一组特殊膳食蛋白质的制作方法

本发明属于苯丙酮尿症饮食疗法领域，具体涉及高苯丙氨酸血症或苯丙酮尿症患者适用的无/低苯丙氨酸含量的重组蛋白质。
背景技术：
：苯丙酮尿症(phenylketonuria，pku)是一种罕见的氨基酸代谢遗传病，在中国新生儿中的发病率约为1:11800，全国pku患者总人数在12万人左右。pku为常染色体隐性遗传，是由于苯丙氨酸代谢途径中的关键酶(pah)或辅因子(bh4)缺失，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸在脑和血浆中蓄积，也称高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，hpa)，体内的苯丙氨酸主要从尿中排出。在患者出生3-4个月时就开始表现出来典型症状，一岁时症状明显。pku的主要表现形式为各种毒性物质在大脑中累积，引起中枢神经系统的损害，影响人的智力，思考、感受以及行为方式，其主要表现为生长及智力发育迟缓、抽搐、反射亢进、湿疹和鼠气味等，如不及时治疗，可造成智力低下。大多数国家通常会对出生后的新生儿进行筛查。如果在生命早期未被发现和未及时治疗，pku会导致婴儿神经系统不可逆转的损害、严重的智力迟钝和大脑发育不良。据报道，如果不及时治疗，婴儿在出生后的第一年就会损失智商。根据治疗开始时的年龄，不同年龄期间的血液phe水平和膳食治疗pku的依从性不可避免地会伴随着至少一些智商的丧失。一旦检测到，可通过向婴儿和之后的儿童提供phe限制膳食来治疗该病症。苯丙酮尿症根据血液中苯丙氨酸的含量分为以下几个类型：当未经治疗时，血浆phe浓度大于1200μmol/l的，称为经典型pku(最严重的pku)；未经治疗，血浆phe浓度在600-1200μmol/l中间的，称为轻度型pku；未经治疗，血浆phe浓度在180-600μmol/l中间的，称为良性pku(或非pku-hpa)。具有经典型(或严重)pku的个体必须采用基于极低phe膳食的严格膳食方案进行治疗，以将其phe浓度降低至安全范围。这种中等程度形式的pku通过使用适度的膳食限制来管理，例如：相对低蛋白质的膳食，不需要补充无phe的氨基酸配方。患有非pku-hpa的个体通常不被治疗，因为他们被认为具有在“安全”范围内的血浆phe水平。在膳食pku治疗中，目标范围是<360μmol/l，高达600μmol/l的范围也被认为是可接受的。苯丙酮尿症(pku)的目前的主要治疗途径有以下几种：1)饮食疗法通过控制摄入苯丙氨酸含量的膳食疗法来治疗苯丙酮尿症的历史最为悠久。早在20世纪50年代就开始了苯丙氨酸限制膳食治疗pku，通过蛋白质水解的方式，然后通过肽的过滤步骤去除尽可能多的phe后，向患者提供必需氨基酸(phe除外)。基本要求为在保证人体正常生长发育所需的苯丙氨酸摄入量的基础上限制苯丙氨酸的摄入。为避免血液中苯丙氨酸浓度增高所致的脑神经不可逆损伤，pku患者自新生儿期起就开始控制饮食，坚持终身治疗。传统的苯丙氨酸限制饮食疗法存在诸多的缺点：(1)由于大多数食物的蛋白质中都含有苯丙氨酸，所以能选择的食物非常受限，只能选择不含蛋白质或者含蛋白质很低的食物，导致病人的氮代谢紊乱，引发并发症，(2)以氨基酸复配粉作为饮食蛋白质的替代物，由于多种氨基酸均有很强的苦涩味以及特殊不愉快气味，导致氨基酸复配粉的口感差，患者治疗依从性较差；另外，由于口服大量游离氨基酸，导致肠道的渗透压紊乱，引发肠道不适以及肠道代谢紊乱；再次之，氨基酸粉能做成的食物形式非常有限，长期服用导致患者的生活质量下降。(3)由于生活质量差导致神经和心理问题不断；(4)饮食的长期受限制或选择单一导致营养缺乏；(5)特殊食品和营养素的花费较大，家庭负担较重。糖巨肽(glycomacropeptide，gmp)是制作奶酪期间从乳清中提取的天然低苯丙氨酸蛋白质，也是目前苯丙酮尿症患者适用的唯一低苯丙氨酸的膳食蛋白质。纯gmp缺乏芳香族氨基酸苯丙氨酸(phe；f)，同时也缺乏酪氨酸(tyr；y)和色氨酸(trp；w)以及精氨酸(arg；r)、组氨酸(his；h)和半胱氨酸(cys；c)等必须氨基酸和重要的氨基酸。糖巨肽在乳汁中的含量较低，约占乳清蛋白的15-20％，需要经过多步精细纯化才能得到较纯的糖巨肽，市场上销售的糖巨肽产品的苯丙氨酸含量约4mg/g蛋白质。[kyungwhalim,moleculargeneticsandmetabolism,(2007)]然而，由于糖巨肽缺乏多种必须氨基酸，不能作为膳食蛋白质的唯一来源，因此需要复配其他必需氨基酸组合作为低苯丙氨酸饮食，由于其并不是完全无苯丙氨酸蛋白粉，因此其可以作为一种辅助疗法替代部分氨基酸饮食。另外，由于其生产纯化工艺复杂，一般乳品厂无法大批量生产出合格的低苯丙氨酸的糖巨肽，所以市场售价昂贵，且市场占有率也很低。根据《中国居民膳食营养素参考摄入量(2013版)》的规定，苯丙酮尿症患者对膳食蛋白质的需求量为0.8-1.2g/kg·d，也就是每天摄入蛋白质需求总量15-75g，普通患者经济上很难支撑长期服用如此大量的糖巨肽蛋白产品。目前绝大多数的苯丙氨酸限制饮食的产品均为复配氨基酸粉。2)药物治疗沙丙蝶呤是bh4的药物形式，fda于2007年12月26日批准biomarinpharmaceutical研发生产的kuvan上市，其主要针对的是四氢生物蝶呤(bh4)缺乏症所致的高苯丙氨酸血症(hpa)。bh4为孤儿药，价格偏高，在国内供应渠道较少。注射用peg修饰的苯丙氨酸解氨酶(商品名：palynziq)，fda于2018年批准biomarin制药公司用于成人治疗苯丙酮尿症。适用于那些使用已有治疗药物无法控制病情(血液苯丙氨酸浓度失控)的成年pku患者。治疗苯丙酮尿症的药物为孤儿新药，价格昂贵，且并非对所有苯丙酮尿症患者有效，且长期使用，产生免疫原性导致效果逐渐变差。3)大分子中性氨基酸(lnaa)由于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及一些支链氨基酸等大的中性氨基酸(largeneutralaminoacids，lnaa)是通过共同的转运载体l-typeaminoacidtransporter(lat1,slc7a5)通过血脑屏障进入大脑的，因此，血液中苯丙氨酸过高会和其他的lnaa竞争转运载体，研究证实补充lnaa可以降低大脑中苯丙氨酸浓度，从而缓解高浓度苯丙氨酸对大脑神经的毒害和引起的智力障碍。lnaa的补充剂，同样面临着口服氨基酸的缺点，如苦涩味重，口感差，引起肠道不适以及肠道功能紊乱等。常见的优质食物蛋白质，如乳清蛋白，卵蛋白，大豆蛋白等，其苯丙氨酸含量均比较高(约3.1-5.35％)[christopherj.rasmussen,nutritionalsupplementsinsportsandexercise，(2008)；mariaminnaar，usda，(1994)]，不适合苯丙酮尿症患者食用。另外，这些蛋白质的lnaa与苯丙氨酸的比值较低(约5.89-11.06)，无法起到抑制苯丙氨酸进入大脑的作用。目前作为苯丙酮尿症患者唯一适用的天然低苯丙氨酸食物蛋白---糖巨肽，虽然苯丙氨酸含量较低，但是其缺少了多种必需氨基酸，需要复配氨基酸粉组合才能使用，影响口感体验。目前尚没有一种蛋白质可满足苯丙酮尿症患者的所有氨基酸需求，可作为苯丙酮尿症患者的唯一蛋白质食物来源。同时也没有一种膳食蛋白质满足低苯丙氨酸含量的同时，含有较高比例的lnaa氨基酸。因此，开发一种苯丙酮尿症患者适用的低/无苯丙氨酸含量，且含有较高lnaa的蛋白质，可显著提升苯丙酮尿症患者的生存质量，具有巨大的社会意义和商业价值。技术实现要素：为了克服现有技术中没有一种蛋白质满足低苯丙氨酸含量，同时含有较高比例的lnaa氨基酸可作为苯丙酮尿症患者的唯一蛋白质食物来源的不足，本发明的首要目的是提供一种重组无/低苯丙氨酸含量的蛋白质，所述蛋白质是通过对天然表达量高的蛋白质进行人工设计优化，降低苯丙氨酸含量，同时提高lnaa的含量，使其更适合苯丙酮尿症的饮食治疗。本发明的第二个目的，是提供重组无/低苯丙氨酸含量的蛋白质的制备方法，对候选蛋白质进行特性筛选时，除苯丙氨酸含量低，还需要能经过比较简单的制备方案，就可以去除绝大多数的杂质，获得高纯度的目的蛋白；再通过对基因工程菌改造和生产工艺优化，最终得到的蛋白粉纯度高，口感佳，且可与大多数的配料兼容，制作成为形式多样，体验丰富的各种产品。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：第一方面，提供一种重组无/低苯丙氨酸含量的蛋白质，所述蛋白质的苯丙氨酸含量≤5mg/g蛋白质，或lnaa与苯丙氨酸的质量比值≥100，所述lnaa为所述蛋白质中酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸的质量总和。优选地，上述蛋白质具有除苯丙氨酸外的全部的必需氨基酸，且lnaa质量总和占比≥40％。优选地，所述的蛋白质的氨基酸序列包含与seqidno1-4任一项具有至少70％同一性的多肽序列或其营养充足部分，其中所述蛋白质不包含苯丙氨酸。进一步地，所述的蛋白质的氨基酸序列包含与seqidno1-4任一项具有至少85％，优选90％，更优选95％的同一性。更进一步地，所述的蛋白质的氨基酸序列为seqidno1-4任一项。第二方面，提供一种载体，包含编码第一方面提供的任一项所述的重组无/低苯丙氨酸的蛋白质的核酸序列。第三方面，提供一种重组微生物，其包含第二方面提供的载体。优选地，所述的微生物包括但不限于大肠杆菌表达系统，芽孢杆菌表达系统，酵母表达系统，丝状真菌表达系统中任意一种。进一步地，所述的大肠杆菌表达系统为大肠杆菌k12表达系统；所述的芽孢杆菌表达系统为地衣芽孢杆菌表达系统；所述的酵母表达系统为毕赤酵母表达系统；所述的丝状真菌表达系统为里氏木霉表达系统。第四方面，提供上述任一项所述的重组无/低苯丙氨酸的蛋白质的制备方法，该方法包括将上述任一项的重组微生物在适合所述重组微生物产生重组蛋白质的条件下培养。第五方面，提供一种组合物，所述组合物包含上述任一项所述的重组无/低苯丙氨酸的蛋白质和任选其它赋形剂。优选地，所述的组合物中每100g总蛋白质或蛋白质等同物包含不超过0.5g苯丙氨酸。第六方面，提供上述任一项所述的重组无/低苯丙氨酸的蛋白质或上述所述的组合物在制备治疗体内苯丙氨酸积聚的疾病的产品中的应用。优选地，所述的体内苯丙氨酸积聚的疾病为苯丙酮尿症与/或高苯丙氨酸血症。优选地，所述的产品为药物、食品、保健品或医学用配方食品。如本发明所用，“重组”是指生物分子，例如基因或蛋白质，其：(1)已从其天然存在的环境中移出；(2)与天然存在基因中的多核苷酸的全部或部分不相关；(3)可操作地连接到在自然界不与之连接的多核苷酸；和/或(4)在自然界中不存在。术语“重组”可用于指克隆的dna分离物、化学合成的多核苷酸类似物，或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由这些核酸编码的蛋白质和/或mrna。因此，例如，如果由细胞中存在的重组基因合成的mrna合成，则由微生物合成的蛋白质是重组的。术语“其营养充足部分”是指膳食蛋白质的一部分。膳食蛋白质的营养充足部分具有比本发明的膳食蛋白质更少的氨基酸，但除了phe之外，仍然包含所有必需氨基酸。术语“营养充足，”如本发明所述，是指除了苯丙氨酸之外包含所有必需氨基酸的多肽序列且为具有高生物学价值的蛋白质。术语“必需氨基酸，”如本发明所述，是指组氨酸(his、h)、异亮氨酸(ile、i)、亮氨酸(leu、l)、赖氨酸(lys、k)、蛋氨酸(met、m)、苯丙氨酸(phe、f)、苏氨酸(thr、t)、色氨酸(trp、w)和缬氨酸(val、v)，其是健康和生长所需的氨基酸，但不能被人体合成且必须从食物获得。术语“重组微生物，”如本发明所述，是指被修饰以携带重组基因拷贝的微生物。本发明通过对天然表达量高的蛋白质的序列进行人工设计优化，降低苯丙氨酸含量，同时提高lnaa的含量，获得的蛋白质序列在重组微生物中表达，得到重组无/低苯丙氨酸的蛋白质，喂食苯丙酮尿症模型鼠，可有效的控制苯丙酮尿症模型鼠的血液中的苯丙氨酸含量，因此，其适合苯丙酮尿症的饮食治疗。另外，本发明提供的重组无/低苯丙氨酸的蛋白质在适合的重组微生物表达系统表达后获得的蛋白粉，蛋白质含量≥80％，最高达94％；蛋白纯度≥82％，最高达95％；苯丙氨酸含量≤4.1mg/g蛋白质，最低含0.5mg/g蛋白；lnaa:phe比值≥101，最高为410；lnaa占比≥40％。按照本发明制备重组无/低苯丙氨酸的蛋白粉的生产成本可降低至普通蛋白制品的价格，有巨大的实际应用价值和广阔的市场前景。附图说明图1为大肠杆菌表达的pku1蛋白的sds-page图；m:蛋白分子量marker；1：pku1在28℃下表达；2：pku1在37℃下表达；图2为地衣芽孢杆菌表达的pku2蛋白的sds-page图；1:蛋白分子量marker；2，3：pku2蛋白纯度的sds-page图；图3为毕赤酵母表达系统表达的pku3蛋白的sds-page图；m:蛋白分子量marker；1：pku3蛋白纯度的sds-page；图4为里氏木霉表达系统表达的pku4蛋白的sds-page图；m:蛋白分子量marker；1：pku4蛋白纯度的sds-page；具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实施例1.表达无苯丙氨酸蛋白大肠杆菌菌种的构建与蛋白发酵生产与制备本实施例以大肠杆菌k12表达系统为例，阐述大肠杆菌表达系统重组表达无/低苯丙氨酸蛋白的菌种构建以及蛋白表达与纯化制备。实施例中采用的大肠杆菌k12(escherichiacolik12)购自美国模式培养物集存库(atcc)。试验用试剂除特别注明外，均为市售科研试剂或耗材，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参考常规实验手册中的操作。一、大肠杆菌表达菌种的构建1.表达载体的构建根据无苯丙氨酸目的蛋白序列(pku1，蛋白序列见seqidno:1)和表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因。以质粒pet22b为模板，用表1中的引物pet22b-f/pet22b-r，pcr扩增约5500bp的载体骨架，用dpni消化处理2-3h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架；用表1中的引物pku1-f/pku1-r，pcr扩增pku1基因片段，将载体骨架与重叠pcr产物用无缝克隆试剂盒(clonexpressiionestepcloningkit，南京诺唯赞生物科技)组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株进行dna测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，该质粒命名为pet-22b-pku1。表1.pet22b-pku1载体构建相关引物引物名称引物序列(5’-3’)pku1-fctcgaattcggatccttatttactgcttttcttcttgacpku1-rggagatatacatatgatgaaaaaacagaatgacattpet22b-fcatatgtatatctccttcttaaagttaaacpet22b-rggatccgaattcgagctccg2.重组表达质粒转化大肠杆菌表达菌株k12将步骤1制备的pet22b-pku1质粒转化e.colik12菌种感受态并进行lb平板(含100ug/ml的氨苄青霉素)筛选，经pcr验证后得到表达菌种，将筛选到的表达菌种分别在不同温度(28℃及37℃)下进行诱导表达培养，诱导表达结果如图1所示。结果显示，37℃有助于pku1蛋白的高效表达。表达成功的菌种，命名为ku-1菌种。3.无苯丙氨酸蛋白的表达生产与制备将步骤2构建并表达成功的菌种，用30l发酵罐进行发酵表达并进行后处理制备无/低苯丙氨酸蛋白粉。将冻存的表达菌种解冻，涂布于lb平板(含100ug/ml的氨苄青霉素)，37℃过夜培养进行活化，挑取单斑接种于lb种子培养基，37℃，220rpm震荡培养3-6h，以5％接种量转接至二级种子摇瓶(2l，lb培养基)，37℃，220rpm震荡培养14-16h，以3-5％接种量接种于30l发酵罐(发酵培养基：酵母粉12g/l，蛋白胨8g/l，磷酸二氢钾4g/l，硫酸铵1.4g/l，甘油5g/l，葡萄糖15g/l，硫酸镁1g/l，nacl5g/l，df104消泡剂2g/l，ph7.5)。补料培养基为葡萄糖200g/l，酵母粉160g/l。发酵培养4-6h，od600达到10左右，加入诱导剂(iptg，0.5mm)进行诱导，诱导温度37℃，诱导过程中ph控制在6.5-7.0。在发酵6-8h开始进行补料培养，控制发酵溶氧在30-70％之间。发酵时间22-24h，蛋白表达产量在6-8g/l。将发酵液经蝶式离心机收集菌体，用硼酸盐缓冲液(10mm，ph9.0)清洗菌体两次。将菌体用硼酸盐缓冲液(10mm，ph9.0)重悬至150-200g/l，经高压均质机裂解细胞，然后10000g离心，收集上清液，调节ph至5.5，离心，收集沉淀，沉淀用硼酸盐缓冲液(10mm，ph9.0)重悬清洗，调节ph至5.5沉淀蛋白，重复清洗3-5次后，即为无苯丙氨酸的蛋白。无苯丙氨酸蛋白溶液经喷雾干燥(进风温度为160℃、出风温度为75℃)，得到无/低苯丙氨酸的蛋白粉。得到的喷干粉经凯氏定氮法测定蛋白质含量，结果显示蛋白含量为87％；蛋白样品经sds-page电泳，对电泳图进行灰度扫描分析，结果显示目的蛋白纯度约85％。氨基酸含量分析，显示苯丙氨酸含量<5mg/g蛋白粉。结果如表2所示。表2.pku1蛋白质粉质量检测实施例2.芽孢杆菌表达的无/低苯丙氨酸蛋白菌种的构建及蛋白发酵生产与制备本实施例以地衣芽孢杆菌表达系统为例，阐述芽孢杆菌表达系统表达无/低苯丙氨酸蛋白的菌种构建以及蛋白表达与制备。实施例中采用的地衣芽孢杆菌菌种(b.licheniformiscicc10266)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。实施例中采用的pebkan194-gfp质粒为申请人的另外1件专利申请(申请号：201610410811.8)中的pkgfp194ts，其构建信息参见该申请的说明书实施例1。试验用试剂除特别注明外，均为市售科研试剂或耗材，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参考常规实验手册中的操作。一、无苯丙氨酸蛋白表达菌种的构建1.表达菌种中原始基因的敲除(1)敲除质粒的构建；以地衣芽孢杆菌cicc10266的基因组dna为模板，用表3中的引物apr-up-f/apr-up-r，apr-down-f/apr-down-r，pcr扩增上游同源臂apr-up和下游同源臂apr-down，然后以apr-up-f/apr-down-r为引物，通过重叠pcr扩增apr-up+down，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段；以pebkan194-gfp质粒为模板，用表3中的引物pebkan194-f/pebkan194-r，pcr扩增约5300bp的载体骨架片段，用dpni内切酶消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒(clonexpressiionestepcloningkit，南京诺唯赞生物科技)的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株进行dna测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，该质粒命名为pebkan194-gfp-apr-up+down。表3.pebkan194-gfp-apr-up+down载体构建引物引物名称引物序列(5’-3’)apr-up-fgactctagaggatccctacaccctttcattgacagaatcapr-up-rcgtttctttgccgcttgatgaaatcagctcatgtgaaagapr-down-fcacatgagctgatttcatcaagcggcaaagaaacgatcapr-down-rgagctcggtacccggaaagcggtatgctctatggacpebkan194-fccgggtaccgagctcgaggcpebkan194-rggatcctctagagtcgacctgcaggcpebkan194-f(ce)gtttatgcatcccttaaccgpebkan194-r(ce)tttaccagacaaccattacctapr-f双ctccatcaatgacaatgataatcattatcapr-r双gtacgccgttttaggagctc(2)电击转化宿主菌；i.地衣芽孢杆菌感受态细胞的制备：将冻存地衣芽孢杆菌菌种在lb平板上划线，置于37℃培养箱过夜培养。从新鲜平板上挑取单菌落接种于5mllb培养基中，37℃，220rpm过夜培养。吸取过夜培养的菌液转接至gm培养基，控制好接种量，使接种完后的od600在0.19-0.2之间。37℃，200rpm培养至od600＝1.0(大约需要3-4小时)左右。取全部菌液转移至50ml无菌离心管，冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。用40ml在4℃预冷的电转缓冲液(etm)洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此重复漂洗3次。将洗涤后的菌体重悬于等500μl的etm中，每管分装60μl，冻存于-80℃冰箱。ii.电击转化：取一管冻存的60μl感受态细胞，插入冰上，微微解冻时加入5-10μl目的重组质粒pebkan194-gfp-apr-up+down，轻弹管底混匀，冰浴孵育5min，转移至预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪参数设置：2.1kv，电击1次(持续时间4.5ms-5.0ms之间)。电击完毕立即加入1ml复苏培养基rm，37℃，200rpm复苏培养3h后，涂布lb平板(含终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落。(3)基因敲除菌株的筛选：i.转化子鉴定：在紫外灯下观察步骤(2)平板上长出的转化子，挑取有绿色荧光的菌落(因质粒上有gfp基因)，接种至lb培养基(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，30℃，200rpm过夜培养。过夜培养的菌液，提取质粒，进行酶切分析，阳性菌株加入终浓度为20％的甘油冻存在-80℃冰箱。ii.单交换传代与筛选：将过夜培养的阳性菌液，按0.2％的比例接种至lb培养基(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，42℃，200rpm振荡培养，每8-12h转接一次，如此转接3-5次。传代培养的菌液在lb琼脂平板上(加入相应的抗生素)划线，倒置于37℃培养箱过夜培养。从划线平板上挑取单菌落至200μllb培养基(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，37℃，200rpm振荡培养至菌液浑浊，菌液pcr筛选阳性菌株，用表3中的pebkan194-f(ce)/apr-r双或apr-f双/pebkan194-r(ce)引物对，对单菌落进行pcr验证并dna测序确认。iii.双交换传代与筛选：将单交换筛选为阳性的菌株，按0.2％的比例接种至lb培养基，42℃，200rpm振荡培养，每12h转接一次，如此转接2-3次。传代培养的菌液，用无菌水稀释106倍，取100μl涂布lb琼脂平板，倒置于37℃培养箱过夜培养。从平板上挑取单菌落分别点至lb(加入终浓度为20μg/ml的卡那霉素)和lb无抗生素平板，一一对应，倒置于37℃培养箱过夜培养。观察两种平板上菌落生长状况，挑取在抗性平板上未生长而在无抗平板上生长良好的菌落至200μllb培养基，37℃，200rpm振荡培养至菌液浑浊，菌液pcr筛选阳性菌株，用表3中的apr-f双/apr-r双为引物对，对菌落进行pcr验证，敲除正确的菌株命名为cicc10266-1.2.在原始基因敲除位点整合无苯丙氨酸蛋白基因(1)无苯丙氨酸蛋白pku2基因的敲入根据无苯丙氨酸目的蛋白序列(pku2，蛋白序列见seqidno:2)和表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因。以pebkan194-gfp-apr-up+down质粒为模板，用表4中的引物p-lc-f/p-yded-r，pcr扩增约6800bp的载体骨架，用dpni内切酶消化2h后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，用引物pku2-f/pku2-r，pcr扩增pku2完整表达框约1800bp，将消化回收的载体骨架与pku2基因片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(含终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。表4.pebkan194-gfp-apr-up+pku2+down载体构建相关引物引物名称引物序列(5’-3’)p-lc-fcaagcggcaaagaaacgatcp-yded-ratgaaatcagctcatgtgaaagpku2-fatgagctgatttcatatctttcacccgtttctgtatgpku2-rtttctttgccgcttgggcatcaggaaaaagctgctg(2)、(3)的筛选步骤同上述1中基因敲除操作中的(2)、(3)。将整合了目的基因pku2的重组菌株进行验证和保种，命名为bl01。在单拷贝整合菌株的基础上，可用相同方法在基因组其他位点整合目的基因，构建双拷贝菌株、三拷贝重组菌株或更高拷贝数的表达菌种，进一步提高目的蛋白的表达量。二、无苯丙氨酸蛋白的发酵表达与制备1)以上述构建的重组地衣芽孢杆菌bl01为出发菌种，采用连续补料工艺在7升发酵罐中进行发酵，基础发酵培养基为：玉米淀粉3％、大豆分离蛋白2.5％、酵母浸粉0.25％、k2hpo40.45％、nah2po40.9％、cacl20.04％、mgso4·7h2o0.08％、mnso40.02％、消泡剂0.2％、α-高温淀粉酶0.01％，ph调节至7.5，121℃高温灭菌20分钟；补料培养基为：葡萄糖40％、大豆水解蛋白18％+酵母粉2％，两者分别121℃高温灭菌。接种量5％，培养条件：37℃，通气量0.6～1.2vvm，通过调节搅拌转速和通气量使do控制40％以上(必要时补充高浓度氧气)；发酵12h开始补料，补料速率为：葡萄糖1.8～2.5g/l/h，大豆水解蛋白+酵母粉0.7～0.9g/l/h，氨水控制ph6.75～6.80，补加速率0.7～1.0ml/l/h，发酵72h结束，蛋白浓度为12.4g/l。2)将发酵液通过陶瓷膜进行固液分离，得到发酵滤液，加入1％nacl，使用hcl调节ph至1.5-1.8沉淀蛋白15～18h，将上清去除后，收集蛋白沉淀浓液，使用陶瓷膜进行清洗至ph2.7～2.9，收集浓液调节ph至9.0，再次陶瓷膜处理8～10倍体积后，收集浓液，巴斯德消毒，并喷雾干燥得到无/低苯丙氨酸蛋白粉。喷雾干燥的参数：将固形物含量为1.3％的蛋白液于60℃保温巴氏消毒，采用离心式喷雾干燥机喷雾，雾化盘转速24000～40000r/min，进风温度为160℃、出风温度为75℃条件下喷雾干燥制粉，含水量为4.5％。将喷雾得到的蛋白粉进行蛋白质含量，蛋白纯度，苯丙氨酸含量以及lnaa:phe等质量指标的检测分析，具体结果如表5所示，sds-page胶图的灰度扫描分析结果显示，纯度约90％，如图2所示。表5.pku2蛋白质粉的质量检测指标结果蛋白质含量89％蛋白纯度90％水分含量4.5％苯丙氨酸含量3.5mg/g蛋白lnaa:phe比值125lnaa总量43.50％实施例3.酵母重组表达无苯丙氨酸蛋白菌种的构建及蛋白发酵生产与制备本实施例以毕赤酵母表达系统为例，阐述酵母表达系统表达无/低苯丙氨酸蛋白的菌种构建以及蛋白表达与纯化制备。实施例中采用的毕赤酵母菌种(pichiapastorisx-33)和质粒ppiczαa购自invitrogen公司。使用试剂除特别注明外，均为市售科研试剂或耗材，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参考常规实验手册中的操作。一、表达无苯丙氨酸蛋白的重组毕赤酵母菌种的构建1.重组表达质粒ppiczαa-pku3的构建根据无苯丙氨酸目的蛋白序列(pku3，蛋白序列见seqidno:3)和毕赤酵母表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因。以ppiczαa质粒为模板，用表6中的引物ppiczαa-f/ppiczαa-r，pcr扩增约3500bp的载体骨架，用dpni消化2h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架，用表6中的引物pku3-f/pku3-r，pcr扩增pku3全长基因。将消化回收的载体骨架与pku3基因片段按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(含终浓度为25ug/ml的博来霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒(ppiczαa-pku3)备用。表6.ppiczαa-pku3载体构建相关引物引物名称引物序列(5’-3’)ppiczαa-ftgagtttgtagccttagacatgppiczαa-ragcttcagcctctcttttctcpku3-fagagaggctgaagctgatgcacacaagagtgaggttgpku3-raaggctacaaactcataagcctaaggcagcttgac2.转化酵母表达宿主菌(1)重组质粒的线性化将上一步构建的载体ppiczαa-pku3用限制性内切酶mssi进行质粒线性化，反应体系如表7所示：表7.质粒线性化反应体系重组质粒ppiczαa-pku340μl10xfdbuffer10μlfdmssi2μlddh2o补足体积至100μl37℃水浴消化2-3h后，用酚氯仿抽提，乙醇沉淀回收高浓度线性化质粒。(2)线性化质粒电转宿主菌i.毕赤酵母感受态细胞制备：从-80℃超低温冰箱中取出保存于甘油管中的毕赤酵母x-33，在ypd平板上划线，30℃恒温培养箱中培养2-3天。挑取单菌落，接种在5mlypd液体培养基中，于28℃振荡培养18-24h。取80-120μl过夜培养物，接种到100ml液体ypd培养基中，过夜生长至od600＝1.15-1.50之间，将培养好的菌液转移至50ml无菌离心管，置于4℃或冰上孵育10min。4℃，2,000g离心5min，收集细胞。加入100ml冰冷的无菌水轻轻晃动使菌体悬浮，再按上步离心。加入50ml冰冷的无菌水悬浮清洗，两管合并到一管子，再按上步离心，弃上清。将细胞悬浮于40ml1m冰冷的山梨醇，依上步离心后，再悬浮于20ml1m冰冷的山梨醇，按上步离心，去上清。用大约1-2ml的1m冰冷的山梨醇重悬细胞，使细胞终浓度达到1×1010cells/ml，分装100μl/管，放置在冰上备用。ii.电击转化将上步骤制备好的感受态细胞与3-10μg的线性化ppiczαa-pku3质粒dna混合冰上放置3-5min，转移到预冷的0.2cm电转化杯中，冰上放置5min。提前打开电转仪预热10-15min，设置好电转参数：电压1.5kv，将电转杯从冰上取出快速擦干并电击，然后立刻加入1ml1m的山梨醇，吸出后于30℃水浴中静置孵育1.5-2h。10000rpm离心0.5min，去部分上清，取一定量涂ypds抗性平板(zeocin的终浓度为100μg/ml)，涂布的量为80-100μl，将平板倒置于28℃培养箱培养2-3天至长出单菌落。iii.高拷贝菌株筛选1、从转化平板上挑取单菌落点至高浓度ypds抗性平板(zeocin的浓度为500-1000μg/ml)，将平板倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。2.挑取若干个在高浓度抗性平板上生长良好的菌落，接种至ypd培养基，28℃，200rpm振荡培养，采用玻珠法抽提基因组dna，用pcr的方法筛选阳性菌株。二、发酵表达与后处理纯化。1.重组菌株的摇瓶发酵表达将所有阳性菌株分别接种至5mlypd培养基，28℃，220rpm振荡培养过夜，按10％的比例转接至装有50mlbmgy培养基的500ml挡板摇瓶，30℃，220rpm振荡培养，当吸光值od600＝4-6时，4℃，9000rpm离心5min收集菌体，用50ml诱导培养基bmmy重悬菌体，28℃，220rpm诱导培养至120h，期间每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，同时取样检测发酵液的蛋白浓度，筛选出目的蛋白表达量最高的菌株，发酵120h时，表达量最高的菌株胞外总蛋白浓度在1200mg/l。经验证后的表达量最高的表达菌种命名为yx-01。2.重组菌株的高密度发酵与后处理以摇瓶发酵初筛到的表达水平最高的yx-01菌株出发，在5l玻璃发酵罐上采用分批补料培养的方式生产目的蛋白。将高产目的蛋白菌株yx-01接种至装有200mlbmgy培养基的2l挡板摇瓶中，28℃，220rpm振荡培养18-20h至od600＝4-6时，以10％的接种量接入到起始装液量为2l基础盐培养基fm22的5l发酵罐中，进行分批补料培养，菌体生长阶段和诱导阶段温度分别设定为30℃和28℃，搅拌速度500-800rpm，do维持在25％以上，通气量维持在1-3vvm，流加28％(w/w)氨水和34％(w/w)磷酸自动控制ph为6.0。当碳源的甘油耗尽后，补加400ml50％的甘油，当do再次上升后，流加100％甲醇至罐中甲醇的终浓度为0.5％(v/v)，0-6h流加速度为1.5-3.5ml(l/h)，6-24h，逐渐提高流加速度到6-8ml(l/h)，并一直维持该速度至发酵结束，发酵过程中根据do的波动适当调节甲醇流速。发酵过程，每隔6-8h取样，检测菌体湿重、蛋白浓度。发酵至200h时，胞外总蛋白浓度达到7g/l。发酵结束后，经蝶式离心方式收集发酵上清液，在上清液中加入半胱氨酸至终浓度40mm，加热至68℃保温30分钟，降温至室温(15-25℃)，蝶式离心收取上清液。上清液经0.45um折叠滤芯过滤澄清后上样至预平衡的deae-sepharose柱(平衡缓冲液：5mm磷酸盐，ph6.0)，进样浓度2-5g/l，以4ml/min过柱吸附，然后分别经含0.2m和0.5mnacl的10mm磷酸盐(ph8.0)进行梯度洗脱。洗脱收集蛋白液经100kda超滤膜系统(厦门三达)进行浓缩和脱盐，浓缩蛋白液经喷雾干燥制备为无/低苯丙氨酸蛋白粉。sds-page胶显示，蛋白纯度约95％，如图3所示；氨基酸分析结果显示，苯丙氨酸含量1.5mg/g。具体质量分析结果如表8所示。表8.pku3蛋白质粉的质量检测指标结果蛋白质含量94％蛋白纯度95％水分含量4.5％苯丙氨酸含量1.5mg/g蛋白lnaa:phe比值269lnaa总量40.30％实施例4.表达无苯丙氨酸蛋白的丝状真菌重组表达菌株构建及蛋白发酵生产与制备本实施例以里氏木霉表达系统为例，阐述丝状真菌表达系统表达无/低苯丙氨酸蛋白的菌种构建以及蛋白表达与制备。实施例中采用的里氏木霉rut-c30(trichodermareeseirut-c30)购自广东微生物菌种保藏中心。实施例中采用的质粒pmdt05为申请人的另外1件专利申请(申请号：201810177819.3)中的pmdt05，其构建信息参见该申请的说明书实施例2。试验用试剂除特别注明外，均为市售科研试剂或耗材，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参考常规实验手册中的操作。一、表达无苯丙氨酸蛋白的里氏木霉菌种构建1.尿嘧啶缺陷型菌株的构建(1)pyr4基因敲除载体pmdt05-pyr4ko构建用柱式真菌基因组dna抽提试剂盒提取里氏木霉rut-c30的基因组dna，以基因组dna为模板，用表9中的引物pyr4-up-f/pyr4-up-r，pyr4-down-f/pyr4-down-r，pcr扩增上游同源臂pyr4-up和下游同源臂pyr4-down，然后通过重叠pcr扩增pyr4-up+down，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段；pcr片段与bglii和xbai双酶切的质粒pmdt05用无缝克隆试剂盒组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素)筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。表9.pmdt05-pyr4ko载体构建相关引物引物名称引物序列(5‘-3‘)pyr4-up-fttctgcgtcgaattcagatctagtgtttgatgctcacgctcgpyr4-up-rtaaatgcctttctttcgaggcgagggagttgctttaatgpyr4-down-fctccctcgcctcgaaagaaaggcatttagcaagaaggpyr4-down-rgccactagtaagctttctagatgaacagtaaggtgtcagcatgpyr4-fcgcctcttctttgtgcttttctcpyr4-rgtgggcttccttgtttctcgacc(2)重组质粒转化农杆菌取-80℃保存的农杆菌感受态于室温片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。每100μl感受态加1μg(体积不大于10μl)质粒dna，用手轻弹管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。加入700μl无抗生素的lb或yeb液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养3～4小时。6000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的lb或yeb平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。从转化平板上挑取单菌落至lb培养基(加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素和50ug/ml的链霉素)，28℃振荡培养至菌液浑浊，pcr筛选阳性菌株。(3)农杆菌介导转化里氏木霉rut-c30将含重组质粒的农杆菌菌株单菌落接种于lb培养基(含终浓度为50ug/ml的卡那霉素和50ug/ml的链霉素)，28℃培养过夜；收集菌体离心后用im液体培养基悬浮稀释至od660＝0.15，添加乙酰丁香酮200μmol/ml，28℃，200r/min，暗处培养至od660＝0.6～0.8；用5～8ml无菌水从新鲜培养的pda平板上洗下里氏木霉rut-c30的孢子，过滤得到分生孢子悬液，用im液体培养基调节孢子浓度至105～107个/ml，24℃萌发处理3～4h。取50ml活化的农杆菌菌液和50ml稀释的孢子悬液混合均匀，涂布在im平板的玻璃纸上，24～25℃暗处培养36～48h。将玻璃纸揭下，反铺到含有300ug/ml头孢霉素，5mg/ml5-foa，10mm尿苷，0.1％的tritonx-100的固体mm平板上，28℃培养4-6天直至转化子萌发。转化子在经过复筛得到转化成功的转化子。(4)筛选pyr4基因敲除菌株；将上步骤的转化子在pda平板培养3-4天，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表9中的pyr4-f/pyr4-r为引物进行pcr验证。若敲除成功，则扩增到约1500bp左右的条带。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100的pda平板上(加入终浓度为10mm的uridine)，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至pda培养基(加入终浓度为10mm的uridine)，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。该菌株命名为rut-c30(△pyr4)。2.单拷贝无苯丙氨酸蛋白表达菌株的构建(1)cbh1基因敲除载体的构建分两步构建：以里氏木霉rut-c30基因组dna为模板，用表10中的引物cbh1-up-f/cbh1-up-r，cbh1-down-f/cbh1-down-r，pcr扩增上游同源臂cbh1-up和下游同源臂cbh1-down，然后通过重叠pcr扩增cbh1-up+down，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段；pcr片段与bglii和xbai双酶切的质粒pmdt05用无缝克隆试剂盒组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，命名为pmdt05-cbh1-ko-01。以pmdt05-cbh1-ko-01质粒为模板，用表10中的引物p-cbh1-f/p-cbh1-r，pcr扩增约11000bp的载体骨架，用dpni消化处理2-3h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架；用表10中的引物cbh1-dr-f/cbh1-dr-r，pcr扩增cbh1-dr片段，用表10中的引物cbh1-ura3-f/cbh1-ura3-r，pcr扩增约2000bp的ura3表达框，然后表10中的引物cbh1-dr-f/cbh1-ura3-r，重叠pcr扩增cbh1-dr+ura3；将载体骨架与重叠pcr产物用无缝克隆试剂盒组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(含终浓度为50ug/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株dna测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。表10.pmdt05-cbh1-ko载体构建相关引物引物名称引物序列(5‘-3‘)cbh1-up-fttctgcgtcgaattcagatcttgcgatgtgtaatttgcctgccbh1-up-raggctttcgccacggagctagcacgagctgtggccaagacbh1-down-fcttggccacagctcgtgctagctccgtggcgaaagcctgcbh1-down-rgccactagtaagctttctagaagcccctgccagagtatctgp-cbh1-fagctccgtggcgaaagcctgp-cbh1-ragcacgagctgtggccaagaagcbh1-dr-fgccacagctcgtgctagctccgtggcgaaagcctgcbh1-dr-rcaatatcatcttctgtcgactcaattattgcgccactaatttccbh1-ura3-fttagtggcgcaataattgagtcgacagaagatgatattgaaggcbh1-ura3-rtttcgccacggagctcaactgcatccaaaccatcctcbh1-faattctggagacggcttgttgaatccbh1-rcatcgtaaccgagaatccagagctgtrpc-cx-fgcattcattgttgacctccactagcura3-lb-rgcatttgcttttgcgcgtggag(2)重组质粒转化农杆菌；依照本实施例的步骤1中(2)的描述将上步的构建的cbh1基因敲除重组质粒转化农杆菌。(3)农杆菌介导转化里氏木霉尿嘧啶缺陷型菌株rut-c30(△pyr4)；将含重组质粒的农杆菌菌株单菌落接种于lb培养基(含终浓度为50ug/ml的卡那霉素和50ug/ml的链霉素)，28℃培养过夜；收集菌体离心后用im液体培养基悬浮稀释至od660＝0.15，添加乙酰丁香酮200μmol/ml，28℃，200r/min，暗处培养至od660＝0.6～0.8；用5～8ml无菌水从新鲜培养的pda平板上洗下里氏木霉rut-c30的孢子，过滤得到分生孢子悬液，用im液体培养基调节孢子浓度至105～107个/ml，24℃萌发处理3～4h。取50ml活化的农杆菌菌液和50ml稀释的孢子悬液混合均匀，涂布在im平板的玻璃纸上，24～25℃暗处培养36～48h。将玻璃纸揭下，反铺到含有300ug/ml头孢霉素，0.1％的tritonx-100的固体mm平板上，28℃培养4-6天直至转化子萌发。从mm平板上挑取转化子点至含300ug/ml头孢霉素的mm平板上，倒置于28℃过夜培养；从mm+c平板上挑取生长良好的菌落点至含100ug/ml潮霉素b的平板，倒置于28℃过夜培养；挑取在潮霉素平板上不长的菌株点至pda平板，倒置于28℃生孢培养。(4)cbh1基因敲除菌株的筛选；在pda平板培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表10中的cbh1-f/trpc-cx-f，ura3-lb-r/cbh1-r为引物进行pcr验证。若两组引物均能扩增到分别约为2000bp、1200bp左右的条带，则认为cbh1基因敲除成功，若未同时扩增到目的条带则认为未敲除成功。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100的pda平板上，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至pda培养基，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清液作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。(5)cbh1基因敲除菌株ura3筛选标记的删除cbh1基因敲除的菌株待孢子成熟后，用无菌水从pcr平板上洗下孢子，稀释合适的倍数后，涂布含10mm尿苷，5mg/ml5-foa，0.1％的tritonx-100的pda平板，倒置于28℃培养4-6天至长出单菌落，挑取单菌落点至含10mm尿苷的pda平板，28℃生孢培养。培养至3-4天时，从平板上挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表10中的引物cbh1-f/cbh1-r，pcr验证，如ura3删除成功，则扩增到约2400bp左右的条带，如未删除成功，则扩增到约4900bp左右的条带。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100、10mm尿苷的pda平板上，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至含10mm尿苷的pda培养基，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。该菌株命名为rut-c30(△pyr4，△cbh1)。(6)pku4基因敲入载体的构建根据无苯丙氨酸目的蛋白序列(pku4，蛋白序列见seqidno:4)和表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因。以pmdt05-cbh1-ko质粒为模板，用表11中的引物p-cbh1-f/p-cbh1-r，pcr扩增约13000bp的载体骨架，用dpni消化处理2-3h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，用表11中的引物pku4-f/pku4-r，pcr扩增pku4的cds序列及cbh1-dr序列，然后将载体骨架与pcr产物用无缝克隆试剂盒组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。表11.pmdt05-cbh1-pku4载体构建相关引物引物名称引物序列(5’-3’)pku4-fgccacagctcgtgctcagtcggcctgcactctccaatcpku4-ratcatcttctgtcgactcaattattgcgccactaatttccp-cbh1-f1tcgacagaagatgatattgaaggagp-cbh1-ragcacgagctgtggccaagaagpku4-yz-fgacctacccagtctcactacgpku4-yz-ratgaccacggagcctgtctgura3-lb-rgcatttgcttttgcgcgtggagcbh1-faattctggagacggcttgttgaatccbh1-rcatcgtaaccgagaatccagagctg(7)重组质粒转化农杆菌；依照本实施例的步骤1中(2)的描述将上步的构建的pku4基因重组质粒转化农杆菌。(8)农杆菌介导转化里氏木霉尿嘧啶缺陷型菌株rut-c30(△pyr4，△cbh1)；依照本实施例的步骤2中(3)的描述将上步的转化有重组质粒的农杆菌进行里氏木霉尿嘧啶缺陷菌种的转化。(9)pku4基因敲入菌株的筛选；将上步转化后的菌种在pda平板培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表11中的cbh1-f/pku4-yz-r，ura3-lb-r/cbh1-r为引物进行pcr验证。若两组引物均能扩增到分别约为1500bp、1200bp左右的条带，则认为cbh1位点整合pku4基因成功，若未同时扩增到目的条带则认为未整合成功。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100的pda平板上，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至pda培养基，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。(10)pku4基因敲入菌株的ura3筛选标记的删除；cbh1位点敲入pku4基因的阳性菌株待孢子成熟后，用无菌水从pcr平板上洗下孢子，稀释合适的倍数后，涂布含10mm尿苷，5mg/ml5-foa，0.1％的tritonx-100的pda平板，倒置于28℃培养4-6天至长出单菌落，挑取单菌落点至含10mm尿苷的pda平板，28℃生孢培养。培养至3-4天时，从平板上挑取少量菌丝至20μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表11的引物pku4-yz-f/cbh1-r，pcr验证，如ura3删除成功，则扩增到约1200bp左右的条带，如未删除成功，则扩增到约3600bp左右的条带。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100、10mm尿苷的pda平板上，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至含10mm尿苷的pda培养基，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。该菌株命名为rut-c30(△pyr4，cbh1：：pku4)。3.双拷贝无苯丙氨酸蛋白表达菌种的构建(1)cbh2位点敲入pku4基因载体的构建分两步构建：以里氏木霉rut-c30基因组dna为模板，用表12中的引物cbh2-up-f/cbh2-up-r，cbh2-down-f/cbh2-down-r，cbh2-ura3-f/cbh2-ura3-r，pcr扩增上游同源臂cbh2-up、下游同源臂cbh2-down和ura3表达框，然后进行三片段重叠pcr扩增cbh2-up+ura3+down，并用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收pcr片段；pcr片段与bglii和xbai双酶切的质粒pmdt05用无缝克隆试剂盒组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(含终浓度为50ug/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，命名为pmdt05-cbh2-pku4-01。以pmdt05-cbh2-pku4-01质粒为模板，用表12中的引物p-cbh2-f/p-cbh2-r，pcr扩增约13000bp的载体骨架，用dpni消化处理2-3h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架；用表12中的引物pku4-f1/pku4-r1，cbh2-dr-f/cbh2-dr-r，pcr分别扩增pku4和cbh2-dr片段，然后用表12中的引物pku4-f1/cbh2-dr-r，重叠pcr扩增pku4+cbh2-dr；将载体骨架与重叠pcr产物用无缝克隆试剂盒组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(含终浓度为50ug/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，命名为pmdt05-cbh2-pku4。表12.pmdt05-cbh2-pku4载体构建相关引物引物名称引物序列(5‘-3‘)cbh2-up-fttctgcgtcgaattcagatctgcatctgactagttgtatcgcbh2-up-rcaatatcatcttctgtcgaatgtatcaatgggttatacgtatccbh2-down-fggatggtttggatgcagttgaaagatcgattcggcagtcgcbh2-down-rgccactagtaagctttctagatatgtgagcaacaataataccbh2-dr-fctggattctcggttacgatgaaagatcgattcggcagtcgcbh2-dr-ratcatcttctgtcgaacgcgctattaacgtttggaaacbh2-ura3-fgtataacccattgatacattcgacagaagatgatattgaaggcbh2-ura3-rcgactgccgaatcgatctttcaactgcatccaaaccatccpku4-f1aacccattgatacatgaattctcacggtgaatgtaggpku4-r1cgactgccgaatcgatctttcatcgtaaccgagaatccagpku4-yz-fgacctacccagtctcactacgpku4-yz-r1gtccaccattctccagagattcura3-lb-rgcatttgcttttgcgcgtggagcbh2-fgttgtatgtagcctctgcagcbh2-rcaacgtacctacctagtgtcg(2)重组质粒转化农杆菌依照本实施例的步骤1中(2)的描述将上步的构建的pku4基因重组质粒转化农杆菌。(3)农杆菌介导转化里氏木霉尿嘧啶缺陷型菌株rut-c30(△pyr4，cbh1：：pku4)依照本实施例的步骤2中(3)的描述将上步的转化有重组质粒的农杆菌进行里氏木霉尿嘧啶缺陷菌种的转化。(4)pku4基因双拷贝敲入菌株的筛选在pda平板培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表12中的cbh2-f/pku4-yz-r，ura3-lb-r/cbh2-r为引物进行pcr验证。若两组引物均能扩增到分别约为1600bp、1500bp左右的条带，则认为cbh2位点整合pku4基因成功，若未同时扩增到目的条带则认为未整合成功。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100的pda平板上，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至pda培养基，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。(5)cbh2位点敲入pku4基因菌株的ura3筛选标记的删除cbh2位点叠加敲入pku4基因的阳性菌株待孢子成熟后，用无菌水从pcr平板上洗下孢子，稀释合适的倍数后，涂布含10mm尿苷，5mg/ml5-foa，0.1％的tritonx-100的pda平板，倒置于28℃培养4-6天至长出单菌落，挑取单菌落点至含10mm尿苷的pda平板，28℃生孢培养。培养至3-4天时，从平板上挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表12的引物pku4-yz-f/cbh2-r，pcr验证，如ura3删除成功，则扩增到约1200bp左右的条带，如未删除成功，则扩增到约3600bp左右的条带。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100、10mm尿苷的pda平板上，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至含10mm尿苷的pda培养基，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。该菌株命名为rut-c30(△pyr4，cbh1：：pku4，cbh2：：pku4)。4.双拷贝无苯丙氨酸蛋白表达菌种的pyr4基因修复(1)pyr4基因修复质粒的构建以质粒pmdt05-pyr4-ko为模板，用表13中的引物p-pyr4-f/p-pyr4-r，pcr扩增约12000bp的载体骨架，用dpni消化2-3h后用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架；用表13中的引物pyr4修复-f/pyr4修复-r，pcr扩增pyr4基因序列；将载体骨架与重叠pcr产物用无缝克隆试剂盒组装，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布lb平板(加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素)，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液pcr筛选，筛选到的阳性菌株测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用，命名为pmdt05-pyr4修复。表13.pmdt05-pyr4修复载体构建相关引物引物名称引物序列(5’-3’)pyr4修复-factccctcgcctcgagacgactcggatcgcacgaaatpyr4修复-rtaaatgcctttctttacttctttcttcccttccctccp-pyr4-faaagaaaggcatttagcaagaagp-pyr4-rtcgaggcgagggagttgctttaatgpyr4-fcgcctcttctttgtgcttttctcpyr4-rgtgggcttccttgtttctcgaccpyr4-yz-fcacaagctgattggcatcgcpyr4-yz-rgcttgaacaggtaagccgtcag(2)重组质粒转化农杆菌；依照本实施例的步骤1中(2)的描述将上步的构建的重组质粒转化农杆菌。(3)农杆菌介导转化里氏木霉rut-c30(△pyr4，cbh1：：pku4，cbh2：：pku4)依照本实施例的步骤2中(3)的描述将上步的转化有重组质粒的农杆菌进行里氏木霉尿嘧啶缺陷菌种的转化。(4)pyr4基因修复菌株的筛选；将上步转化的菌种在pda平板培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，用表13中的pyr4-f/pyr4-yz-r，pyr4-yz-f/pyr4-r为引物进行pcr验证。若两组引物均能扩增到分别约为1700bp、1500bp左右的条带，则认为pyr4基因修复成功，若未同时扩增到目的条带则认为未修复成功。pcr鉴定为阳性的菌株，待孢子成熟后，用无菌水洗下孢子制备成孢子悬液，进行梯度稀释，稀释合适的倍数后涂布在含有0.1％的tritonx-100的pda平板上，倒置于28℃培养2-3天至长出单菌落。挑取若干个单菌落转接至pda培养基，28℃培养3-4天时，挑取少量菌丝至30μl无菌水，98℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清作为模板，pcr验证。pcr鉴定为阳性的菌株继续培养至第7天孢子成熟。构建成功的菌种，命名tr01。二、无苯丙氨酸蛋白的重组发酵表达与制备。1.种子液的制备将表达无苯丙氨酸蛋白的重组里氏木霉菌种tr01接种于多个pda固体平板中，28℃培养7d，待分生孢子长成绿色后，用无菌水冲洗收集孢子悬液，并调整孢子浓度到1.0*108个/ml左右，以1％接种量接种于500ml种子培养基中，28℃避光震荡(170转/分)培养24-36h，以其作为7l发酵罐发酵的种子液。2、里氏木霉菌株tr01在50l发酵罐中发酵里氏木霉的整个发酵过程分为以下两个阶段：第一阶段为菌丝体生长阶段(0～72h)：在50l发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)中加入28l基础发酵培养基(葡萄糖20g/l，玉米浆粉7g/l，kh2po44g/l，尿素1g/l，硫酸铵2g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，cacl21g/l，mncl21mm，mandels微量元素(1000x)1ml/l，ph4.0)，按10％的比例接种制备好的里氏木霉种子液，28℃通气搅拌培养72小时左右，溶氧量维持在30％以上，搅拌转速根据溶氧量进行调整，一般控制在250-500转/分钟，ph维持在3.5-4.0左右。在菌丝体生长阶段，随着里氏木霉菌体的生长，一般在24-28h左右葡糖糖基本消耗完，此时以12ml/h的速率补加250g/l乳糖溶液。培养至72h左右菌体的干重达到15-18g/l。第二阶段为诱导表达阶段(72～168h)：在发酵开始的第72h，通过蠕动泵流加250g/l的乳糖溶液，使其工作浓度始终不超过2g/l，溶氧量始终大于20％，28℃通气搅拌培养至接种后188小时左右，ph维持在5.0左右。每隔24小时取样检测发酵液上清目的蛋白浓度，发酵180小时左右发酵液上清蛋白量可达到10g/l。放罐后的发酵液，加入1％的珍珠岩，进行板框过滤除去菌丝体，收集滤清液。在板框滤清液中加入0.5％的活性炭，搅拌均匀，静置10-15分钟脱色，然后加入1％的珍珠岩混匀后上板框过滤除去脱色活性炭，收集滤清液。滤清液经过0.45μm孔径的折叠滤芯(上海一鸣)过滤，收集透过液，澄清后的透过液边搅拌边加入磷酸调节ph至2.0-2.5，室温下静置3h沉淀目的蛋白，弃去上清液。目的蛋白沉淀浓缩经200nm无机陶瓷膜用纯水清洗3遍，然后浓缩至30-50g蛋白/l，浓缩液经喷雾干燥得到无/低苯丙氨酸蛋白粉。蛋白粉的蛋白质含量，蛋白纯度(如图4所示)，苯丙氨酸含量以及lnaa/phe的检测结果如表14所示。表14.pku4蛋白质粉的质量检测指标结果蛋白质含量81％蛋白纯度87％水分含量6.5％苯丙氨酸含量4.1mg/g蛋白lnaa/phe比值101lnaa总量40.50％实施例5.表达无苯丙氨酸蛋白大肠杆菌菌种的构建与蛋白发酵生产与制备参照实施例1所述的方案构建表达pku5(蛋白序列见seqidno：5)的发酵菌种ku-2；进行发酵表达生产与纯化制备，经喷雾干燥得到无苯丙氨酸的蛋白粉。蛋白粉的质量分析如表15所示。表15.pku5蛋白质粉质量检测指标结果蛋白质含量91％蛋白纯度82％水分含量6％苯丙氨酸含量1.3mg/g蛋白lnaa:phe比值348lnaa总量46.07％实施例6.表达无苯丙氨酸蛋白芽孢杆菌菌种的构建与蛋白发酵生产与制备参照实施例2所述的方案构建表达pku6(蛋白序列见seqidno：6)的发酵菌种bl02；进行发酵表达生产与纯化制备，经喷雾干燥得到无苯丙氨酸的蛋白粉。蛋白粉的质量分析如表16所示。表16.pku6蛋白质粉质量检测指标结果蛋白质含量84％蛋白纯度87％水分含量6％苯丙氨酸含量2.3mg/g蛋白lnaa:phe比值196lnaa总量45.17％实施例7.表达无苯丙氨酸蛋白毕赤酵母菌种的构建与蛋白发酵生产与制备参照实施例3所述的方案构建表达pku7(蛋白序列见seqidno：7)的发酵菌种yx02；进行发酵表达生产与纯化制备，经喷雾干燥得到无苯丙氨酸的蛋白粉。蛋白粉的质量分析如表17所示。表17.pku7蛋白质粉质量检测指标结果蛋白质含量84％蛋白纯度87％水分含量6％苯丙氨酸含量0.5mg/g蛋白lnaa:phe比值336lnaa总量41.36％实施例8.表达无苯丙氨酸蛋白里氏木霉菌种的构建与蛋白发酵生产与制备参照实施例4所述的方案构建表达pku8(蛋白序列见seqidno：8)的发酵菌种tr02；进行发酵表达生产与纯化制备，经喷雾干燥得到无苯丙氨酸的蛋白粉。蛋白粉的质量分析如表18所示。表18.pku8蛋白质粉质量检测指标结果蛋白质含量84％蛋白纯度87％水分含量6％苯丙氨酸含量1.0mg/g蛋白lnaa:phe比值410lnaa总量40.87％实施例9.降低血液苯丙氨酸效果试验苯丙酮尿症模型鼠(pahenu2)购自美国jacksonlaboratory公司，共20只，雄雌各半，体重100-120g，喂食特制低苯丙氨酸饲料(tekladresearch公司提供)3天后，尾静脉采血，检测血液中苯丙氨酸含量。随机分为五组(每组4只，雌雄各半)，分别喂食只含牛乳清蛋白的定制鼠粮和只含本发明实施例1-4中制备的无/低苯丙氨酸蛋白的鼠粮，持续7天，并与第7天尾静脉采血，检测血清中的苯丙氨酸含量，结果如表19所示.表19.无/低苯丙氨酸蛋白粉干预对大鼠血液苯丙氨酸浓度的影响结果显示，本专利技术生产的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉，与常规膳食蛋白(乳清蛋白)相比，可有效的控制苯丙酮尿症模型鼠的血液中的苯丙氨酸含量，防治苯丙酮尿症或高苯丙氨酸血症。在试验过程中，所有测试鼠生长状态良好，且主动摄取含本专利蛋白粉的鼠粮，说明本专利蛋白粉的安全性比较好，且感官依从度与乳清蛋白无明显差异。序列表<110>深圳市诺维健生物技术有限责任公司<120>一组特殊膳食蛋白质<160>82<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>385<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metlyslysglnasnaspileproglnproileargglyasplysgly151015alathrvallysileproargasnilegluargaspargglnasnpro202530aspmetleuvalproprogluthrasphisglythrvalserasnmet354045lystrpserthrseraspthrhisasnargleuglulysglyglytyr505560alaarggluvalthrvalarggluleuproilesergluasnleuala65707580servalasnmetargleulysproglyalailearggluleuhistrp859095hislysglualaglutrpalatyrmetiletyrglyseralaargval100105110thrilevalaspglulysglyargsertyrileaspaspvalglyglu115120125glyaspleutrptyrtyrproserglyleuprohisserileglnala130135140leuglugluglyalaglucysleuleuvaltyraspaspglysertyr145150155160sergluasnserthrtrpglnleuthrasptrpleualahisthrpro165170175lysgluvalilealaalaasntrpglyvalthrlysglugluileser180185190asnleuproglylysglulystyrilealagluasnglnleuprogly195200205serleulysaspaspilevalgluglyproasnglygluvalprotyr210215220proalathrtyrargleuleugluglngluproilegluserglugly225230235240glylysvaltyrilealaaspserthrasntyrlysvalserlysthr245250255ilealaseralaleuvalthrvalgluproglyalametarggluleu260265270histrphisproasnthrhisglutrpglntyrtyrileserglylys275280285alaargmetthrvaltrpalaseraspglyhisalaargthrtrpasn290295300tyrglnalaglyaspvalglytyrvalprotrpalametglyhistyr305310315320valgluasnileglyaspgluproleuvaltyrleugluilecyslys325330335aspasphistyralaaspvalserleuasnglntrpleualametleu340345350progluthrtyrvalglnalahisleuaspleuglylysasptrpthr355360365aspvalleuserlysglulyshisprovalvallyslyslysserser370375380lys385<210>2<211>274<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2alaglnthrvalprotyralaileproleuilelysglyasplysval151015glnglyglnalatrplysalaglyasnvallysvalglyvalleuasp202530thralaileglnglyserhisproaspleuasnvalvalglyalagly354045sertyrvalglyalagluglytyrasnthraspalaasnalahisala505560thrhisvalglyalathrvalglyglyleuaspasnthrthralaval65707580leualavalglyproservalserleutyrglyvallysvalleuasn859095serseralaseralasertyrseralailevalseralaileglutrp100105110glythrthrasnalametaspvalileasnmetserleualaalagly115120125seralaserthrglymetlysglnglyvalaspasnglytyrglyarg130135140alavalvalvalvalglyglyalaalaasnseralaserseralaasn145150155160thrasnthrilealatyrproglylystyraspservalileglyval165170175alaglyvalaspserasnserasnargglysertrpserservalala180185190glygluleugluvalmetglyproalaglyalavaltyrserthrtyr195200205prothrasnthrtyrglythrleuasnalathrsermetglyserpro210215220hisvalglyalaglyalaglyleuileleuserlyshisproasnleu225230235240serglyserglnvalargasnargleuserserthralathrt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