一种快速实现细胞膜可逆性损伤的装置及方法与流程

本发明涉及一种快速实现细胞膜可逆性损伤的装置及方法，属于计算机及生物医学领域。

背景技术：

随着科学技术的进步，人类对生命的探索不断深入，对生命的理解已经步入了细胞及亚细胞层次，越来越多的科学研究希望在不损伤细胞活性(可逆性损伤)的情况下，实现对微小细胞及细胞器的操控，从而促进细胞通讯、干细胞分化、基因疗法及胚胎发育等多个学科领域的发展。

现存的利用物理机制实现细胞膜可逆性损伤的方法有声学方法、热学方法、磁学方法、电学方法等，但这些方法因为操作复杂、可控性差等问题而在细胞膜可逆性损伤的应用中受限。

目前基于激光技术实现细胞膜可逆性损伤的装置主要有两种：一种是通过紧聚焦技术实现泵浦光束在特定细胞膜的靶向定位，利用紧聚焦光束的非线性能量沉积，实现细胞膜的可逆性损伤；第二种是将纳米颗粒与宿主细胞进行鳌合，通过靶向能量沉积实现细胞膜的可逆性损伤。上述两种装置或系统都存在难以克服的缺点：第一种装置中泵浦光源模块需进行紧聚焦光束整形，故此种装置只能单次处理一个细胞，此外，其聚焦位点不易调控，泵浦激光光辐射密度较高而易造成不可逆损伤，可选光源脉宽十分有限。第二种方法，虽然可以实现高通量的细胞处理速度，但制备宿主细胞膜表面抗体修饰的纳米颗粒耗时较长，且宿主细胞与金纳米颗粒配比参数、孵化时间及最佳纳米颗粒形貌等参数的优化探究及其耗时且工作量巨大。

目前现存的两种实现细胞膜可逆性损伤的方法由于存在较大的局限性，从而难以有效地、快速地实现细胞膜可逆性损伤。

技术实现要素：

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种快速实现细胞膜可逆性损伤的装置及方法，该装置耦合了经硅烷化处理后的特殊细胞培养池模块，克服了因宿主细胞膜表面受体对纳米颗粒的选择性及受体位点的有限性等问题，以及，对纳米颗粒形貌结构、浓度、宿主细胞株、纳米颗粒与宿主细胞孵化时间及两者偶联方式等多样参数的选择限制，大大缩减了系统装置的运行周期，延展了系统装置的通用性；本发明装置耦合了光声预警反馈模块，对于超(激光)剂量运行而对细胞膜可能造成非可逆损伤的行为设置红色警戒提醒；同时本发明装置采用非接触、无污染的激光作为泵浦源，可以实现对宿主细胞实现可控、快速、高通量、自动化的可恢复性细胞膜手术，解决了背景技术描述的问题。

本发明的技术方案包括一种快速实现细胞膜可逆性损伤的装置，该装置包括激光发射装置、光声预警反馈装置及培养池装置，其特征在于：所述激光发射装置用于向所述培养池装置，以及，根据所述光声预警反馈装置下发指令对激光束能量进行后续调控；所述培养池装置包括可移动平台和设置于平台上的培养池，所述可移动平台用于控制自身进行三维空间位置移动，使所述培养池目标区域位于激光发射装置发射的泵浦光束焦斑区域；所述光声预警反馈装置用于采集并分析所述培养池的特征光声信号，根据分析结果动态调控所述激光发射装置发射激光的能量。

根据所述的快速实现细胞膜可逆性损伤的装置，其中激光发射装置包括依次连接的泵浦激光光源、扩束透镜组、衰减片组、偏振片、分光镜及高倍物镜，其特征在于：所述泵浦激光光源用于发射泵浦激光，并根据光声预警反馈装置下发的指令调控泵浦激光能量的大小；所述扩束透镜组、所述衰减片组、所述偏振片、所述分光镜及所述高倍物镜分别用于对所述泵浦激光依次进行扩束、衰减、偏振、分束及聚焦操作。

根据所述的快速实现细胞膜可逆性损伤的装置，其中偏振片用于将经过所述衰减片组衰减后的激光束分束为两束激光，其中一束发送至所述光声预警反馈装置，另外一束发送至所述分光镜。

根据所述的快速实现细胞膜可逆性损伤的装置，其中培养池装置被配置为xyz精密电动位移台及设置于所述xyz精密电动位移台上的硅烷化细胞培养池，所述xyz精密电动位移台用于通过三维位置调整，使所述激光发射装置发射的激光束的焦平面位于所述硅烷化细胞培养池的孔径平面。

根据所述的快速实现细胞膜可逆性损伤的装置，其中硅烷化细胞培养池被配置为：培养皿，所述培养皿内壁设置有含硫有机硅烷单层薄膜，所述含硫有机硅烷单层薄膜表面的含氢硫基团为化学吸附金纳米颗粒的位点，所述含硫有机硅烷单层薄膜固化有介导体纳米颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述介导体纳米颗粒具体为金纳米颗粒。

根据所述的快速实现细胞膜可逆性损伤的装置，其中光声预警反馈装置包括宽频光声探头、超声脉冲接发器、功率能量计及计算机装置，其特征在于：所述宽频光声探头设置于所述培养池正上方，用于采集所述培养池产生的光声信号，经所述超声脉冲接发器滤波得到滤波信号，并发送至所述计算机装置进行信号特征峰值提取；所述功率能量计用于采集所述激光发射装置所发射激光的能量大小，并发送至计算机装置；所述计算机装置根据滤波信号与存储的预设值进行对比，根据对比结果向所述激光发射装置发送调控激光能量的指令，同时在交互界面进行显示。

在一个优选的实施方案中，其中还包括报警装置，所述报警装置根据计算器装置的指令进行报警提示，所述报警装置包括但不限于声音报警装置和/或灯光报警装置。

根据所述的快速实现细胞膜可逆性损伤的装置，其中计算机装置具体包括：将所述滤波信号转换为机械信号，将机械信号与存储的机械力阈值数据库进行对比，若超过阈值则进行相应的提示和报警，若低于阈值则增加激光发射装置激光能量。

本发明的技术方案还包括一种快速实现细胞膜可逆性损伤的方法，所述方法用于执行上述任一所述装置，其特征在于：s10，采集硅烷化培养池的光声信号，将光声信号进行滤波及提取峰值处理，将滤波信号发送至计算机装置进行分析处理；s20，计算机装置根据特征提取值，与预设的细胞耐受应力数据库进行对比分析，判定激光能量是否超过培养池细胞的承受阈值；s30，若超过则降低激光能量或者进行关闭处理，若不超过则增加所述激光发射装置的激光能量。

本发明的有益效果为：克服了因宿主细胞膜表面受体对纳米颗粒的选择性及受体位点的有限性等问题，对纳米颗粒形貌结构、浓度、宿主细胞株、纳米颗粒与宿主细胞孵化时间及两者偶联方式等多样参数选择的限制，大大缩减了系统装置的运行周期，延展了系统装置的通用性；本发明装置耦合了光声预警反馈模块，对于超(激光)剂量运行而对细胞膜可能造成非可逆损伤的行为设置红色警戒提醒，采用非接触、无污染的激光作为泵浦源，可以实现对宿主细胞实现可控、快速、高通量、自动化的可恢复性细胞膜微型手术。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步地说明；

图1所示为根据本发明实施方式的装置连接框图；

图2所示为根据本发明实施方式的总体流程图；

图3所示为根据本发明实施方式的装置连接示意图；

图4所示为根据本发明实施方式的硅烷化细胞培养池示意图；

图5a，5b，5c，5d所示为根据本发明实施方式金纳米颗粒介导快速实现细胞膜可逆性损伤原理示意图；

图6所示为根据本发明实施方式的光声预警反馈装置工作流程图。

具体实施方式

本部分将详细描述本发明的具体实施例，本发明之较佳实施例在附图中示出，附图的作用在于用图形补充说明书文字部分的描述，使人能够直观地、形象地理解本发明的每个技术特征和整体技术方案，但其不能理解为对本发明保护范围的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、前、后、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，若干的含义是一个或者多个，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。

图1所示为根据本发明实施方式的装置连接框图。该装置包括激光发射装置、光声预警反馈装置及培养皿装置，具体在于：激光发射装置用于向培养池装置发射激光束，以及，根据光声预警反馈装置下发指令对激光束能量进行控制；培养池装置包括三维可移动平台和设置于平台上的培养池，可移动平台用于控制自身进行三维空间位置调整，使培养池与激光发射装置的相对位置对齐；光声预警反馈装置用于采集并分析培养池装置光声信号，根据分析结果动态调控激光发射装置发射激光的能量。

图2所示为根据本发明实施方式的总体流程图。该流程包括：s10，采集硅烷化培养池的光声信号，将光声信号进行滤波及提取峰值处理，将滤波信号发送至计算机装置进行分析处理；s20，计算机装置根据特征提取值，与预设的细胞耐受应力数据库进行对比分析，判定激光能量是否超过培养池细胞的承受阈值；s30，若超过则降低激光能量或者关闭处理，若不超过则增加激光发射装置的激光能量。

图3所示为根据本发明实施方式的装置连接示意图。包括泵浦激光光源001、扩束透镜组002、衰减片组003、偏振片004、分光镜005、高倍物镜006、xyz精密电动平移台007、硅烷化细胞培养池模块008、光声探头009、超声脉冲发射/接收器010、功率能量计011、外接计算机012。扩束透镜组002主要用对泵浦激光进行扩束整形，扩束整形后的激光经衰减片组003实现激光能量的调控。偏振片004将调控后的激光分为两束，一束到达功率能量计011，用于对泵浦激光光源的实时监控与记录；另一束经分光镜005后，由高倍物镜006聚焦，焦平面与硅烷化细胞培养池008的相对位置由样品池空间位点决定，其相对位置可通过xyz精密电动位移台007进行调控，根据需求可以适当加入对应的光声报警装置。

图4所示为根据本发明实施方式的硅烷化细胞培养池示意图。基于图3，在设计硅烷化细胞培养池模块008时，在具体实施中首先需选择合适的纳米介导体，金纳米颗粒具备可调谐的光学属性、良好的生物相容性及细胞低毒性而被广泛应用于生物组织成像、癌症的诊断及治疗中，因此本发明选用金纳米颗粒作为此模块中的介导体。具体实施时可采用柠檬酸钠法、晶种子合成法等成熟的化学方法制备金纳米颗粒或商购经灭菌处理后的金纳米颗粒。

以易吸附于含硅玻璃培养皿表面的含硫有机硅烷为原料，首先在玻璃培养皿内壁表面制备含硫有机硅烷自组装单层薄膜，然后以薄膜表面的含氢硫基团为化学吸附金纳米颗粒的位点，最后在自组装薄膜上固化介导体金纳米颗粒，以此程序构建本发明装置中的硅烷化细胞培养池模块。

图5a，5b，5c，5d所示为根据本发明实施方式金纳米颗粒介导快速实现细胞膜可逆性损伤原理示意图。激光通过表面等离子共振效应加热纳米颗粒，纳米颗粒电子通过共振吸收入射的光子，引起周围能量沉积，被加热的纳米颗粒及周围介质产生热弹性膨胀，向周围发射热弹性应力波，其中此光热效应可引起细胞膜磷脂双分子层局部相变或致使膜表面糖蛋白变性引发宿主细胞膜通透性发生变化，纳米颗粒的光热效应引起的热弹性应力波是本发明装置实现细胞膜可逆性损伤的原理之一；当激光剂量进一步增加，局域能量沉积引起的热效应会致使周围物质产生蒸发相变形成微纳空泡，空泡破裂形成微小射流，这种射流像“手术刀”一样在细胞表面“切”出微纳小孔，空泡非对称运动引起的机械射流是本发明装置快速实现细胞膜可逆性损伤的另外一个原理，空泡在体积变化过程中产生声学信号，此声学信号可以表征空泡能量，反映空泡非对称性破裂时产生的机械应力。

图6所示为根据本发明实施方式的光声预警反馈装置工作流程图。基于图3，该流程的技术方案原理如下：

光声预警反馈模块包括光声探头009、超声脉冲发射/接收器010及外接计算机012。当光热效应产生时，无论是诱发热弹性应力波发射还是空泡震荡机械应力波发射，产生的光声转换信号皆可由宽频光声探头009接收，采集信号的强度可用于表征细胞损伤程度。原始采集的光声信号经超声脉冲发射/接收器010低通滤波去噪后，自动存储于外接计算机012并提取其特征峰值，然后将其特征峰值与已经构建的预警参数数据库进行比对，判断是否高于预警阈值。如果特征峰值低于预警阈值，可以考虑加大入射激光剂量，提高系统装置的运行效率；如果高于预警阈值，需即可停止激光辐射，以免使得宿主细胞产生不可逆转的损伤。

本发明的技术方案还提供了对装置的搭建和运行的方案的公开，参考图3，包括：

骤一、装置搭建：将硅烷化处理后的培养池模块008放置于xyz三维精密可调电动平移台007上，调节xyz三维空间位置，使得经扩束透镜组002扩束、衰减片组003衰减、分光镜005分束、高倍物镜006聚焦后的泵浦光源001投射在培养池模块008yz平台的焦半径与样品池008孔径重合；调节宽频光声探头009的空间位置使得探头靶面平行于yz平面，使得探头的聚焦焦点与泵浦激光光源001焦点重合。

步骤二、预警参数数据库设置：光声预警反馈模块包括宽频光声探头009、超声脉冲发射/接收器010及外接计算机012。其中因不同细胞系的宿主细胞对机械外力的耐受性存在差异性，为了实现细胞膜可控性损伤的自动可控化，本装置需建立常见类种细胞达到不可逆损伤的机械力阈值数据库，并此将阈值设定为预警参数，作为是否触发装置预警的临界值。硅烷化处理的纳米颗粒与泵浦激光001相互作用，因热弹性机制、蒸发相变机制及光致击穿机制等可实现光——声(机械)信号转换，所转换的机械信号可由光声探头009获取，经超声脉冲发射/接收器010滤波处理后，由外接计算机012提取信号峰值、保存同时做出是否预警的判断。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。