本发明关于检测鱼病原体的方法，特别是关于使用寡核苷酸对检测鱼病原体的方法。
背景技术：
：水产动物是人类重要的能量、蛋白质与必需营养的来源之一。大量捕捞野生水产动物对海洋资源耗尽的疑虑，使得水产养殖业日益受到重视。根据联合国粮食及农业组织的统计，水产养殖对全球捕捞及养殖总产量的贡献逐步提升，从2000年的25.7％增至2016年的46.8％。然而，密集养殖加上管理不良可能造成水产动物容易感染疾病、死亡，而造成渔民的损失。此外，水产动物的病害多由细菌或病毒引起，细菌性疾病与病毒性疾病的处理方法相差甚远，一旦误诊，处理不当，就会造成巨大的损失。由此可见，在饲养渔场、虾场密集监控疾病对管理而言是不可或缺的一环。本发明即提供了快速、方便的鱼病原体检测方法以供产业利用。技术实现要素：于一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法，包含提供一可能含有一鱼病原体的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphates,datps)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphates,dctps)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphates,dgtps)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphates,dttps)，以形成一聚合酶链锁反应(polymerasechainreaction,pcr)混合物；透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述pcr混合物进行热对流聚合酶链锁反应(convectivepolymerasechainreaction,cpcr)，以形成一pcr产物；以及侦测所述pcr产物以辨识所述双股目标序列。在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(pcr)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制。于另一方面，本发明涉及一种用于侦测鱼病原体的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物。在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针具有一寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。在某些实施方案中，所述病原体为鱼呼吸道与肠道病毒(piscinereovirus,prv)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:1与seqidno:2、seqidno:4与seqidno:2、seqidno:4与seqidno:5、seqidno:6与seqidno:7、seqidno:9与seqidno:10，以及seqidno:11与seqidno:12。在某些实施方案中，所述病原体为鱼呼吸道与肠道病毒(prv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:1与seqidno:2时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的l1区段基因(genbankaccessionno.ky429943)的第71至第95个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:3所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼呼吸道与肠道病毒(prv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:4与seqidno:2时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的l1区段基因(genbankaccessionno.ky429943)的第52至第95个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:3所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼呼吸道与肠道病毒(prv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:4与seqidno:5时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的l1区段基因(genbankaccessionno.ky429943)的第52至第100个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:3所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼呼吸道与肠道病毒(prv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:6与seqidno:7时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的sigma3蛋白基因(genbankaccessionno.kx844958)的第343至第385个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:8所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼呼吸道与肠道病毒(prv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:9与seqidno:10时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的sigma3蛋白基因(genbankaccessionno.kx844958)的第350至第380个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:8所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼呼吸道与肠道病毒(prv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:11与seqidno:12时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的l1区段基因(genbankaccessionno.ky429943)的第280至第315个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:13所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,ipnv)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:14与seqidno:15、seqidno:17与seqidno:18、seqidno:20与seqidno:21，以及seqidno:23与seqidno:24。在某些实施方案中，所述病原体为感染性胰脏坏死病毒(ipnv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:14与seqidno:15时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的vp5与多聚蛋白(polyprotein)基因(genbankaccessionno.ky548514)的第2010至第2057个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:16所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性胰脏坏死病毒(ipnv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:17与seqidno:18时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的vp5与多聚蛋白(polyprotein)基因(genbankaccessionno.ky548514)的第2345至第2408个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:19所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性胰脏坏死病毒(ipnv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:20与seqidno:21时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的vp5与多聚蛋白(polyprotein)基因(genbankaccessionno.ky548514)的第2533至第2580个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:22所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性胰脏坏死病毒(ipnv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:23与seqidno:24时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的vp5与多聚蛋白(polyprotein)基因(genbankaccessionno.ky548514)的第2775至第2818个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:25所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性鲑鱼贫血病毒(infectioussalmonanemiavirus,isav)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:26与seqidno:27、seqidno:29与seqidno:30、seqidno:32与seqidno:33、seqidno:35与seqidno:36，以及seqidno:37与seqidno:38。在某些实施方案中，所述病原体为感染性鲑鱼贫血病毒(isav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:26与seqidno:27时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的开放读码框(openreadingframe,orf)1与orf2基因(genbankaccessionno.kx424589)的第282至第328个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:28所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性鲑鱼贫血病毒(isav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:29与seqidno:30时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的orf1与orf2基因(genbankaccessionno.kx424589)的第79至第121个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:31所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性鲑鱼贫血病毒(isav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:32与seqidno:33时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的orf1与orf2基因(genbankaccessionno.kx424589)的第244至第273个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:34所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性鲑鱼贫血病毒(isav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:35与seqidno:36时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的orf1与orf2基因(genbankaccessionno.kx424589)的第237至第272个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:34所示。在某些实施方案中，所述病原体为感染性鲑鱼贫血病毒(isav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:37与seqidno:38时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的orf1与orf2基因(genbankaccessionno.kx424589)的第235至第286个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:34所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼心肌炎病毒(piscinemyocarditisvirus,pmcv)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:39与seqidno:40、seqidno:42与seqidno:43、seqidno:45与seqidno:46、seqidno:48与seqidno:49、seqidno:51与seqidno:49，以及seqidno:52与seqidno:49。在某些实施方案中，所述病原体为鱼心肌炎病毒(pmcv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:39与seqidno:40时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组(genbankaccessionno.hq339954)的第6266至第6306个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:41所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼心肌炎病毒(pmcv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:42与seqidno:43时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组(genbankaccessionno.hq339954)的第5632至第5672个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:44所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼心肌炎病毒(pmcv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:45与seqidno:46时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组(genbankaccessionno.hq339954)的第5693至第5747个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:47所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼心肌炎病毒(pmcv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:48与seqidno:49时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组(genbankaccessionno.hq339954)的第6294至第6331个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:50所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼心肌炎病毒(pmcv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:51与seqidno:49时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组(genbankaccessionno.hq339954)的第6271至第6331个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:50所示。在某些实施方案中，所述病原体为鱼心肌炎病毒(pmcv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:52与seqidno:49时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组(genbankaccessionno.hq339954)的第6290至第6331个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:50所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼甲病毒(salmonidalphavirus,sav)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:53与seqidno:54、seqidno:56与seqidno:57、seqidno:59与seqidno:60、seqidno:62与seqidno:63，以及seqidno:65与seqidno:66。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼甲病毒(sav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:53与seqidno:54时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼甲病毒(sav)的基因组(genbankaccessionno.kc122926)的第611至第653个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:55所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼甲病毒(sav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:56与seqidno:57时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼甲病毒(sav)的基因组(genbankaccessionno.kc122926)的第145至第181个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:58所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼甲病毒(sav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:59与seqidno:60时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼甲病毒(sav)的基因组(genbankaccessionno.kc122926)的第2691至第2761个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:61所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼甲病毒(sav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:62与seqidno:63时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼甲病毒(sav)的基因组(genbankaccessionno.kc122926)的第1032至第1075个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:64所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼甲病毒(sav)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:65与seqidno:66时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼甲病毒(sav)的基因组(genbankaccessionno.kc122926)的第969至第1011个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:67所示。在某些实施方案中，所述病原体为佩鲁兰新副变形虫(neoparamoebaperurans)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:68与seqidno:69、seqidno:71与seqidno:72、seqidno:74与seqidno:75，以及seqidno:77与seqidno:78。在某些实施方案中，所述病原体为佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:68与seqidno:69时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的18s核糖体核糖核酸(ribosomalrna,rrna)基因(genbankaccessionno.ku985058)的第462至第520个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:70所示。在某些实施方案中，所述病原体为佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:71与seqidno:72时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的18srrna基因(genbankaccessionno.ku985058)的第355至第405个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:73所示。在某些实施方案中，所述病原体为佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:74与seqidno:75时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的18srrna基因(genbankaccessionno.ku985058)的第234至第281个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:76所示。在某些实施方案中，所述病原体为佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:77与seqidno:78时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的18srrna基因(genbankaccessionno.ku985058)的第357至第380个核苷酸之间的13至24个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:79所示。在某些实施方案中，所述病原体为candidatusbranchiomonascysticola(cbc)且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:80与seqidno:81，以及seqidno:83与seqidno:84。在某些实施方案中，所述病原体为ca.b.cysticola(cbc)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:80与seqidno:81时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体ca.b.cysticola的16s核糖体核糖核酸(ribosomalrna,rrna)基因(genbankaccessionno.jq723599)的第1068至第1125个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:82所示。在某些实施方案中，所述病原体为ca.b.cysticola(cbc)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:83与seqidno:84时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体ca.b.cysticola的16srrna基因(genbankaccessionno.jq723599)的第1212至第1241个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:85所示。在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:86与seqidno:87、seqidno:89与seqidno:90、seqidno:92与seqidno:93、seqidno:95与seqidno:97，以及seqidno:96与seqidno:97。在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:86与seqidno:87时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫d.lepeophtherii的16s核糖体核糖核酸(ribosomalrna,rrna)基因(genbankaccessionno.jq723599)的第967至第1010个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:88所示。在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:89与seqidno:90时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫d.lepeophtherii的16srrna基因(genbankaccessionno.jq723599)的第1246至第1285个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:91所示。在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:92与seqidno:93时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫d.lepeophtherii的16srrna基因(genbankaccessionno.jq723599)的第1366至第1414个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:94所示。在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:95与seqidno:97时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫d.lepeophtherii的16srrna基因(genbankaccessionno.jq723599)的第815至第859个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:98所示。在某些实施方案中，所述病原体为微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:96与seqidno:97时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体微孢子虫d.lepeophtherii的16srrna基因(genbankaccessionno.jq723599)的第817至第859个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:98所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼腮痘病毒(salmongillpoxvirus,sgpv)且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:99与seqidno:100、seqidno:102与seqidno:103、seqidno:105与seqidno:106，以及seqidno:108与seqidno:109。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼腮痘病毒(sgpv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:99与seqidno:100时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的基因组(genbankaccessionno.kt159937)的第99272至第99318个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:101所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼腮痘病毒(sgpv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:102与seqidno:103时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的基因组(genbankaccessionno.kt159937)的第123213至第123239个核苷酸之间的13至27个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:104所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼腮痘病毒(sgpv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:105与seqidno:106时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的基因组(genbankaccessionno.kt159937)的第123202至第123232个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:107所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼腮痘病毒(sgpv)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:108与seqidno:109时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的基因组(genbankaccessionno.kt159937)的第123556至第123610个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:110所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼立克次体(piscirickettsiasalmonis)且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:111与seqidno:113、seqidno:114与seqidno:115、seqidno:116与seqidno:117、seqidno:119与seqidno:120，以及seqidno:122与seqidno:123。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼立克次体(p.salmonis)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:111与seqidno:112时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16s核糖体核糖核酸(ribosomalrna,rrna)基因(genbankaccessionno.ay498634)的第952至第1065个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:113所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼立克次体(p.salmonis)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:114与seqidno:115时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16srrna基因(genbankaccessionno.ay498634)的第1014至第1050个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:113所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼立克次体(p.salmonis)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:116与seqidno:117时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16srrna基因(genbankaccessionno.ay498634)的第315至第331个核苷酸之间的13至17个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:118所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼立克次体(p.salmonis)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:119与seqidno:120时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16srrna基因(genbankaccessionno.ay498634)的第529至第545个核苷酸之间的13至17个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:121所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼立克次体(p.salmonis)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:122与seqidno:123时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16srrna基因(genbankaccessionno.ay498634)的第1181至第1200个核苷酸之间的13至20个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:124所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼肾菌(renibacteriumsalmoninarum)且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：seqidno:126与seqidno:128、seqidno:127与seqidno:128、seqidno:130与seqidno:131、seqidno:133与seqidno:134，以及seqidno:136与seqidno:137。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:125与seqidno:128时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(extracellularproteinprecursor,ecp)基因(genbankaccessionno.z12174)的第1035至第1065个核苷酸之间的13至31个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:129所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:126与seqidno:128时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因(genbankaccessionno.z12174)的第1024至第1065个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:129所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:127与seqidno:128时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因(genbankaccessionno.z12174)的第1037至第1065个核苷酸之间的13至29个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:129所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:130与seqidno:131时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因(genbankaccessionno.z12174)的第782至第806个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:132所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:133与seqidno:134时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因(genbankaccessionno.z12174)的第880至第964个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:135所示。在某些实施方案中，所述病原体为鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为seqidno:136与seqidno:137时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因(genbankaccessionno.z12174)的第646至第738个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如seqidno:138所示。本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。具体实施方式于一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法。在某些实施方案中，所述方法为聚合酶链锁反应(polymerasechainreaction,pcr)。在某些实施方案中，所述方法为反转录聚合酶链锁反应(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction,rt-pcr)。在某些实施方案中，所述方法为热对流聚合酶链锁反应(convectivepolymerasechainreaction,cpcr)。在某些实施方案中，所述方法为实时聚合酶链锁反应(real-timepolymerasechainreaction,real-timepcr)。于一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法，包含:提供一可能含有鱼病原体的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(datps)、脱氧胞核苷三磷酸(dctps)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtps)，以及脱氧胸苷三磷酸(dttps)，以形成一聚合酶链锁反应(pcr)混合物；透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述pcr混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cpcr)，以形成一pcr产物；以及侦测所述pcr产物以辨识所述双股目标序列。于另一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法，包含:提供一可能含有鱼病原体的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；提供一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(datps)、脱氧胞核苷三磷酸(dctps)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtps)，以及脱氧胸苷三磷酸(dttps)，以形成一聚合酶链锁反应(pcr)混合物；透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述pcr混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cpcr)，以形成一pcr产物；以及侦测所述pcr产物以辨识所述双股目标序列。于又一方面，本发明涉及一种用于侦测鱼病原体的寡核苷酸对。于再一方面，本发明涉及一种用于侦测鱼病原体的寡核苷酸对与寡核苷酸探针。应当进一步理解的是，在某些实施方案中，本文揭露的寡核苷酸对及/或寡核苷酸探针可用于各种基础pcr技术之变异，例如，但不限于，反转录聚合酶链锁反应(rt-pcr)、热对流聚合酶链锁反应(cpcr)、实时聚合酶链锁反应(real-timepcr)、巢式聚合酶链锁反应(nestedpcr)，以及热不对称性交错聚合酶链锁反应(thermalasymmetricinterlacedpcr,tail-pcr)。如本文所用，术语「鱼病原体」意指在鱼生物体内外发现的病毒性、细菌性及寄生性病原体。鱼病原体的实例如，但不限于：鱼呼吸道与肠道病毒(piscinereovirus,prv)、感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(infectioussalmonanemiavirus,isav)、鱼心肌炎病毒(piscinemyocarditisvirus,pmcv)、鲑鱼甲病毒(salmonidalphavirus,sav)、佩鲁兰新副变形虫(neoparamoebaperurans)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(salmongillpoxvirus,sgpv)、鲑鱼立克次体(piscirickettsiasalmonis)，以及鲑鱼肾菌(renibacteriumsalmoninarum)。如本文所用，术语「热对流聚合酶链锁反应(cpcr)」是指一种聚合酶链锁反应，其中，将一装有一pcr样品的管状容器底部嵌入一稳定热源中，并控制所述pcr的参数，包括所述pcr样品的总体积、黏度、表面温度，以及所述管状容器的内径，使得所述pcr样品的底部到顶部的温度梯度下降，诱导热对流并且使得pcr样品的变性、黏合、聚合在所述管状容器的不同区域中依序且重复发生。热对流聚合酶链锁反应(cpcr)的详细描述请参见如美国专利号8,187,813，其以引用的方式将其整体并入本文。如本文所用，术语「荧光分子」意指一物质或其一部份，其系能够在可侦测的范围内显示荧光。如本文所用，术语「荧光抑制分子」意指一物质或其一部份，其系能够抑制当由一光源激发时由所述荧光分子所发射的荧光。在某些实施方案中，术语「荧光分子」与「荧光抑制分子」为taqmantm分析套组(appliedbiosystemsinc.，加州，美国)的荧光分子与荧光抑制分子。taqmantm分析套组的详细描述请参见如，hollandetal.,proc.natl.acad.sci,u.s.a.(1991)88:7276-7280；美国专利号5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式将其整体并入本文。所述荧光分子的例子包括，但不限于，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine,cya)、6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,fam)、5,6-羧基罗丹明-llo(5,6-carboxyrhodamine-llo,r110)、6羧基罗丹明-6g(6-carboxyrhodamine-6g,r6g)、n’,n’,n’,n’-四甲基-6-羧基罗丹明(n’,n’,n’,n’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine,tamra)、6-羧基-x-罗丹明(6-carboxy-x-rhodamine,rox)、2’,4’,5’,7’-四氯4-7-二氯荧光素(2’,4’,5’,7’-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein,tet)、2',7-二甲氧基-4',5'-6羧基罗丹明(2’,7-dimethoxy-4’,5’-6carboxyrhodamine,joe)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein,hex)、alexa荧光、cy3荧光与cy5荧光。所述荧光抑制分子的例子包括，但不限于，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoicacid,dabcyl)、黑洞荧光抑制剂1(blackholequencher1,bhq1)、黑洞荧光抑制剂2(blackholequencher2,bhq2)、黑洞荧光抑制剂3(blackholequencher3,bhq3)、二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(dihydrocyclopyrroloindoletripeptideminorgroovebinder,mgb)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine,tamra)。在某些实施方案中，所述荧光分子为6-羧基荧光素(fam)，且所述荧光抑制分子为二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(mgb)。在某些实施方案中，所述荧光分子为6-羧基荧光素(fam)，且所述荧光抑制分子为黑洞荧光抑制剂1(bhq1)或二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(mgb)。除非本文另有定义，否则用以与本文结合的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行。一般而言，本文所描述之用以连结以下技术的命名法，以及生物化学、酵素学、分子及细胞生物学、微生物学、遗传学与蛋白质及核酸化学及杂合反应的技术皆为本领域已知且经常使用者。除非另有说明，本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行，且被描述于在本说明书中被引用且讨论的各种一般及更具体的参考文献中。本发明进一步透过以下的实施例阐释，其不应以任何方式被解释为进一步的限缩。本申请案中引用的所有引用文件(包括参考文献、核准的专利、公开的专利申请，以及一同在申请中的专利申请案)的整体内容，在此透过引用的方式明确地并入本案中。实施例实施例1病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的检测病原体鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的l1区段基因(genbankaccessionno.ky429943)以及sigma3蛋白基因(genbankaccessionno.kx844958)的片段分别被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到pprv-l1以及pprv-s3质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的pprv-l1或pprv-s3质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭(ethidiumbromide)染色显现。传统pcr的结果如表1所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的存在。表1各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)prv-f1(seqidno:1)prv-r1(seqidno:2)70prv-f2(seqidno:4)prv-r1(seqidno:2)92prv-f2(seqidno:4)prv-r2(seqidno:5)98prv-f3(seqidno:6)prv-r3(seqidno:7)83prv-f4(seqidno:9)prv-r4(seqidno:10)77prv-f5(seqidno:11)prv-r5(seqidno:12)762.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的l1区段基因或sigma3蛋白基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pprv-l1或pprv-s3质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表2所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的l1区段基因或sigma3蛋白基因的rna或102个拷贝数的pprv-l1或pprv-s3质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表2各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表3所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的样品，而侦测不到含有感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表3各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的pprv-l1或pprv-s3质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpprv-l1或pprv-s3质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pprv-l1或pprv-s3质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pprv-l1或pprv-s3质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测鱼呼吸道与肠道病毒(prv)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例2病原体感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的检测病原体感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的vp5与多聚蛋白(polyprotein)基因(genbankaccessionno.ky548514)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到pipnv质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的pipnv质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表4所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的存在。表4各引物对与探针组合进行传统pcr的结果2.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的vp5与多聚蛋白基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pipnv质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表5所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的vp5与多聚蛋白基因的rna或102个拷贝数的pipnv质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表5各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表6所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表6各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的pipnv质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpipnv质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pipnv质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少10个拷贝数的pipnv质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测感染性胰脏坏死病毒(ipnv)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例3病原体感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的检测病原体感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的开放读码框(orf)1与orf2基因(genbankaccessionno.kx424589)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到pisav质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的pisav质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表7所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的存在。表7各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)isav-f1(seqidno:26)isav-r1(seqidno:27)87isav-f2(seqidno:29)isav-r2(seqidno:30)83isav-f3(seqidno:32)isav-r3(seqidno:33)77isav-f4(seqidno:35)isav-r4(seqidno:36)83isav-f5(seqidno:37)isav-r5(seqidno:38)962.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的orf1与orf2基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pisav质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表8所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的orf1与orf2基因的rna或102个拷贝数的pisav质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表8各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表9所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的样品，而侦测不到含有感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表9各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的pisav质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpisav质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pisav质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pisav质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测感染性鲑鱼贫血病毒(isav)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例4病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的检测病原体鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组(genbankaccessionno.hq339954)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到ppmcv质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的ppmcv质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表10所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测鱼心肌炎病毒(pmcv)的存在。表10各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)pmcv-f1(seqidno:39)pmcv-r1(seqidno:40)81pmcv-f2(seqidno:42)pmcv-r2(seqidno:43)81pmcv-f3(seqidno:45)pmcv-r3(seqidno:46)95pmcv-f4(seqidno:48)pmcv-r4(seqidno:49)80pmcv-f5(seqidno:51)pmcv-r4(seqidno:49)100pmcv-f6(seqidno:52)pmcv-r4(seqidno:49)832.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组片段的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或ppmcv质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表11所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的鱼心肌炎病毒(pmcv)的基因组片段的rna或102个拷贝数的ppmcv质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表11各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表12所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有鱼心肌炎病毒(pmcv)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表12各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的ppmcv质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlppmcv质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的ppmcv质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的ppmcv质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测鱼心肌炎病毒(pmcv)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例5病原体鲑鱼甲病毒(sav)的检测病原体鲑鱼甲病毒(sav)的基因组(genbankaccessionno.kc122926)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到psav质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的psav质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表13所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测鲑鱼甲病毒(sav)的存在。表13各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)sav-f1(seqidno:53)sav-r1(seqidno:54)87sav-f2(seqidno:56)sav-r2(seqidno:57)77sav-f3(seqidno:59)sav-r3(seqidno:60)110sav-f4(seqidno:62)sav-r4(seqidno:63)84sav-f5(seqidno:65)sav-r5(seqidno:66)832.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl鲑鱼甲病毒(sav)的基因组片段的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或psav质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表14所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的鲑鱼甲病毒(sav)的基因组片段的rna或102个拷贝数的psav质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表14各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表15所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有鲑鱼甲病毒(sav)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表15各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的psav质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpsav质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的psav质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的psav质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测鲑鱼甲病毒(sav)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例6病原体佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的检测佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)为造成阿米巴腮病(amoebicgilldisease,agd)的病原体。佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的18s核糖体核糖核酸(rrna)基因(genbankaccessionno.ku985058)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到pagd质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的pagd质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表16所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的存在。表16各引物对与探针组合进行传统pcr的结果2.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的18srrna基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pagd质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表17所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的18srrna基因的rna或102个拷贝数的pagd质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表17各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表18所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表18各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的pagd质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpagd质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pagd质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pagd质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测佩鲁兰新副变形虫(n.perurans)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例7病原体ca.b.cysticola(cbc)的检测病原体ca.b.cysticola(cbc)的16s核糖体核糖核酸(rrna)基因(genbankaccessionno.jq723599)片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到pcbc质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的pcbc质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表19所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测ca.b.cysticola(cbc)的存在。表19各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)cbc-f1(seqidno:80)cbc-r1(seqidno:81)98cbc-f2(seqidno:83)cbc-r2(seqidno:84)702.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μlca.b.cysticola(cbc)的16srrna基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pcbc质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表20所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的ca.b.cysticola(cbc)的16srrna基因的rna或102个拷贝数的pcbc质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表20各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表21所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有candidatusbranchiomonascysticola(cbc)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。【表21】各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的pcbc质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpcbc质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pcbc质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pcbc质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测ca.b.cysticola(cbc)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例8病原体微孢子虫d.lepeophtherii(des)的检测病原体微孢子虫d.lepeophtherii(des)的16s核糖体核糖核酸(rrna)基因(genbankaccessionno.jq723599)片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到pdes质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的pdes质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表22所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测微孢子虫d.lepeophtherii(des)的存在。表22各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)des-f1(seqidno:86)des-r1(seqidno:87)92des-f2(seqidno:89)des-r2(seqidno:90)82des-f3(seqidno:92)des-r3(seqidno:93)91des-f4(seqidno:95)des-r4(seqidno:97)89des-f5(seqidno:96)des-r4(seqidno:97)872.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl微孢子虫d.lepeophtherii(des)的16srrna基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pdes质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表23所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的微孢子虫d.lepeophtherii(des)的16srrna基因的rna或102个拷贝数的pdes质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表23各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表24所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表24各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的pdes质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpdes质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pdes质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pdes质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测微孢子虫d.lepeophtherii(des)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例9病原体鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的检测病原体鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的基因组(genbankaccessionno.kt159937)片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到psgpv质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的psgpv质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表25所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的存在。表25各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)sgpv-f1(seqidno:99)sgpv-r1(seqidno:100)84sgpv-f2(seqidno:102)sgpv-r2(seqidno:103)74sgpv-f3(seqidno:105)sgpv-r3(seqidno:106)82sgpv-f4(seqidno:108)sgpv-r4(seqidno:109)1062.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的基因组片段的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或psgpv质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表26所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的基因组片段的rna或102个拷贝数的psgpv质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表26各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表27所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表27各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的psgpv质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpsgpv质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的psgpv质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的psgpv质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测鲑鱼腮痘病毒(sgpv)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例10病原体鲑鱼立克次体(p.salmonis)的检测鲑鱼立克次体(p.salmonis)为造成鱼类立克次体症(salmonidrickettsialsepticaemia,srs)的病原体。鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16s核糖体核糖核酸(rrna)基因(genbankaccessionno.ay498634)片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到psrs质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的psrs质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表28所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测鲑鱼立克次体(p.salmonis)的存在。表28各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)srs-f1(seqidno:111)srs-r1(seqidno:112)151srs-f2(seqidno:114)srs-r2(seqidno:115)80srs-f3(seqidno:116)srs-r3(seqidno:117)54srs-f4(seqidno:119)srs-r4(seqidno:120)56srs-f5(seqidno:122)srs-r5(seqidno:123)582.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16srrna基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或psrs质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表29所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的鲑鱼立克次体(p.salmonis)的16srrna基因的rna或102个拷贝数的psrs质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表29各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表30所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)，以及鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表30各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的psrs质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpsrs质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的psrs质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的psrs质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测鲑鱼立克次体(p.salmonis)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。实施例11病原体鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的检测鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)为造成鱼类细菌性肾病(bacterialkidneydisease,bkd)的病原体。鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因(genbankaccessionno.z12174)片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，puc57、pgem-t，以得到pbkd质粒。1.传统聚合酶链锁反应进行传统pcr所用的50μlpcr混合物含有：106个拷贝数的pbkd质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.2μmdntp以及1.25utaqdna聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于pc818,astecco.ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在tae缓冲液(40mmtris,20mmaceticacid,1mmedta)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。传统pcr的结果如表31所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统pcr扩增反应以检测鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的存在。表31各引物对与探针组合进行传统pcr的结果正向引物反向引物合成片段大小(bp)bkd-f1(seqidno:125)bkd-r1(seqidno:128)72bkd-f2(seqidno:126)bkd-r1(seqidno:128)85bkd-f3(seqidno:127)bkd-r1(seqidno:128)70bkd-of1(seqidno:130)bkd-or1(seqidno:131)65bkd-of2(seqidno:133)bkd-or2(seqidno:134)125bkd-of3(seqidno:136)bkd-or3(seqidno:137)1332.热对流聚合酶链锁反应(cpcr)50μl的pcr混合物含有5μl鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因的rna(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pbkd质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))、0.2μmdntp、1xcpcr缓冲液，以及1-5utaqdna聚合酶、1-5u反转录酶。将pcr混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cpcr)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cpcr仪侦测每个样本中的fam荧光。重复上述cpcr分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。敏感度测试的结果如表32所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的57kd细胞外蛋白前体(ecp)基因的rna或102个拷贝数的pbkd质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。表32各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cpcr模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cpcr方法如上所述。专一性测试的结果如表33所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有鲑鱼肾菌(r.salmoninarum，在表中以bkd表示)的样品，而侦测不到含有鱼呼吸道与肠道病毒(prv)、感染性胰脏坏死病毒(ipnv)、感染性鲑鱼贫血病毒(isav)、鱼心肌炎病毒(pmcv)、鲑鱼甲病毒(sav)、佩鲁兰新副变形虫(n.perurans，在表中以agd表示)、candidatusbranchiomonascysticola(cbc)、微孢子虫desmozoonlepeophtherii(des)、鲑鱼腮痘病毒(sgpv)，以及鲑鱼立克次体(p.salmonis，在表中以srs表示)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。表33各引物对与探针组合的专一性测试结果“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。3.实时聚合酶链锁反应(real-timepcr,qpcr)以稀释的pbkd质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时pcr仪(例如，但不限于abisteponeplustm；appliedbiosystem,lifetechnologies，加州，美国)中进行实时pcr分析。以含有2μlpbkd质粒、0.01-2μm正向引物、0.01-2μm反向引物、0.01-2μm探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(fam)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(bhq1))，总体积为20μl的商用rt-pcr套组(例如，但不限于，onestepprimescripttmrt-pcrkit；takarabioinc.，日本)进行实时pcr分析。实时pcr的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pbkd质粒的实时pcr分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pbkd质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的r2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时pcr，并产生可信的结果。上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cpcr扩增反应以检测鲑鱼肾菌(r.salmoninarum)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。序列表<110>福又达生物科技股份有限公司<120>鱼病原体检测方法<130>p19-0202<160>138<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acttgaaaacctgagtgtggca22<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2actcgcgttagtccagatatcag23<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aagtggcactatcgaatta19<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttgtcaaccaactacctgaagactt25<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agttttactcgcgttagtccagat24<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6acgcagacgcttacctcaga20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gcgtctgtctggtctgtcgt20<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tggacagaagacaacagtcgcgg23<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9agacgcttacctc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