一种壳聚糖水凝胶的制备方法与流程

本发明属于生物材料技术领域，尤其是涉及一种壳聚糖水凝胶的制备方法。

背景技术：

在众多的生物材料中，壳聚糖在组织工程与再生医学领域得到了越来越多的重视。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，甲壳素广泛存在于虾，蟹，真菌及藻类中，含量极其丰富。壳聚糖来源广泛，廉价易得，由于它具有良好的生物相容性、生物可降解性、促进组织再生、抗炎及抑菌作用，是fda认可的一类生物材料并且已被广泛的应用于生物医药领域。

壳聚糖可制成粉末、膜，纤维、水凝胶及多孔材料。而可注射的原位水凝胶具备可塑性强，能填充各种不规则缺损，创伤小等优点，并且具备类细胞外基质的的仿生特征，使之更加适用于组织再生领域。

壳聚糖可通过化学和物理的方法交联制备成水凝胶。化学交联主要是通过化学交联剂如戊二醛等反应形成三维结构，但化学交联剂一般都具有生物毒性，并且能够改变壳聚糖本身的结构影响它的性质，从而限制了壳聚糖化学交联原位水凝胶的临床应用潜力。壳聚糖物理交联的水凝胶避免了使用有毒的化学交联剂，因此在组织再生的应用前景更大。

壳聚糖物理交联水凝胶成胶原理为：在酸性环境中，壳聚糖表面的氨基质子化，从而溶于酸性溶液，当升高溶液的ph值至中性或碱性时，壳聚糖表面的氨基去质子化，壳聚糖链通过氢键，疏水作用及壳聚糖高分子链相互缠结等物理作用形成网络结构的超分子体系，从而由溶液转化为凝胶。

目前最常用的壳聚糖物理交联水凝胶的成胶方法是在壳聚糖溶液中加入弱碱甘油磷酸盐中和壳聚糖的氨基。但这种方法的缺陷是需要高浓度的磷酸盐，从而因其过高的渗透压而具有细胞毒性，因此限制了这种成胶方法在临床上的应用。而当在溶液中加入不同强碱时(包括naoh，caoh，nh4oh)，会发现壳聚糖立即在强碱局部析出，而不能形成均质的凝胶。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种壳聚糖水凝胶的制备方法。

本发明通过研究发现，制备壳聚糖物理交联水凝胶的关键问题是如何均匀的升高壳聚糖溶液的ph值从而使其凝胶化。

尿素可与水反应生成nh3和co2，称之为尿素的水解。尿素酶可以促使尿素快速水解并均匀的升高溶液ph值。因此本发明利用酶促尿素水解的原理使壳聚糖溶液的ph值均匀升高，制备了壳聚糖酶促物理交联水凝胶。

本发明在壳聚糖溶液中加入尿素与尿素酶，可均匀的升高壳聚糖溶液的ph值使其凝胶化。壳聚糖物理交联水凝胶成胶原理为：在酸性环境中，壳聚糖表面的氨基质子化，从而溶于酸性溶液，当升高溶液的ph值至中性或碱性时，壳聚糖表面的氨基去质子化，壳聚糖链通过氢键，疏水作用及壳聚糖高分子链相互缠结等物理作用形成网络结构的超分子体系，从而由溶液转化为凝胶。

另外，本发明的结果证实壳聚糖酶促物理交联水凝胶的成胶时间可通过调整尿素酶的浓度进行精确调控。因此本发明可以根据临床实际需要来选择不同尿素酶浓度的壳聚糖酶促物理交联水凝胶。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种壳聚糖水凝胶的制备方法，在壳聚糖溶液中加入尿素与尿素酶，可均匀的升高壳聚糖溶液的ph值使其凝胶化，得到壳聚糖水凝胶。

在本发明的一个实施方式中，所述壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解于醋酸或盐酸中，制备壳聚糖溶液。

在本发明的一个实施方式中，所述壳聚糖溶液的浓度为1-5g/100ml。

在本发明的一个实施方式中，在壳聚糖溶液中加入尿素的量为30-60mm。

在本发明的一个实施方式中，所述尿素是以尿素溶液的方式加入，所述尿素溶液为将尿素溶解于去离子水中制备8-10m的尿素溶液。

在本发明的一个实施方式中，在壳聚糖溶液中加入尿素酶的量为3-60u/ml。

在本发明的一个实施方式中，所述尿素酶是以尿素酶溶液的方式加入，所述尿素酶溶液为将尿素酶溶于pbs配制成5-1000u/ml的尿素酶溶液。

在本发明的一个实施方式中，各物料加入顺序为：将壳聚糖溶液与尿素酶溶液混合均匀，然后加入尿素溶液混合均匀制备壳聚糖酶促物理交联水凝胶。

在本发明的一个实施方式中，制备壳聚糖酶促物理交联水凝胶的过程中温度控制在20-37℃之间。

在本发明的一个实施方式中，制备壳聚糖酶促物理交联水凝胶的过程中通过移液器将各种溶液反复吹打数次混合均匀，或通过震荡或搅拌的方式实现溶液的混合均匀。

本方法通过上述制备方法制备得到了一种壳聚糖水凝胶。

本发明利用酶促尿素水解的原理使壳聚糖溶液的ph值均匀升高，制备了壳聚糖酶促物理交联水凝胶。与传统方法相比，本发明方法简单，容易制作，壳聚糖酶促物理交联水凝胶的成胶时间可通过调整尿素及尿素酶的浓度进行精确调控。

附图说明

图1为壳聚糖酶促物理交联水凝胶的制备示意图。

图2为壳聚糖酶促物理交联水凝胶成胶时间与尿素、尿素酶浓度之间的关系。

具体实施方式

一种壳聚糖水凝胶的制备方法，在壳聚糖溶液中加入尿素与尿素酶，可均匀的升高壳聚糖溶液的ph值使其凝胶化，得到壳聚糖水凝胶。

参考图1，在壳聚糖溶液中后加入1-50mg/l酚红作为ph指示剂，没有加入尿素与尿素酶前，溶液为黄色，加入尿素与尿素酶以后，溶液变为凝胶状态，且为紫色。

本发明提供一个实施方式，包括以下步骤：

1、制备0.1-0.2m盐酸/醋酸(可加入1-50mg/l酚红作为ph指示剂)；

2、将壳聚糖溶解于醋酸或盐酸中，制备浓度为1-5g/100ml的壳聚糖溶液；

3、将尿素酶(urease)溶于pbs配制成5-1000u/ml的尿素酶溶液；

4、将尿素(urea)溶解于去离子水中制备8-10m尿素溶液；

5、将壳聚糖溶液与尿素酶溶液混合均匀，然后加入尿素溶液混合均匀制备壳聚糖酶促物理交联水凝胶。

实施例1

本实施例以1ml浓度为2.5g/100ml的壳聚糖溶液出发，通过考察尿素酶的加入量分别为3.75、7.5、15、30、600u/ml，尿素的加入量分别为30、37.5、45、52.5、60mm的情况下，壳聚糖酶促物理交联水凝胶的成胶时间，结果如图2所示，采用试管倒置法检测壳聚糖酶促物理交联水凝胶成胶时间。将离心管中配好的溶液放于恒温金属浴或水浴锅中，使用秒表计时，凝胶时间为溶胶在离心管中流动至离心管倒置后不流动之间的时间。

从图2可以看出，一定范围内，壳聚糖酶促物理交联水凝胶的成胶时间可通过调整尿素及尿素酶的浓度进行精确调控，随着尿素及尿素酶加入量越多，所需成胶时间越短。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。