液滴的形成方法、生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒与流程

本申请是申请日为2015年2月2日、优先权日为2014年1月31日、中国专利申请号为201580006310.7、发明名称为“生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法”的分案申请。

本发明涉及生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法。

本申请基于2014年1月31日于日本申请的日本特愿2014-017942号主张优先权，其内容援引于此。

背景技术：

已知通过对生物分子进行分析来进行疾病或健康状态诊断(体质诊断)。例如，有利用单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism：snp)分析进行的健康状态诊断、利用体细胞突变分析进行的抗癌药给药判断、利用病毒的蛋白或dna的分析进行的感染病对策等。

近来，通过世界性人类基因组分析已经弄清楚了约31亿个碱基对的序列，弄清楚了人的基因数约为3～4万个。人类在个体间存在碱基序列的差异，将特定群体人口的以1％以上的频率存在的碱基序列的差异称作基因多型。其中启示，snp与多种疾病具有关联性。

例如，关于人的遗传疾病认为，一个基因中的snp是导致生病的原因。另外认为，多个基因中的snp对生活习惯病或者癌症等也有影响。因此认为，snp的分析在药物靶点的探索或副作用的预见等药品开发中是极为有效的。因而，snp的分析作为世界性的巨大项目正在推进。

作为药物效果或副作用程度方面存在个体差异的原因之一，可举出与每个人的药物代谢有关的酶群的差异。最近逐渐弄清楚了，该差异是由snp等基因上的微小差异所导致的。

近年来考虑通过预先对患者的基因进行分析以选择最适合的药剂来向患者给药的方法。此外，不仅限于单基因遗传病、对于多因子疾病而言，基因诊断的意义也急速增加。另外，以病原菌或病毒为靶的药物的效果有时是同种，有时每个个体不同，这多是由每个个体的基因的微细差异所导致的。可以预料，今后这样的作为外来因子的病原菌或病毒的基因诊断作为检查对象也会确实地增加。

如此，在后基因组时代的医疗中，重要的是能够对人或病原微生物的基因的微小差异、特别是snp进行分析，可以预料今后其重要性也会增加。

一直以来研究了各种对碱基序列的微小差异、特别是snp进行分析的方法(参照非专利文献1～2)。为了进行实用水平上的分析，要求在低成本、方法的简便性、信号检测时间的长短、检测结果的正确性等方面均优异。但是，到目前为止还未知有满足上述所有要求的方法。

对snp进行分析时，一般情况是目标基因片段在试样中仅微量地含有。此时，需要通过任何方法预先对目标基因进行扩增。pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链反应)法作为迅速且重现性高的基因扩增法一直以来被大家所熟知。

一般来说，为了检测目标基因一个碱基的差异，需要以下两阶段的工序：使用了pcr法等的基因扩增阶段；和研究所扩增的基因的一个碱基的差异的阶段(参照非专利文献3)。但是，需要两阶段工序的方法由于工序多，因此处理变得繁杂。此外，pcr法由于需要进行温度升降，因此需要在装置大型化、耐热性的反应容器和反应液不蒸发方面下功夫。

作为不需要二阶段反应的snp检测方法，有侵入物法。侵入物法不需要pcr的扩增，由于可以等温地促进反应，因此装置可以小型化。但是，在侵入物法中，由于不包括基因的扩增工序，因此信号扩增慢、为了进行检测判定需要数小时的反应时间。侵入物法是使用了酶反应的检测方法。其中，在使用了酶的信号扩增中，作为缩短信号浓度达到饱和的时间的方法，考虑在微小空间内使其反应的方法。

在微小空间内进行侵入反应时，由于1个孔内含有的分析对象分子可以达到1个以下、分析对象分子处于表观上被浓缩的状态，因此可以缩短信号达到饱和的时间。另外，由于使进入1个孔内的检测分子为1个以下，因此通过计数获得信号的孔，可以准确地研究检测分子的浓度。

例如，专利文献1显示了通过在具有1pl以下容积的微小空间内进行酶反应，能够进行基因检测。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2004-309405号公报

非专利文献1：landegren、laboratoryprotocolsformutationdetection、oxforduniversitypress、1996年

非专利文献2：ahmadian等、biotechniques、第32卷、第1122～1137页、2002年

非专利文献3：jbiochembiophysmethod、第70卷、第50、2007年、789～795页

技术实现要素：

发明所要解决的课题

即，在snp分析中当利用pcr时能够在短时间内进行检测，但机器构成变得复杂、步骤变得繁杂。另外，在未利用pcr的等温反应中，至snp分析结束所需要的时间长、反应性低。因此，这些现有的方法并不实用。

本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供能够进行迅速且定量的生物分子的分析且能够提高反应性的生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法。

用于解决课题的手段

本发明第一方式的生物分子分析试剂盒为如下构成：其具有用于进行酶反应的反应容器，所述反应容器包含具有容器形状部的基体部和设置在所述容器形状部的至少内表面的低吸附结构部，所述低吸附结构部与所述酶反应中的作为分析对象的试样和用于所述酶反应的试剂中的至少一个的吸附率比所述基体部的吸附率低；在所述反应容器内进行酶反应时，对由所述酶反应产生的信号进行检测。

所述低吸附结构部与所述试样的吸附率比所述基体部低，与所述基体部露出至所述反应容器内的情况相比，所述信号检测时的背景可以更低。

所述低吸附结构部与所述试样的吸附率比所述基体部低，与所述基体部露出至所述反应容器内的情况相比，所述信号检测时的信号强度可以更高。

为了使所述吸附率比所述基体部低，所述反应容器可以在所述容器形状部的内表面进一步具有所述基体部的表面经改性的改性部，所述容器形状部可以是具有直径为5微米以下的大致圆形的开口部的有底圆柱形状。

为了使所述吸附率比所述基体部低，所述反应容器可以在所述容器形状部的内表面进一步具有层叠于所述基体部上的低吸附物质层，所述容器形状部可以是具有直径为5微米以下的大致圆形的开口部的有底圆柱形状。

本发明第二方式的生物分子分析试剂盒为如下构成：其具有用于进行酶反应的反应容器和能够供给至所述反应容器且在所述酶反应中使用的试剂，所述反应容器具有能够供给作为分析对象的试样的容器形状部及形成有所述容器形状部的基体部；所述试剂含有用于降低所述试样和所述试剂中的至少一个对所述基体部的吸附率的防吸附剂，在所述反应容器内进行所述酶反应时，检测由所述酶反应产生的信号。

所述酶反应可以是等温反应。

作为分析对象的所述试样可以含有dna、rna、mirna、mrna、蛋白中的任一种，分析对象物质可以是dna、rna、mirna、mrna、蛋白中的任一种。

分析对象物质可以是核酸、所述酶反应可以是侵入反应。

所述试剂可以通过荧光、发光、ph、吸光、电位中的任一种产生信号。

所述防吸附剂可以是表面活性剂。

所述表面活性剂可以是非离子性表面活性剂。

所述非离子性表面活性剂可以是tween20。

所述非离子性表面活性剂可以是triton-100。

所述表面活性剂的浓度可以是0.0005％以上且5％以下。

本发明第三方式的生物分子分析方法使用上述第一方式或第二方式的生物分子分析试剂盒。

本发明第四方式的生物分子分析试剂盒为如下构成：其具有用于进行酶反应的反应容器和能够供给至所述反应容器且在所述酶反应中使用的试剂，所述反应容器具有能够通过流路供给试样的容器形状部和形成有所述容器形状部的基体部；所述试剂含有用于降低所述试剂的表面张力的表面活性剂，在所述反应容器内进行酶反应时，对由所述酶反应产生的荧光或发色信号进行检测。

本发明第五方式的生物分子分析方法具有下述工序：在具有流路及多个容器形状部的反应容器中，将试剂送液至所述流路，将所述试剂填充到所述多个孔中，将油性密封液送液至所述流路，利用所述油性密封液将所述多个孔内的所述试剂密封，从而使所述多个孔形成为多个独立的核酸检测反应容器；其中，所述试剂及所述油性密封液中的任一个含有表面活性剂。

本发明第五方式的生物分子分析方法还可以在将所述试剂填充于所述多个孔之前，进一步具有通过所述流路将洗涤用的缓冲液填充到所述多个容器形状部的工序。

本发明第六方式的生物分子分析方法是使用了上述第一方式、第二方式或第四方式的生物分子分析试剂盒的生物分子分析方法，其中，在将洗涤用的缓冲液供给至所述容器形状部之后，将所述试剂供给至所述容器形状部。

发明效果

根据本发明的上述方式，可提供能够进行迅速且定量的生物分子的分析且能够提高反应性的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒。

附图说明

图1为应用本发明第一实施方式的生物分子分析方法的生物分子分析试剂盒的截面图。

图2为本发明第一实施方式的生物分子分析方法的流程图。

图3为表示本发明第一实施例的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图4为表示本发明第一实施例的荧光强度测定试验的结果的图。

图5为表示本发明第一实施例的反应时间测定试验的结果的表。

图6为应用本发明第二实施方式的生物分子分析方法的生物分子分析试剂盒的截面图。

图7为应用本发明第二实施方式的生物分子分析方法的生物分子分析试剂盒的截面图。

图8为应用本发明第二实施方式的生物分子分析方法的生物分子分析试剂盒的截面图。

图9为表示本发明第二实施方式的生物分子分析方法的流程图。

图10为表示本发明第二实施例的孔的显微镜照片。

图11a为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0％、加热时间为10分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11b为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.0005％、加热时间为10分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11c为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.001％、加热时间为10分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11d为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.005％、加热时间为10分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11e为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.05％、加热时间为10分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11f为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.5％、加热时间为10分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11g为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为5％、加热时间为10分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11h为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.0005％、加热时间为20分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11i为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.001％、加热时间为20分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11j为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.005％、加热时间为20分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11k为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.05％、加热时间为20分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11l为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为0.5％、加热时间为20分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图11m为表示本发明第二实施例中、在tween20的浓度为5％、加热时间为20分钟的条件下的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图12为表示本发明第二实施例的荧光强度测定试验的结果的图。

图13为用于说明本发明第二实施方式的生物分子分析方法的作用效果的图。

图14a为表示本发明第三实施例的样品1的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图14b为表示本发明第三实施例的样品2的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图14c为表示本发明第三实施例的样品3的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图14d为表示本发明第三实施例的样品4的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图14e为表示本发明第三实施例的样品5的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

图14f为表示本发明第三实施例的样品6的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。

具体实施方式

(第一实施方式)

以下一边参照图1及图2一边说明本发明第一实施方式的生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法。

图1为能够应用本实施方式的生物分子分析方法的生物分子分析试剂盒的截面图。本实施方式的生物分子分析试剂盒中，作为进行分析的生物分子，选择dna、rna、mirna、mrna(以下有时称作rna类)、蛋白中的任一种。

如图1所示，生物分子分析试剂盒100具备构成反应容器10的软性平板12及玻璃基板14、和能够将反应容器10密封的盖玻片13。

反应容器10具有：成形为具有一端开口的有底圆柱形状微小空间11(容器形状部)的基体部2、和配置于基体部2表面的低吸附结构部3。

通过对聚二甲基硅氧烷(pdms(polydimethylsiloxane))制的软性平板12进行压印，制作微小空间11，从而形成反应容器10。

构成反应容器10的微小空间11是一端具有开口部的有底圆柱形状的空间。微小空间11例如具有5μm的直径l1及5μm的深度l2。例如，微小空间11的容量为约100飞升(fl)。反应容器10中形成有多个微小空间11的阵列。即，微小空间11在反应容器10中整列地配置。

例如，微小空间11在软性平板12中，相对于具有纵横为5mm长方形的表面、排列成沿着其各边的格子状。各微小空间11之间的间隙大小在各微小空间11中根据能够独立地进行信号检测的分解能力来设定。

微小空间11的容积可以适当地设定，但微小空间11的容积小时能够缩短至信号能够检测的反应时间。作为一例，微小空间11的容积为100皮升(pl)或更低。

具体而言，当为了缩短使信号饱和、产生足够的信号所需的时间时，根据分析对象分子在1个孔中为1个以下的液量设定微小空间11的容积。

软性平板12例如形成在玻璃基板14上。玻璃基板14的厚度考虑到以软性平板12为材料、在通过压印形成多个微小空间11的过程中具有充的分强度的问题来适当设定。

本实施方式中，低吸附结构部3例如具有以下的构成。

(构成例1)

低吸附结构部3在基体部2的表面中位于反应容器10的微小空间11内表面的区域具有疏水性。例如，低吸附结构部3具有通过按照基体部2的表面变为疏水性而进行改性所形成的改性部4。

(构成例2)

低吸附结构部3在基体部2的表面中在位于反应容器10内表面的区域具有低吸附物质层4a。低吸附物质层4a由成为使用了本实施方式的生物分子分析试剂盒100的分析对象的试样或其分析试剂的吸附率低的材料形成。例如，低吸附物质层4a为疏水性覆膜。

另外，作为低吸附物质层4a的另一例子，可举出具有荧光物质不能透过的分子结构的高分子覆膜。该高分子覆膜优选具有与上述pdms相比更为致密的分子结构，通过抑制荧光物质的透过而发挥防止信号强度降低的效果。另外，对于除pdms以外，可以根据成为基体部2的材料的物质的分子结构来选择具有能够防止试剂透过的分子结构的高分子覆膜。这些高分子覆膜可抑制信号强度的降低。

另外，低吸附结构部3的高分子覆膜不限于抑制荧光物质透过的覆膜，还可以根据所使用的试剂适当选择抑制与酶反应有关的物质透过的覆膜。

接着，说明能够优选应用于本实施方式的生物分子分析试剂盒100的试剂的组成。

本实施方式中，通过在各试剂中含有防吸附剂，可以防止试剂的构成成分吸附于生物分子分析试剂盒100的反应容器10内表面。

防吸附剂的组成例如是含有表面活性剂、磷酸脂质、其他高分子化合物中的至少1种的组成，还可以混合使用任意的材料。若进行举例，作为表面活性剂，可举出非离子性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂，可举出tween或glycerol、triton-x100等。另外，作为高分子化合物，可举出polyethyleneglycol(聚乙二醇，peg)、dna、蛋白。

另外，作为混合了2种以上材料的防吸附剂，例如可举出混合了磷酸脂质和peg的防吸附剂。

作为表面活性剂使用非离子性表面活性剂时，优选试剂所含的非离子性表面活性剂的浓度为5％以下。使用tween20时，试剂所含的tween20的浓度优选为0.0005％以上且5％以下的范围、特别优选为0.001％以上且0.5％以下的范围。tween20的浓度为0.0005％以上时，可以独立地对多个微小空间11中的反应进行检测，可以准确地测量微小空间11的荧光。tween20的浓度为5％以下时，可获得充分的酶反应。

这些防吸附剂即使是吸附到反应容器10的微小空间11内表面的物质也可以。通过将含有防吸附剂的试剂供给至反应容器10内，使防吸附剂吸附于反应容器10的内表面。其结果，反应容器10的内表面与不含防吸附剂的情况相比，成为酶反应中使用的酶、作为分析对象的核酸或蛋白以及信号检测中利用的标记物质等不易吸附的状态。

另外，当在微小空间11中加入油时，还可以在油中加入上述防吸附剂。

在从最开始将酶反应中使用的酶、作为分析对象的核酸或蛋白以及信号检测中利用的标记物质等中的至少1个供给至反应容器10内部之前到信号检测结束的期间，优选与反应容器10内部接触的试剂中的至少任一个含有防吸附剂。例如，防吸附剂可以混合在用于将试剂稀释至规定浓度的缓冲液等溶剂中。

在从最开始将酶反应中使用的酶、作为分析对象的核酸或蛋白以及信号检测中利用的标记物质等中的至少1个供给至反应容器10内部之前到信号检测结束的期间，与反应容器10内部接触的全部试剂可以含有吸附剂。

另外，防吸附剂优选是不阻碍酶反应或信号扩增反应的物质。

接着，对使用了本实施方式的生物分子分析试剂盒100的生物分子分析方法进行说明。图2为表示本实施方式的生物分子分析方法的流程图。

首先，向反应容器10的微小空间11滴加含有作为分析对象的物质(本实施方式中例如为dna)的试剂(图2所示的步骤s101)。具体而言，在本实施方式中滴加的试剂含有侵入反应试剂(1μmalleleprobe、0.4μminvaderoligo、1μmfamlabellingarm、20mmmopsph为7.5、15mmnacl、6.25mmmgcl2、50u/μlcleacase)及dna。

滴加至反应容器10的微小空间11的试剂的液量可以根据微小空间11的数量适当设定。另外，滴加至反应容器10的微小空间11的试剂的液量及其浓度按照在1个微小空间11内加入1个dna的方式进行调整。例如，本实施方式中，滴加至反应容器10的微小空间11中的试剂的液量总计为0.5μl，将0.5μl的液体分配到多个微小空间11中。

接着，用盖玻片13覆盖反应容器10的微小空间11(图2所示的步骤s102)。由此，各微小空间11成为密封有侵入反应试剂及dna的独立的反应室。

接着，微小空间11内密封有侵入反应试剂及dna的反应容器10例如用62℃的烘箱进行孵育(图2所示的步骤s103)。通过该孵育，侵入反应中等温下进行的信号扩增适当地进行。

接着，各微小空间11内密封有侵入反应试剂及dna的反应容器10在经过预先设定的时间后取出，测量具有荧光的孔数及其荧光量(图2所示的步骤s104)。

需要说明的是，本实施方式中，除了荧光的检测以外，还可以应用以可见光的发光、发色、ph的变化、电位变化等为信号进行检测的检测体系。另外，还可将本实施方式的构成应用于分析蛋白。

(第二实施方式)

以下一边参照图6一边说明本发明第二实施方式的生物分子分析试剂盒及生物分子分析方法。本实施方式的生物分子分析试剂盒100a含有核酸定量用阵列器件20、试剂和油性密封液。

图6为本实施方式的核酸定量用阵列器件20的截面图。本实施方式的生物分子分析试剂盒中，作为进行分析的生物分子，选择dna、rna、mirna、mrna(以下有时称作rna类)及蛋白中的任一种。

如图6所示，核酸定量用阵列器件20具备反应容器30、盖部27、注入口部(未图示)和排出口部(未图示)。反应容器30具有基体部23和流路31。基体部23上形成有多个孔(容器形状部)26、基板24和微小孔阵列层25。

微小孔阵列可以直接形成在基板24上，也可利用粘接、熔融粘合等手段将形成有微小孔阵列的构件固定设置在基板24上。

基板24是由实质上透明的材料构成的板状构件。基板24的材质例如为树脂或玻璃。具体而言，基板24可以由聚苯乙烯或聚丙烯形成。基板24只要是搬送核酸定量用阵列器件20的装置或者具有在操作者手动操作处理时不会破损的程度的刚性即可。

微小孔阵列层25是多个贯通孔25a排列形成的层。微小孔阵列层25的层厚为3μm、在微小孔阵列层25与盖部27之间空有100μm的间隔。贯通孔25a是一端具有开口部的有底圆柱形状的空间。贯通孔25a是直径为5μm、中心线方向的长度为3μm的圆柱形状。例如，贯通孔25a的容积为约60飞升(fl)。

各贯通孔25a的容积可以适当设定，但贯通孔25a的容积小时，能够缩短至信号能够检测的反应时间。

作为一例，各贯通孔25a的容积为100皮升或其以下。

另外，本实施方式中，除了检测荧光之外，还可以应用以可见光的发光、发色、ph的变化、电位变化等为信号进行检测的检测体系。另外，还可以将本实施方式的构成应用于分析蛋白。

各贯通孔25a之间的中心线间的距离(间距)只要比各贯通孔25a的直径大即可。

各贯通孔25a的间隔(间隙)的大小在各贯通孔25a中独立地根据能够进行信号检测的分解能力来设定。

各贯通孔25a相对于微小孔阵列层25呈三角格子状进行排列。

其中，各贯通孔25a的排列方式并无特别限定。通过形成于微小孔阵列层25的贯通孔25a和基板24的表面24a，在基体部23上形成以基板24为底面部26a的有底筒状的微小的孔26(容器形状部)。

具体而言，当为了缩短使信号饱和而产生充分的信号所花费的时间时，根据达到分析对象分子在1个孔中为1个以下的液量，设定孔26的容积。

微小孔阵列层25的材质可以是树脂或玻璃等。微小孔阵列层25的材质可以与基板24的材质相同，也可与基板24的材质不同。另外，微小孔阵列层25还可以利用与基板24相同的材料进行一体化。另外，微小孔阵列层25还可以利用与基板24相同的材料进行一体成型。作为由树脂构成的微小孔阵列层25的材质的例子，可举出环烯烃聚合物或有机硅、聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚醋酸乙烯酯、氟树脂、无定形氟树脂等。另外，作为微小孔阵列层25的例子显示的这些材质仅仅是例子，微小孔阵列层25的材质并不限定于这些。

另外，微小孔阵列层25还可以被着色。若对微小孔阵列层25进行着色，则当在孔26内进行荧光、发光、吸光度等光的测定时，来自与作为测定对象的孔26相邻的其他孔26的光的影响得以减小。

微小孔阵列层25通过对层叠在基板24上的疏水性膜的整面图案进行蚀刻、压花形成或切削等加工而形成贯通孔25a。另外，当微小孔阵列层25与基板24一体成型时，通过对基板24实施蚀刻、压花形成或切削等加工，形成与微小孔阵列层25的贯通孔25a相当的部分。由此，可以在基板上形成具有疏水部及亲水部的图案。

盖部27与基体部23之间具有间隙并按照将多个孔26的开口部分覆盖的方式重叠在基体部23上。基体部23与盖部27之间成为各种液体流过的流路31。本实施方式中，各种液体从注入口部向排出口部从基体部23与盖部27之间流过。

接着，对可适宜应用于本实施方式的生物分子分析试剂盒100a的试剂的组成进行说明。

如图7及图8所示，检测反应试剂21是能够从注入口部送液至基体部23与盖部27之间的溶液。检测反应试剂21是用于针对分析对象物质进行酶反应等生化反应的试剂。

针对分析对象物质的生化反应例如在dna(核酸)为分析对象物质时，在核酸存在的条件下发生信号扩增等的反应。检测反应试剂21例如根据能够检测核酸的方法进行选择。例如，在invader(注册商标)法、lamp法(注册商标)、taqman(注册商标)法或荧光探针法或者其他方法中使用的试剂包含在本实施方式的检测反应试剂21中。

本实施方式中，当分析对象物质为核酸时，可以不进行如以往那样的pcr法中的核酸扩增工序地进行检测，也可根据需要将使用pcr法等对分析对象核酸进行扩增而得到的产物作为样品使用。

另外，当分析对象物质为核酸以外时，为了能够应用于本实施方式，也可在进行必要的前处理后应用本实施方式。

本实施方式中，通过在各试剂的至少1个中含有防吸附剂，可以防止试剂的构成成分吸附在生物分子分析试剂盒100a的孔26的内表面。也可以是各试剂全部含有防吸附剂。

作为试剂的例子，可举出缓冲液、检测反应试剂、样品(分析对象物：dna、rna类、蛋白等)溶液、密封液、试剂或样品的稀释用溶剂。

防吸附剂的组成例如是含有表面活性剂、磷酸脂质、其他高分子化合物中的至少1种的组成，可以与任意的材料混合使用。若进行举例，作为表面活性剂，可举出非离子性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂，可举出tween或glycerol、triton-x100等。另外，作为高分子化合物，可举出polyethyleneglycol(乙二醇，peg)或dna、蛋白。

另外，作为混合有2种以上材料的防吸附剂，例如可举出混合有磷酸脂质和peg的防吸附剂。

作为表面活性剂使用非离子性表面活性剂时，试剂中所含的非离子性表面活性剂的浓度优选为5％以下。使用tween20时，试剂中所含的tween20的浓度优选为0.0005％以上且5％以下的范围、特别优选为0.001％以上且0.5％以下的范围。当tween20的浓度为0.0005％以上时，可以独立地检测多个孔26中的反应，可以准确地测量孔26的荧光。tween20的浓度为5％以下时，可获得充分的酶反应。

表面活性剂并不限定于非离子性。作为表面活性剂，可以使用离子性表面活性剂(阴离子、阳离子、两性离子)。可以使用离子性表面活性剂之间的混合物、或者离子性表面活性剂与非离子性表面活性剂的混合物。

另外，也可使用表面活性剂与高分子化合物的混合物作为防吸附剂。

接着，对可适宜应用于本实施方式的生物分子分析试剂盒100a的油性密封液22的组成进行说明。

本实施方式中，为了防止试剂的构成成分吸附在生物分子分析试剂盒100a的孔26的内表面，油性密封液22中也可含有防吸附剂。

油性密封液22(参照图8)是能够自注入口部送液至基体部23与盖部27之间的溶液。油性密封液22可以选自不与含有分析对象物质的试样相混合的材料。作为油性密封液22，可以使用矿物油或氟系液体的fc40等。

另外，本实施方式中，为了防止试剂的构成成分吸附在生物分子分析试剂盒100a的孔26的内表面，还可在对试剂进行送液之前，对孔洗涤用的缓冲液进行送液。缓冲液中可含有防吸附剂。

这些防吸附剂即使是吸附在反应容器30的孔26的内表面的物质也没有关系。通过将含有防吸附剂的试剂供给至反应容器30内，使防吸附剂吸附在反应容器30的内表面。其结果，与不含防吸附剂的情况相比，反应容器30的内表面成为不易吸附酶反应中使用的酶、作为分析对象的核酸或蛋白及信号检测中利用的标记物质等的状态。

洗涤用的缓冲液中含有的防吸附剂可以是非离子性表面活性剂。作为非离子性表面活性剂，可举出tween或glycerol、triton-x100等。另外，洗涤用的缓冲液还可以构成试剂的一部分。

在从最开始将酶反应中使用的酶、作为分析对象的核酸或蛋白以及信号检测中利用的标记物质等中的至少1个供给至反应容器30的内部之前到信号检测结束的期间，优选与反应容器30内部接触的试剂中的至少1个含有防吸附剂。例如，防吸附剂可以混合在用于将试剂稀释至规定浓度的缓冲液等的溶剂中。

另外，在从最开始将酶反应中使用的酶、作为分析对象的核酸或蛋白以及信号检测中利用的标记物质等中的至少1个供给至反应容器10的内部之前到信号检测结束的期间，与反应容器10内部接触的全部试剂中还可以含有吸附剂。

另外，防吸附剂优选是不阻碍酶反应或信号扩增反应的物质。

接着，对使用了本实施方式的生物分子分析试剂盒100a的生物分子分析方法进行说明。图9为表示本实施方式的生物分子分析方法的流程图。

首先，开放未图示的注入口部及排出口部，利用例如分注移液管等将含有防吸附剂的洗涤用缓冲液33通过注入口部送液至基体部23与盖部27之间的间隙中(图9所示的步骤s201)。缓冲液33按照将多个孔26全部覆盖的方式在基体部23与盖部27之间的间隙内扩散(参照图6)。由此，在基体部23的表面中位于贯通孔25a内表面的区域、及位于相邻孔之间的区域34中形成具有低吸附物质层35的低吸附结构部32。

也可以不对缓冲液33进行送液，而是在反应容器30中预先充满缓冲液33。此时，还可以利用膜等将注入口部、排出口部密封，预先将缓冲液33密封在反应容器30中。

接着，利用例如分注移液管等将含有作为分析对象的物质(本实施方式中例如为dna)的试剂通过注入口部送液至基体部23与盖部27之间的间隙中(图9所示的步骤s202)。具体而言，本实施方式中所填充的试剂含有侵入反应试剂(检测反应试剂21)(1μmalleleprobe、1μminvaderoligo、1μmfamlabellingarm、10mmmopsph为7.5、6.25mmmgcl2、50u/μlcleacase、tween20)及作为分析对象物质的dna。试剂按照将多个孔26全部覆盖的方式在基体部23与盖部27之间的间隙内扩散(参照图7)。另外，通过将试剂送液至基体部23与盖部27之间的间隙中，将缓冲液33从排出口部排出。另外，此时当试剂与缓冲液33为不同颜色时，可以容易地把握是否将试剂送液至了基体部23与盖部27之间的部分。

如图6所示，在由基体部23和盖部27形成的流路31中配置由基板24和微小孔阵列层25形成的多个孔26。充满于多个孔26内的缓冲液33通过使试剂流入，依次地在孔内从缓冲液33替换成试剂。

但是，将缓冲液33以保持在孔26内表面的状态维持的孔26也是存在的。此时，试剂不与充满于多个孔26内的缓冲液33相替换，而是成为试剂叠层于缓冲液33的状态。但是，由于缓冲液33与试剂相互间易于混合，因此在成为试剂叠层于缓冲液33的状态后，试剂中的溶质向缓冲液33扩散。因此，在缓冲液和试剂相替换的孔中的反应与缓冲液33和试剂相叠层的孔中的反应实质上是相同的。

填充于孔26中的液量可根据贯通孔25a的数量适当设定。另外，滴加入孔26中的液量及其浓度按照1个孔26中含有1个dna的方式进行调整。例如，本实施方式中，填充于孔26的液量在反应容器整体中为0.5μl，将0.5μl的液体分配到多个孔26中。

接着，如图8所示，自注入口部将油性密封液22送液至由基体部23和盖部27形成的流路31内。油性密封液22通过以试剂扩散至缓冲液的状态将多个孔26内的液体密封，使多个孔26成为多个独立的反应室(核酸检测反应容器)36。即，本实施方式中，通过油性密封剂22将各孔26覆盖，与第一实施方式中公开的微小空间同样，成为各孔26独立的状态。另外，油性密封液22在基体部23与盖部27之间的间隙内将处于多个孔26外部的液体自排出口部挤出(图9所示的步骤s203)。

进而，将各孔26中填充有侵入反应试剂及dna的阵列器件20例如在62℃的烘箱中孵育(图9所示的步骤s204)。通过该孵育，侵入反应中在等温下进行的信号扩增适当地进行。

接着，将各孔中填充有侵入反应试剂及dna的阵列器件20在预先规定的时间之后取出，测量具有荧光的孔数及其荧光量(图9所示的步骤s205)。

即，使用了本实施方式的生物分子分析试剂盒100a的生物分子分析方法具有以下工序：在具有流路及多个容器形状部的反应容器中，将试剂送液到流路中，向多个孔中填充试剂的工序(试剂送液工序)；在试剂送液工序之后，将油性密封液送液至流路，利用油性密封液将多个孔内的试剂密封，从而制成使多个孔为多个独立的核酸检测反应容器的工序(密封工序)。

另外，本实施方式中，除了检测荧光之外，还可以应用将可见光的发光、发色、ph的变化、电位变化等作为信号进行检测的检测体系。另外，还可将本实施方式的构成应用于分析蛋白。

另外，本实施方式中，通过在各试剂中含有防吸附剂，可以防止试剂的构成成分吸附到生物分子分析试剂盒100a的反应容器30的内表面。防吸附剂可以含有在全部试剂中，也可含有在试剂的一部分中。

另外，还可代替这样的防吸附剂，试剂中含有用于降低试剂构成成分的表面张力的物质。例如，表面活性剂会降低试剂的表面张力。因此，为了将试剂填充到各孔中，在试剂中含有表面活性剂也是有效的。

实施例

(第一实施例)

接着，对用于确认本发明第一实施方式的生物分子分析方法的作用效果的实施例进行说明。图3为表示本实施例的荧光量测定试验的结果的荧光图像图。图4为表示本实施例的荧光强度测定试验的结果的图。其中，图4的横轴表示反应时间、图4的纵轴表示荧光强度。图5为表示本实施例的反应时间测定试验的结果的表。其中，图5中，“良”表示定量性良好、“差”表示就定量性而言比本实施例差。

＜发出荧光的孔数的测量试验＞

首先，在反应容器10的微小空间11内封入侵入反应试剂，同时封入3种人工合成dna。这里，将各人工合成dna的浓度设定为1个孔加有1分子的为30pm、1个孔中加有1666分子的为50nm、1个孔中连1分子也没有的是0m。

然后，将反应容器10在62℃的烘箱中分别进行孵育，确认0分钟、10分钟、15分钟后的状态。

如图3所示，若dna浓度为30pm以上，则相对于为0m时的背景、在几乎所有的微小空间11内荧光量均产生差异，可知存在dna。

＜荧光强度的测量试验＞

接着，将密封有上述设定的人工合成dna的反应容器10在62℃的烘箱中孵育，为了确认0分钟、10分钟、15分钟后的状态，每个dna浓度选择5孔的图像，求出各图像中21像素的荧光量的平均值。这里，反应后的孔使用荧光显微镜(zeiss公司、ax10)、物镜(ecplan-neofluar40×oilna1.3)、光源(lej公司、fluoarc001.26ausablewithhbo10)、传感器(hamamatsuphotonics公司、em-ccdc9100)、滤光镜(奥林巴斯公司、u-mniba2)及分析软件(hamamatsuphotonics公司、aquacosmos2.6：曝光时间为64.3ms、em增益为180、偏移为0、像素组合为×1)进行测量。

如图4所示，在作为1个微小空间11内收纳有1个分子的浓度即30pm下，与0m时相比，检测到能够区分强度的荧光。

＜反应时间测定试验＞

接着，比较现有分析方法和本发明分析方法中的反应时间。在反应时间的测定试验中，作为与本发明的比较对象，采用以1纳升(nl)×多孔的试剂量进行数字pcr反应的方法(比较例1)、以20微升(μl)的试剂量进行pcr反应的方法(比较例2)、以20μl的试剂量进行pcr+侵入反应的方法(比较例3)、以20μl的试剂量进行侵入反应的方法(比较例4)、以及以100飞升(fl)×多孔的试剂量进行数字elisa反应的方法(比较例5)。

如图5所示，由反应时间的测定试验可知，在以1nl×多孔的试剂量进行数字pcr反应的比较例1中，需要60分钟的反应时间，温控为变温，定量性良好。在以20μl的试剂量进行pcr反应的比较例2中，需要60分钟的反应时间，温控为变温，定量性不良。在以20μl的试剂量进行pcr+侵入反应的比较例3中，需要60分钟的反应时间，温控为变温，定量性不良。

在以20μl的试剂量进行侵入反应的比较例4中，需要120分钟的反应时间，温控虽然为等温，但定量性不良。在以100fl×多孔的试剂量进行数字elisa反应的比较例5中，需要15分钟的反应时间，温控为等温，定量性良好。

与它们相对，以100fl×多孔的试剂量进行数字侵入反应的本实施例中，仅为10分钟的反应时间，温控为等温、定量性良好。由此可知，这是由于本实施例以100fl×多孔的试剂量进行了数字侵入反应。

(第二实施例)

接着，对用于确认本发明第二实施方式的生物分子分析方法的作用效果的实施例进行说明。图10为表示本实施例的孔的荧光图像图。图11a～图11m为表示本实施例的荧光强度测定试验的结果的荧光图像图。图12为表示本实施例的荧光强度测定试验的结果的表。其中，图12中的横轴表示tween20的浓度、图12的纵轴表示荧光强度。

＜核酸定量用阵列器件的制作＞

在0.5mm厚的玻璃制基板上旋涂cytop(注册商标)(旭硝子制)之后，在180℃下烘焙1小时。所形成的cytop的厚度为3μm。利用旋涂将cytop涂覆到基板上之后，涂覆正性光刻胶，使用光掩模形成图案。之后，通过o2等离子体对cytop进行干式蚀刻。为了将残留于表面的光刻胶除去，用丙酮和乙醇对表面进行洗涤、冲淋。

如图10所示，由cytop形成的孔(微小空间)的直径为5μm、具有能够在数分钟内检测通过侵入反应产生的信号的体积。在1个基体部上设有100块的孔阵列。另外，各个块具有10000个孔。因此，形成共计100万个孔。如图6所示，使用具有50μm厚度且加工成流路形状的双面胶将具有送液口(注入口部：未图示)的玻璃制板与基体部粘接。

＜试样与检测反应试剂的混合液的送液＞

确认由表面活性剂即tween20的浓度带来的液滴形成的容易度。

首先，将含有表面活性剂的洗涤缓冲液通过送液口送液至核酸定量用阵列器件中。之后，通过送液口将侵入反应试剂(检测反应试剂21：1μmalleleprobe、1μminvaderoligo、1μmfamlabellingarm、10mmmopsph为7.5、6.25mmmgcl2、50u/μlcleacase、tween20)22μl及作为分析对象物质的dna送液至核酸定量用阵列器件。

之后，通过送液口送液氟系液体fc40(油性密封液22)80μl，将试剂分别封入各孔内。将其在63℃的加热板上加热，实施侵入反应。

接着，使用荧光显微镜(奥林巴斯制)检测63℃下经过10分钟、20分钟时的各孔的荧光。曝光时间为明视野：100毫秒、niba：2000毫秒、mcherry：2000毫秒。

将利用显微镜观察加热10分钟后的各孔的结果示于图11a～图11g中。将利用显微镜观察加热20分钟后的各孔的结果示于图11h～图11m。

当tween20的浓度为0％时，由于即使在位于相邻孔之间的区域内也检测到荧光，因此无法准确地进行数字测量。作为其理由，考虑由于相邻孔的反应溶液的液滴之间相结合，因此在位于相邻孔之间的区域内试样发生了反应。另外，虽然相邻孔的反应溶液的液滴之间未结合，但考虑残留于位于相邻孔之间的基体部表面的试样发生了反应。另一方面，若tween20含有0.0005％以上，则确认到反应溶液的液滴各个分离。

另外，在加热20分钟后的孔中，若tween20含有0.001％以上，则确认到反应溶液的液滴各个分离。即，长时间加热时，若tween20含有0.001％以上，则认为与短时间加热时相比、重现性进一步提高。

图12为表示对应于tween20的浓度的荧光强度值的图。随着tween20的浓度提高、荧光强度减弱。即，随着tween20的浓度增加，确认到阻碍了反应的行为。因此推测tween20的最佳浓度为5％左右。另外，从成本的观点出发，更优选tween20的浓度为0.5％以下。

另外，将同样的试剂10μl分注到96孔板中，使用lightcyclerlc480(roche制)检测10μl体积时的反应性。lightcycler的温控条件为63℃、恒定。利用lightcycler在同样的组成时确认了反应，结果与tween20的浓度无关，侵入反应的荧光信号增加是一定的。由此可知，表面活性剂并不是用于提高酶的反应性、而是有助于液滴的稳定性。

表面活性剂只要添加能够防止试剂所含的检测对象物质吸附在cytop或玻璃等的浓度即可。为triron-x100等其他的表面活性剂时，最佳的浓度也可不同，但可以考虑tween20的例子。

(第三实施例)

接着，对用于确认本发明第二实施方式的生物分子分析方法的作用效果的其他实施例进行说明。图13为用于说明本发明第二实施方式的生物分子分析方法的作用效果的图。图14a～图14f为表示本实施例的荧光强度测定试验的结果的荧光图像图。图13中，反应性栏的“良”表示反应性良好。

图13中，液滴栏的“○”表示相邻2个孔之间未观察到荧光。图13中，液滴栏的“△”是指相邻2个孔之间观察到了荧光，但是对浓度测定没有影响的程度。图13中，液滴栏的“×”表示由于在相邻2个孔之间观察到荧光，存在使用相邻2个孔之间的区域时无法准确地进行数字测量的情况。

本实施例中使用第二实施例中使用的侵入反应试剂及dna，如图13所示，对于有无洗涤、洗涤用缓冲液中的有无表面活性剂的添加、反应试剂中有无表面活性剂的添加来改变条件，进行反应，由所得荧光图像确认液滴的状态及反应性。作为表面活性剂，将0.05％的tween20添加到洗涤用缓冲液或反应试剂中。对于其他条件，与第二实施例是同样的。

对于样品1及样品2，在洗涤用的缓冲液中添加表面活性剂进行洗涤。对于样品3及样品4，在洗涤用的缓冲液中未添加表面活性剂的情况下进行洗涤。对于样品5及6，未进行洗涤。此外，在样品1、3及5的反应试剂中添加了表面活性剂。另一方面，在样品2、4、及6的反应试剂中未添加表面活性剂。在任何样品中，反应性均良好。此外，如样品2所示可知，即使在反应试剂中不含有表面活性剂的情况下，当洗涤用的缓冲液中含有表面活性剂时，液滴良好地形成、反应性也良好。

如上文说明过的那样，根据本发明第一实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100及第二实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100a，通过在微小空间11或孔26内进行酶反应，可以进行迅速且定量的生物分子的分析。

另外，根据本发明第一实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100及第二实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100a，通过作为酶反应使用侵入物法，不需要进行pcr扩增，等温反应变得可能，因此可以简化机器构成及分析步骤。

另外，根据本发明第一实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100及第二实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100a，由于在收纳有1分子分析对象大小的微小空间11内或孔26内使其反应，因此可以缩短信号达到饱和所需要的时间。

另外，根据本发明第一实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100及第二实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100a，与以往相比，反应时间更短、sn比更高。

另外，根据本发明第一实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100及第二实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100a，由于酶反应是等温反应，因此与变温反应相比，可以获得稳定的酶反应、重现性更高。

另外，根据本发明第一实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100及第二实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100a，由于酶反应是侵入反应，因此与需要pcr的步骤相比，可以缩短用于进行信号的检测判定的时间。

另外，根据本发明第一实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100及第二实施方式的生物分子分析方法及生物分子分析试剂盒100a，由于微小空间11或孔26是100皮升以下，因此为了分析可以减少所消耗的试剂的量。

另外，上述实施方式中公开了将低吸附结构部和防吸附剂并用的例子。但是，只要采用低吸附结构部和防吸附剂中的至少任一者，则与未采用低吸附结构部和防吸附剂中的任一者的情况相比，可以进行迅速且定量的分析。

符号说明

100、100a生物分子分析试剂盒

2、23基体部

3、32低吸附结构部

4改性部

4a、35低吸附物质层

10、30反应容器

11微小空间(容器形状部)

12软性平板

13盖玻片

14玻璃基板

22油性密封液

24基板

26孔(容器形状部)

31流路

33缓冲液