本发明属于虫草培育领域，具体涉及一种以黑水虻虫蛹为寄主培育的蛹虫草及其培育方法。
背景技术：
蛹虫草(cordycepsmilitaris)亦称北虫草，是子囊菌门肉座目麦角菌科虫草属的模式种，主要以鳞翅目昆虫为寄主，通过不同方式侵染昆虫幼体，经过不断的生长发育突破昆虫体表而形成的一种真菌与虫体外壳共存的虫菌复合体，是一类具有显著滋补功效的药食同源真菌。蛹虫草作为传统中草药材，我国人民对其药用价值早有认识，在《本草纲目》等医学名著中都对蛹虫草有所记载。近些年来，随着人们对健康的日渐重视，蛹虫草被发现在抗肿瘤、抗病原微生物、保护肝肾及呼吸系统、清除人体内自由基、调节免疫系统和内分泌系统等方面都可以起到作用。
蛹虫草在功能食品和医药等方面都有很好的开发利用前景，目前已被国家科技部批准为冬虫夏草的替代品和新资源食品。近年来，以鳞翅目经济昆虫家蚕幼虫为寄主人工栽培蛹虫草的技术不断成熟，也有一些使用鞘翅目和双翅目的昆虫作为寄主的文献公开。
黑水虻是一种双翅目水虻科昆虫，虫体含有丰富的粗脂肪(干重达30％以上)、蛋白质(干重达45％以上)、氨基酸、维生素、矿物质元素，其脂肪酸组成也较合理，不饱和脂肪酸含量较高，而且还含有丰富的亚麻酸，是低胆固醇食品的潜在来源，是如今常见的经济昆虫之一。由于黑水虻的营腐特性，常规饲养的黑水虻幼虫体内含有大量的病原微生物，若直接用于人工栽培蛹虫草的寄主，感染僵化率和出草率都较低，且蛹虫草子实体短小，不均匀，因而目前还未有报道使用黑水虻虫蛹作为寄主来培育蛹虫草。
技术实现要素：
为此，本发明要解决的技术问题是，提供一种杂菌污染率低，感染僵化率、出草率高且稳定的以黑水虻虫蛹为寄主培育的蛹虫草及其培育方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种以黑水虻虫蛹为寄主培育的蛹虫草，所述蛹虫草由蛹虫草菌株感染黑水虻虫蛹培育而成，其黑水虻虫蛹体呈黑色或棕褐色，体表略带橙黄色的菌丝，子实体为棒形或多分枝状，橙黄色的，单个或多条丛生于黑水虻虫蛹体表。
优选地，所述蛹虫草菌株cordycepsmilitari的保藏号为cicc14013。
优选地，所述黑水虻虫蛹体长度为2-3cm，子实体长度3-5cm，每个蛹虫草重量为0.5-1.2g。
本发明还公开了上述以黑水虻虫蛹为寄主培育的蛹虫草的培育方法，包括如下步骤：
s1：将原料蛹虫草菌株经多级菌株扩培，将培养得到的液体菌株过滤，得到用于接种感染的菌株滤液；
s2：选择6龄中后期健康黑水虻幼虫，通风条件下连续给黑水虻人工饲料饲养2天后断食，及时去除排泄物，选取健壮的黑水虻幼虫作为寄主备用；
s3：将s1得到的菌株滤液经稀释后注入s2选取的黑水虻幼虫的体内；注射完成后立即将虫体放在竹筛匾，通风条件下培养3天后，用纱网盖住，通风条件下继续培养4-5天，待95％以上虫体被感染僵化后，收集整理感染僵化尚未发菌的虫体；
s4：将感染僵化尚未发菌的虫体置于无菌透明塑料盒中进行保湿光/暗交替培养，获得成熟蛹虫草。
优选地，所述步骤s1中的多级菌株扩培为，将0.5-0.7cm见方大小的蛹虫草菌株斜面母种接种于固体平板培养基上，活化7-8天后，无菌操作下，将所述固体平板培养基均匀分割成0.5-0.7cm见方大小，取10-18块及时接种于1-1.5l液体培养基中，在黑暗条件、温度20-25℃下静置培养2d，第3天开始振荡培养，每12小时振荡3-4h，振荡速度100-150r/min，第7天在120lx光照强度下培养1天，过滤除去菌丝，获得菌株滤液。
优选地，
所述蛹虫草斜面母种为蛹虫草菌株cordycepsmilitari(保藏号为cicc14013)；活化后，经过黑水虻虫粉复壮后备用；
所述固体平板培养基由如下重量份的原料组成：马铃薯块25重量份、蔗糖2重量份、牛肉膏蛋白胨0.3重量份、黑水虻虫粉3重量份、琼脂粉1.5重量份、kh2po40.15重量份、mgso40.05重量份和水100重量份；
添加液体培养基由如下重量份的原料组成：马铃薯块25重量份、蔗糖2重量份、牛肉膏蛋白胨0.45重量份、黑水虻虫粉4重量份、kh2po40.2重量份、mgso40.1重量份、维生素b10.01重量份和水100重量份；
所述黑水虻虫粉由6龄黑水虻幼虫经微波干燥至含水4％以下，经粉碎后过40目筛制得。
上述固体、液体培养基制备过程为先将25重量份马铃薯块放入100重量份水中煮汁，在煮汁时加入其他组分，加热溶解后补足蒸发掉的水分，分装灭菌备用。
优选地，所述步骤s2中，饲养时的温度为20～32℃，相对湿度60～70％；
所述人工饲料成分为：桑叶粉10-30重量份、豆粕粉30-50重量份、玉米粉10-30重量份、复合维生素2.5重量份、柠檬酸2.5重量份、矿物质2.5重量份和防腐剂2.5重量份；
所述每个黑水虻幼虫每天的人工饲料喂食量为0.5-1.0g，与其每个黑水虻幼虫体重大致相当。
优选地，菌株滤液经稀释后od600控制在0.2-1.0之间，然后每个黑水虻幼虫注入0.05ml～0.15ml经稀释后的菌株滤液。
优选地，所述步骤s4中，所述保湿光/暗交替培养为：
首先放置在温度20℃～28℃、相对湿度60％～70％的黑暗环境下培养7～10天；
再转入光强为80～350lx，控制白天温度20～25℃、夜晚温度16～20℃,相对湿度70～75％的条件下培养5～6天；
之后在通风条件下，转入光强为250～350lx，温度为20℃～28℃,相对湿度70％～80％的条件下培养40～50天。
优选地，所述通风条件为使用新风机热回收强制换气，换气量为每小时换气100％-200％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明利用双翅目水虻科黑水虻幼虫抗病性强、营养丰富、成本低等优势培育蛹虫草，适合规模化生产。同时本发明方法有利于黑水虻产业多元化发展，提高综合利用附加值，开发前景广阔。
2.本发明在接种前经人工饲料及断食，有利于净化黑水虻腔肠，减少腔肠内的病原微生物，从而使黑水虻虫体接种蛹虫草菌后，感染僵化稳定，出草率高，并且防止得到的蛹虫草存在对健康有威胁的病原微生物。
3.本发明在蛹虫草菌株扩培中通过往固体和液体培养基中添加黑水虻虫粉，能在扩培环节让蛹虫草菌株提前适应黑水虻虫的一些营养特性，便于后续在蛹虫草在虫蛹体内繁殖。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
首先制备下述实施例1-3及对比例所使用的菌株滤液：将1块0.5cm见方大小的蛹虫草菌斜面母种接种于固体平板培养基上，活化7天后，无菌操作下，将所述固体平板培养基均匀分割成0.5cm见方大小后，再取15块及时接种于1l液体培养基中，在黑暗条件、温度20℃下静置培养2d，第3天开始振荡培养，每12小时振荡3h、振荡速度100r/min，第7天在120lx光照强度下培养1天，用3层无菌纱布过滤除去菌丝，获得菌株滤液，测定该菌株滤液od600在0.8-1.2左右；
所述蛹虫草斜面母种为蛹虫草菌株cordycepsmilitari(保藏号为cicc14013)，活化后，经过黑水虻虫粉复壮后备用；
所述固体平板培养基由如下重量份的原料组成：马铃薯块250g、蔗糖20g、牛肉膏蛋白胨3g、黑水虻虫粉30g、琼脂粉15g、kh2po41.5g、mgso40.5g和水1000g；
添加液体培养基由如下重量份的原料组成：马铃薯块250g、蔗糖20g、牛肉膏蛋白胨4.5g、黑水虻虫粉40g、kh2po42g、mgso41g、维生素b10.1g和水1000g；
所述黑水虻虫粉由6龄黑水虻幼虫经微波干燥至含水4％以下，经粉碎后过40目筛制得。
上述固体、液体培养基制备过程为先将250g马铃薯块放入1000g水中煮汁，在煮汁时加入其他组分，加热溶解后补足蒸发掉的水分，分装灭菌备用。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
(1)选择六龄中后期黑水虻健康幼虫，在温度25℃，相对湿度60％，保证通风条件下，连续喂幼虫同体重人工饲料2天后断食，选择健壮的黑水虻幼虫备用；
所述人工饲料成分为：桑叶粉30g、豆粕粉40g、玉米粉20g、复合维生素2.5g、柠檬酸2.5g、矿物质2.5g和防腐剂等其他成分2.5g；
(2)取步骤(1)所得健壮黑水虻幼虫，每头注射经稀释后od6000.8的菌株滤液0.15ml，注射完成后立即将虫体放在竹筛匾上，然后在温度20℃，相对湿度60％，通风条件下培养3天；再用纱网盖住，温度21℃，相对湿度70％，通风条件下继续培养5d，待95％以上虫体被感染僵化后，收集整理感染僵化尚未发菌的虫体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的虫体；
(3)将步骤(2)所得感染僵化尚未发菌的虫体整齐放置于无菌透明塑料盒中，放置在温度20℃、相对湿度60％的黑暗环境下培养10天；再转入光强为100lx，温度为白天22℃、夜晚16℃,相对湿度70％的条件下培养6天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为250lx，温度为20℃,相对湿度70％的条件下培养50天，即获得成熟黑水虻蛹虫草。
本实施例培育指标统计：黑水虻虫体感染率91.5％，未感染率6.5％，杂菌污染、机械致死等损失合计2％，成功感染的黑水虻虫体中出草率为90％，子实体长3-4cm。
实施例2
本实施例包括以下步骤：
(1)选择六龄3d健康黑水虻虫体，在温度28℃，相对湿度65％，保证通风条件下，连续日喂幼虫等体重人工饲料2天后断食，选择健壮的黑水虻幼虫备用；；
上面所述人工饲料：桑叶粉10g、豆粕粉50g、玉米粉30g、复合维生素2.5g、柠檬酸2.5g、矿物质2.5g和防腐剂2.5g。
(2)选择步骤(1)所得健壮的黑水虻幼虫，每头注射经稀释后od6001.0的虫草菌株滤液0.10ml的菌株滤液，注射完成后立即将虫体放在竹筛匾上，然后在温度23℃，相对湿度70％，通风条件下培养3d；再用纱网盖住，温度24℃，相对湿度70％通风条件下继续培养8d，待95％以上虫体被感染僵化后，收集整理感染僵化尚未发菌的虫体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的虫体；
(3)将步骤(2)所得感染僵化尚未发菌的虫体整齐放置于无菌透明塑料盒中，放置在温度22℃、相对湿度70％的黑暗环境下培养8天；再转入光强为200lx，温度为白天22℃、夜晚18℃,相对湿度75％的条件下培养5天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为250lx，温度为20℃,相对湿度75％的条件下培养45天，即获得成熟黑水虻蛹虫草。
本实施例培育指标统计：黑水虻虫体感染率88.3％，未感染率5.4％，杂菌污染、机械致死等损失合计6.3％，成功感染的黑水虻虫体中出草率为92％，子实体长3.5-4.5cm。
实施例3
本实施例包括以下步骤：
(1)选择六龄中后期健康黑水虻虫体，在温度28℃，相对湿度65％，保证通风条件下，连续日喂幼虫等体重人工饲料2天后断食，选择健壮的黑水虻幼虫备用；
上面所述人工饲料：桑叶粉20g、豆粕粉40g、玉米粉30g、复合维生素2.5g、柠檬酸2.5g、矿物质2.5g和防腐剂2.5g。
(2)选择步骤(1)所得健壮洁净的黑水虻幼虫，每头注射经稀释后od6000.6的虫草菌株滤液0.015ml的菌株滤液，注射完成后立即将虫体放在竹筛匾上，然后在温度25℃，相对湿度70％，通风条件下培养3d，；再用纱网盖住，于温度25℃，相对湿度65％，通风条件下继续培养7d，待95％以上虫体被感染僵化后收集整理感染僵化尚未发菌的虫体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的虫体；
步骤(2)中，接种时应缓慢平稳推进，尽量减轻对虫体的机械性创伤，以避免虫体尚未感染僵化过早死亡。
(3)将步骤(2)所得感染僵化尚未发菌的虫体整齐放置于无菌带盖透明塑料盒中，放置在温度23℃、相对湿度65％的黑暗环境下培养7天；再转入光强为260lx，温度为白天21℃、夜晚17℃,相对湿度73％的条件下培养4天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为300lx，温度为23℃,相对湿度80％的条件下培养40天，即获得成熟黑水虻蛹虫草。
本实施例培育指标统计：黑水虻虫体感染率92.4％，未感染率4.5％，杂菌污染、机械致死等损失合计3.1％，成功感染的黑水虻虫体中出草率为95％，子实体长4-5cm。
对比例
本对比例和实施例1唯一的区别在于本对比例在选择黑水虻幼虫时未经人工饲料净化处理。
本对比例包括以下步骤：
(1)选择六龄中后期黑水虻健康幼虫备用；
(2)取步骤(1)所得健壮黑水虻幼虫，每头注射经稀释后od6000.8的菌株滤液0.15ml，注射完成后立即将虫体放在竹筛匾上，然后在温度20℃，相对湿度60％，通风条件下培养3天；再用纱网盖住，温度21℃，相对湿度70％，通风条件下继续培养5d，收集整理感染僵化尚未发菌的虫体，剔除因杂菌感染、变黑软化或未感染僵化的虫体；
(3)将步骤(2)所得感染僵化尚未发菌的虫体整齐放置于无菌透明塑料盒中，放置在温度20℃、相对湿度60％的黑暗环境下培养10天；再转入光强为100lx，温度为白天22℃、夜晚16℃,相对湿度70％的条件下培养6天；在带盖透明塑料盒盖打孔透气后，再转入光强为250lx，温度为20℃,相对湿度70％的条件下培养50天，即获得对比例黑水虻蛹虫草。
本对比例培育指标统计：黑水虻虫体感染率47％，未感染率18％，杂菌污染、机械致死等损失合计35％，成功感染的黑水虻虫体中出草率为45％，子实体长1～3cm。
通过实施例1和对比例的比较可得，使用未经人工饲料净化处理的黑水虻幼虫作为寄主时，其感染率大幅下降，即使感染成功，其出草率和子实体长度也明显不如实施例1，经济价值大大降低。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。