提取的不充分，损耗胶原，且胎皮相对成本较高，如果胶原提取不充分，整个损失较大。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种胶原的提取方法，在使用动物胎皮进行胶原提取时，能够提高胶原的收率，易操作，成本低。
本发明的目的主要由原材料前处理-脱脂-消化-纯化等技术实现，其详细步骤如下：
提供经预处理后的动物胎皮；
将所述预制件经过脂肪处理剂浸泡处理，并用梯度浓度的酒精进行清洗，进行脱脂处理；
将所述脱脂处理后的预制件，在酶消化液中进行消化处理；
将所述消化处理后的混合物进行过滤、溶解、盐析、透析，得到胶原。
优选的，所述预处理具体为：
将动物胎皮进行1～2次盐洗后，再去除残留盐水；
将盐洗后的动物胎皮在碱性溶液中碱洗1～8h，并洗涤至中性；
将所述碱洗后的动物胎皮进行反复的冷冻解冻操作，并去除表皮和皮下脂肪；
将去除表皮和皮下脂肪的动物胎皮在缓冲溶液中进行缓冲清洗，然后再洗涤至中性；
将缓冲清洗后的动物胎皮进行反复冷冻解冻操作，得到预制件。
优选的，所述预处理中原料与预处理液体总重的重量比预处理夜过量。
优选的，所述脱脂处理具体为：
将所述预制件在脂肪酶和/或有机溶剂浸泡处理，然后在梯度酒精中浸泡，浸泡后进行清洗；
优选的，所述预制件与脂肪酶或有机溶剂的体积比为1：5。
优选的，所述梯度酒精浸泡具体为，在体积浓度为98％酒精重浸泡4～8h，在体积浓度为60-70％酒精重浸泡2～6h，在体积浓度为20～40％酒精中浸泡0.5～2h。
优选的，所述有机溶剂选自乙醇、氯仿、乙醚、或丙酮。
优选的，所述消化处理具体为：
在超声波环境中，将脱脂处理后的预制件在酶消化液浸泡直至消化完全；所述脱脂处理后的预制件与所述酶消化液的重量比为1:5-15。
优选的，所述酶消化液选自，ph值为2.0-3.0的胃蛋白酶的酸性溶液。
优选的，将消化处理后的混合物用50-200目滤网过滤去除未消化组织和杂质；
并加入盐直至盐完全溶解，盐析15-30小时；
排出下清将析出胶原加入透析袋(10-80kd)中透析5-10天，每天换液2-3次，得到纯化后的胶原。
本发明提供了一种胶原的提取方法，包括，提供经预处理后的动物胎皮，得到预制件；将所述预制件经过脂肪处理剂浸泡处理，并用梯度浓度的酒精进行清洗，进行脱脂处理；将所述脱脂处理后的预制件，在酶消化液中进行消化处理；将所述消化处理后的混合物进行过滤、溶解、盐析、透析，得到胶原。本发明以毛发尚未成形的胎皮做原材料可提出相对稳定、纯度较高的胶原。利用碱及高浓度盐使胎皮反复溶胀及冻融的方法，可明显使胎皮分为三层即(表皮、真皮和皮下脂肪)可用刮棒快速除去表皮和皮下脂肪留取真皮以便胶原蛋白的提取，与此同时，此方法还可有效的去除非胶原杂蛋白，并通过增加脂肪处理剂和酶消化液，提高胶原的纯度和收率。选用适当的超声时间及功率辅助酶法可有效提高胶原蛋白提取效率，节省胶原消化提取时间，得到的胶原最大程度地保持了其天然结构适合用作生物医用材料。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
为了进一步详细说明本发明技术方案，具体的胶原提取步骤如下：
本发明具体实施方式中提到的收率是指胶原的重量和原料重量的比例。
为了解决本发明的技术问题，本发明提供了一种胶原的提取方法，
提供经预处理后的动物胎皮，得到预制件；将所述预制件经过脂肪处理剂浸泡处理，并用梯度浓度的酒精进行清洗，进行脱脂处理；将所述脱脂处理后的预制件，在酶消化液中进行消化处理；将所述消化处理后的混合物进行过滤、溶解、盐析、透析，得到胶原。
预处理是对皮毛上的杂质，毛发进行清洗并且将脂肪层和真皮层以及胶原进行分离的步骤，是为后续进行脱脂、消化和纯化的步骤提供良好基础的先决条件，又由于本发明提供的是动物胎皮，所以毛发较软且真皮层和脂肪较少，相对发育不成熟，在预处理过程中，虽然条件要求并不苛刻，但是要谨慎处理，防止对动物胎皮胶原的破坏。
本发明预处理步骤具体为：将动物胎皮进行1～2次盐洗后，再去除残留盐水；将盐洗后的动物胎皮在碱性溶液中碱洗1～8h，并洗涤至中性；将所述碱洗后的动物胎皮进行反复的冷冻解冻操作，并去除表皮和皮下脂肪；将去除表皮和皮下脂肪的动物胎皮在缓冲溶液中进行缓冲清洗，然后再洗涤至中性；将缓冲清洗后的动物胎皮进行反复冷冻解冻操作，得到预制件。
其中，所述盐洗优选使用氯化钠(nacl)水溶液，能够有效清洗胎皮表面的杂质，并且具有一定的溶胀作用，使动物胎皮脱水。所述nacl的浓度优选为0.2～0.5m/l，更优选为0.3～0.4m/l。洗涤时间优选1～5h，更优选为2～4h，所述盐洗优选先清洗一次，倒掉清洗液，换新的氯化钠水溶液，重复清洗，清洗过程中不断进行搅拌。
盐洗后，优选用去离子水除去所述动物胎皮表面残留的氯化钠水溶液，在碱性溶液中碱洗，所述碱性水溶液优选为氢氧化钠naoh，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.05～0.5m/l，更优选为0.08～0.2m/l。碱洗时间优选为1～8h，更优选为2～6h，碱洗一次完成后，换新的氢氧化钠水溶液再重复碱洗2次，清洗过程中不断进行搅拌。碱洗完成后，用去离子水，洗涤至中性。
在碱洗完成后，还优选使用nacl-tris-hcl水溶液清洗所述动物胎皮，所述nacl-tris-hcl水溶液的浓度优选为1～5m/l，清洗时间优选为1～3h，优选重复冲洗1～2次，再用去离子水清洗至中性。这里使用缓冲溶液的目的是为了更进一步的去除残留的细胞组织。
第一次缓冲液冲洗完后，在-90℃～-70℃冻存10-18小时后取出解冻，如此反复冻融共2次，最后一次解冻后刮去表皮和皮下脂肪，注意不能破坏胶原，所以在刮去表皮和皮下脂肪时，需要很小心。
最后一次解冻以后再次加入nacl-tris-hcl水溶液进行第二次缓冲清洗，所述nacl-tris-hcl水溶液的浓度优选为1～5m/l，清洗时间优选为1～3h，优选重复冲洗1～2次，再用去离子水清洗至中性。这里使用缓冲溶液的目的是为了更进一步的去除残留的细胞组织。
优选的，第二次缓冲冲洗后，将所述动物胎皮平铺于2cm托盘中置-80℃冻存10-18小时后取出解冻，待其尚未完全解冻时，用切刀将其切成约1cm2片块，得到预制件。
按照本发明，所述预处理中动物胎皮的重量与所有的预处理液体总重相比动物胎皮的重量均可以过量，但是为了避免浪费，更有选的所述预处理液体的总重量选择动物胎皮重量的6倍，所述预处理液体包括氯化钠、氢氧化钠和nacl-tris-hcl溶液以及清水。
将所述预制件在脂肪酶和/或有机溶剂浸泡处理，然后在梯度酒精中浸泡，浸泡后进行清洗；所述预制件与脂肪酶或有机溶剂的体积比为1：5。所述梯度酒精浸泡具体为，在体积浓度为98％酒精重浸泡4～8h，在体积浓度为60-70％酒精重浸泡2～6h，在体积浓度为20～40％酒精中浸泡0.5～2h。
所述有机溶剂选自乙醇、氯仿、乙醚、或丙酮。
所述消化处理具体为：在超声波环境中，将脱脂处理后的预制件在酶消化液浸泡直至消化完全；所述脱脂处理后的预制件与所述酶消化液的重量比为1:5-15。所述酶消化液选自，ph值为2.0-3.0的胃蛋白酶的酸性溶液。。
所述酶消化液醋酸、柠檬酸、盐酸等溶液作溶剂将胃蛋白酶溶于其中ph＝2.0-3.0，材料与胃蛋白酶的比重为100:1-7。
所述超声波选用超声时间20-60min、超声功率50w-300w的超声波辅助提取。
将消化处理后的混合物用50-200目滤网过滤去除未消化组织和杂质；并加入盐至盐完全溶解，所述盐为nacl，最终浓度为1m/l，盐析15-30小时；排出下清，加入2倍体积的0.01m/l盐酸溶液超声波辅助溶解5～10小时，加入研碎的nacl至浓度为2.5m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析15～30小时；排除下清将沉淀加入透析袋(10～80kd)中透析5～10天，每8-10小时换液1次，后低温无菌保存。
所述超声波辅助溶解：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
以上操作过程无特殊说明均为无菌操作，在4℃条件下进行。
以下为本发明具体实施例：
实施例1
下面以毛发尚未成形的胎牛皮做原材料制备一种生物医疗胶原材料的提取其步骤如下：
(1)原材料前处理
将毛发尚未成形的胎牛皮整张取下，用0.4m/lnacl搅拌清洗2小时，重复搅拌清洗过程2次，再用去离子水清洗2次；置0.1m/lnaoh中搅拌清洗4小时，重复搅拌2次，去离子水清洗至中性；加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗3次；置-80℃冻存10-18小时后取出解冻，如此反复冻融共2次，最后一次解冻后轻轻刮去表皮和皮下脂肪，再次加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗4次。平铺于2cm托盘中置-80℃冻存10-18小时后取出解冻，待其尚未完全解冻时，用切刀将其切成约1cm2片块。
以上操作中原料与处理液体重比为1：6。
(2)脱脂
用乙醇：氯仿为1:1混合液处将述步骤(1)所得材料浸泡24小时，每8小时换液1次，原料与处理液体重比为1:4，梯度酒精清洗后用去离子水清洗5次。
所述梯度酒精为：98％酒精浸泡6h，60％酒精浸泡3h，20％酒精浸泡1h。
(3)消化
将步骤(2)所得材料置于酶消化液中并用超声波辅助消化分解，胎牛皮材料与消化液的比重为1：3，搅拌消化8小时使其消化完全。
所述酶消化液：0.01m/l盐酸溶液作溶剂将胃蛋白酶溶于其中，胎牛皮材料与胃蛋白酶的比重为100：3。
所述超声波辅助消化：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
(4)纯化
将步骤(3)所得材料用双层50目滤网过滤去除未消化组织；加入研碎的nacl至浓度为1m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时，排除下清并加入2倍体积的0.01m/l盐酸溶液超声波辅助溶解8小时，加入研碎的nacl至浓度为2.5m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时；排除下清将沉淀加入透析袋(50kd)中透析8天，每8-10小时换液1次，后低温无菌保存。
所述超声波辅助溶解：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
以上操作过程无特殊说明均为无菌操作，在4℃条件下进行。
提取的胶原占原料的重量比为92.6％
实施例2
下面以毛发尚未成形的胎猪皮做原材料制备一种生物医疗胶原的材料，其步骤如下：
(1)原材料前处理
将毛发尚未成形的胎牛皮整张取下，用0.4m/lnacl搅拌清洗2小时，重复搅拌两次2次，再用去离子水清洗2次；置0.1m/lnaoh中搅拌清洗4小时，重复搅拌2次，去离子水清洗至中性；加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗3次；置-80℃冻存10-18小时后取出解冻，如此反复冻融共2次，最后一次解冻后轻轻刮去表皮和皮下脂肪，再次加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗4次。平铺于2cm托盘中置-20℃冻存10-18小时后取出解冻，待其尚未完全解冻时，用切刀将其切成约1cm2片块。
以上操作中原料与处理液体积比为1：6。
(2)脱脂
用乙醚：氯仿为1:2混合液处将述步骤(1)所得材料浸泡24小时，每8小时换液1次，原料与处理液体积比为1:3，梯度酒精清洗后用去离子水清洗5次。
所述梯度酒精为：98％酒精浸泡6h，70％酒精浸泡3h，20％酒精浸泡1h，原料与处理液体积比为1:5。
(3)消化
将步骤(2)所得材料置于酶消化液中并用超声波辅助消化分解，胎牛皮材料与消化液的体积比为1：4，搅拌消化8小时使其消化完全。
所述酶消化液：0.4m-0.6m醋酸溶液作溶剂将胃蛋白酶溶于其中，胎牛皮材料与胃蛋白酶的比重为100：3。
所述超声波辅助消化：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
(4)纯化
将步骤(3)所得材料用双层50目滤网过滤去除未消化组织；加入研碎的nacl至浓度为1m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时，排除下清并加入2倍体积的0.01m/l盐酸溶液超声波辅助溶解8小时，入研碎的nacl至浓度为2.5m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时；排除下清将沉淀加入透析袋(50kd)中透析8天，每8-10小时换液1次，后低温无菌保存。
所述超声波辅助溶解：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
提取的胶原占原料的重量比为89.7％
实施例3
下面以毛发尚未成形的胎猪皮做原材料制备一种生物医疗胶原的材料，其步骤如下：
(1)原材料前处理
将毛发尚未成形的胎牛皮整张取下，用0.4m/lnacl搅拌清洗2小时，重复搅拌两次2次，再用去离子水清洗2次；置0.1m/lnaoh中搅拌清洗4小时，重复搅拌2次，去离子水清洗至中性；加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗3次；置-80℃冻存10-18小时后取出解冻，如此反复冻融共2次，最后一次解冻后轻轻刮去表皮和皮下脂肪，再次加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗4次。平铺于2cm托盘中置-20℃冻存10-18小时后取出解冻，待其尚未完全解冻时，用切刀将其切成约1cm2片块。
以上操作中原料与处理液体积比为1：6。
(2)脱脂
用乙醚：氯仿为1:2混合液处将述步骤(1)所得材料浸泡24小时，每8小时换液1次，原料与处理液体积比为1:3，梯度酒精清洗后用去离子水清洗5次。
所述梯度酒精为：98％酒精浸泡6h，70％酒精浸泡3h，20％酒精浸泡1h，原料与处理液体积比为1:5。
(3)消化
将步骤(2)所得材料置于酶消化液中并用超声波辅助消化分解，胎牛皮材料与消化液的体积比为1：4，搅拌消化8小时使其消化完全。
所述酶消化液：0.6m-0.8m醋酸溶液作溶剂将木瓜蛋白酶溶于其中，胎牛皮材料与木瓜蛋白酶的比重为100：3。
所述超声波辅助消化：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
(4)纯化
将步骤(3)所得材料用双层50目滤网过滤去除未消化组织；加入研碎的nacl至浓度为1m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时，排除下清并加入2倍体积的0.01m/l盐酸溶液超声波辅助溶解8小时，入研碎的nacl至浓度为2.5m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时；排除下清将沉淀加入透析袋(50kd)中透析8天，每8-10小时换液1次，后低温无菌保存。
所述超声波辅助溶解：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
提取的胶原占原料的重量比为86％
实施例4
(1)原材料前处理
将毛发尚未成形的胎牛皮整张取下，用0.4m/lnacl搅拌清洗2小时，重复搅拌两次2次，再用去离子水清洗2次；置0.1m/lnaoh中搅拌清洗4小时，重复搅拌2次，去离子水清洗至中性；加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗3次；置-80℃冻存10-18小时后取出解冻，如此反复冻融共2次，最后一次解冻后轻轻刮去表皮和皮下脂肪，再次加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗4次。平铺于2cm托盘中置-20℃冻存10-18小时后取出解冻，待其尚未完全解冻时，用切刀将其切成约1cm2片块。
以上操作中原料与处理液体积比为1：6。
(2)脱脂
用乙醚：氯仿为1:2混合液处将述步骤(1)所得材料浸泡24小时，每8小时换液1次，原料与处理液体积比为1:3，梯度酒精清洗后用去离子水清洗5次。
所述梯度酒精为：98％酒精浸泡6h，70％酒精浸泡3h，20％酒精浸泡1h，原料与处理液体积比为1:5。
(3)消化
将步骤(2)所得材料置于酶消化液中并用超声波辅助消化分解，胎牛皮材料与消化液的体积比为1：4，搅拌消化8小时使其消化完全。
所述酶消化液：0.4m-0.6m醋酸溶液作溶剂将胃蛋白酶溶于其中，胎牛皮材料与胃蛋白酶的比重为100：3。
所述超声波辅助消化：利用20khz超声波，超声时间20min、超声功率150w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
(4)纯化
将步骤(3)所得材料用双层50目滤网过滤去除未消化组织；加入研碎的nacl至浓度为1m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时，排除下清并加入2倍体积的0.01m/l盐酸溶液超声波辅助溶解8小时，入研碎的nacl至浓度为2.5m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时；排除下清将沉淀加入透析袋(50kd)中透析8天，每8-10小时换液1次，后低温无菌保存。
所述超声波辅助溶解：利用20khz超声波，超声时间20min、超声功率150w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
提取的胶原占原料的重量比为85.6％
对比例1
(1)原材料前处理
将成年牛皮整张取下，用0.4m/lnacl搅拌清洗2小时，重复搅拌两次2次，再用去离子水清洗2次；置0.1m/lnaoh中搅拌清洗4小时，重复搅拌2次，去离子水清洗至中性；加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗3次；置-80℃冻存10-18小时后取出解冻，如此反复冻融共2次，最后一次解冻后轻轻刮去表皮和皮下脂肪，再次加入4m/lnacl+0.01m/ltris-hcl溶液中搅拌清洗2小时，去离子水清洗4次。平铺于2cm托盘中置-20℃冻存10-18小时后取出解冻，待其尚未完全解冻时，用切刀将其切成约1cm2片块。
以上操作中原料与处理液体积比为1：6。
(2)脱脂
用乙醚：氯仿为1:2混合液处将述步骤(1)所得材料浸泡24小时，每8小时换液1次，原料与处理液体积比为1:3，梯度酒精清洗后用去离子水清洗5次。
所述梯度酒精为：98％酒精浸泡6h，70％酒精浸泡3h，20％酒精浸泡1h，原料与处理液体积比为1:5。
(3)消化
将步骤(2)所得材料置于酶消化液中并用超声波辅助消化分解，胎牛皮材料与消化液的体积比为1：4，搅拌消化8小时使其消化完全。
所述酶消化液：0.4m-0.6m醋酸溶液作溶剂将胃蛋白酶溶于其中，胎牛皮材料与胃蛋白酶的比重为100：3。
所述超声波辅助消化：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
(4)纯化
将步骤(3)所得材料用双层50目滤网过滤去除未消化组织；加入研碎的nacl至浓度为1m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时，排除下清并加入2倍体积的0.01m/l盐酸溶液超声波辅助溶解8小时，入研碎的nacl至浓度为2.5m/l，充分搅拌至其完全溶解，盐析30小时；排除下清将沉淀加入透析袋(50kd)中透析8天，每8-10小时换液1次，后低温无菌保存。
所述超声波辅助溶解：利用20khz超声波，超声时间30min、超声功率200w时的胶原蛋白提取率最大超声波辅助提取。
提取的胶原占原料的重量比为41.2％
以上操作过程无特殊说明均为无菌操作，在4℃条件下进行。
通过上述实施例的数据和对比例，不难发现，本发明提供的方法在解决现有技术问题上，效果是现有技术的2倍以上，胶原的提取率高，操作较为简便。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。