本发明涉及植物枝叶中天然有机化合物的提取及分离方法，具体为一种由红豆杉枝叶中初步分离天然紫杉醇及紫杉烷类化合物的工业化方法。
背景技术：
二十世纪60年代末美国化学家wall和wani从太平洋红豆杉中分离得到了紫杉醇，并于70年代初确定了紫杉醇的化学结构。1979年，albenteinstein医学院的生化药理教授su.horwity研究发现了紫杉醇具有独特的能促进微管蛋白聚合以及抑制微管解聚的活性，即紫杉醇有独特的抗癌作用机理。1983年，紫杉醇开始进入临床研究，1992年经美国食品药品管理局（fda）批准上市，成为国际上公认的抗癌药物之一。
长期以来，紫杉醇是从红豆杉的树皮中提取的，随着工艺技术的改进，紫杉醇的提取由红豆杉的树皮提取变成从红豆杉枝叶提取，在一定程度上保护了红豆杉植物资源。但是，红豆杉枝叶中紫杉醇的含量极少，自然条件下，红豆杉生长速度缓慢，单靠提取的天然紫杉醇无法满足市场需求。
10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ、10-脱乙酰基紫杉醇是存在于红豆杉枝叶、根皮中的天然有机化合物，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量较高，且已被成功用来半合成紫杉醇及紫杉醇类似物多西紫杉醇等，多西紫杉醇抗癌活性及水溶性均优于紫杉醇，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ成了目前半合成紫杉醇及多西紫杉醇的主要原料；同样10-脱乙酰基紫杉醇也可以作为紫杉醇的前体，通过半合成得到紫杉醇。
全球肿瘤发病率居高不下，紫杉醇需求量与日俱增，在确保红豆杉植物资源不受破坏的前提下，如何高效的利用红豆杉枝叶中包含的紫杉醇及紫杉烷类化合物成了关键。
由红豆杉提取天然紫杉醇及紫杉烷类化合物存在如下问题：
（1）目前，多数天然紫杉醇及紫杉烷类初提产业未能在初提时实现各有效组分的高效分离，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ、10-脱乙酰基紫杉醇、天然紫杉醇的继续纯化工艺相互交叉，一定程度上增大了分离纯化的成本及各组分的收率；
（2）天然紫杉醇及能半合成紫杉醇的前体产物市场需求量大，供不应求，如何利用有限的资源创造更多的利用价值显得越来越重要。
技术实现要素：
针对现有工业化生产中存在的问题，本发明提供了一种从红豆杉枝叶中提取、初分离天然紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ、10-脱乙酰基紫杉醇的工业化生产方法；该方法以红豆杉枝叶为植提原料，用甲醇-水混合液浸提，浸提液经浓缩、萃取后拌硅胶，干燥制备料胶；料胶添加丙酮水后装柱，料胶柱同大孔吸附树脂柱连接形成连续层析柱，用丙酮-水混合液作为洗脱液梯度洗脱，通过tlc监控收集合并含有各组分的流相，再分别用大孔吸附树脂挂柱吸附各组分流相，挂住吸附完成后用丙酮洗出，分别浓缩后萃取即可得各段次粗品；本方法仅通过一次柱层析即实现天然紫杉醇、10-脱乙酰基紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ的有效分离，纯化效率高，方法简单易操作、成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
（1）室温条件下，用甲醇水浸泡干燥粉碎后的红豆杉枝叶7～9h，过滤，滤渣继续加甲醇水反复浸泡2～3次，收集合并滤液，滤液在65～75℃下浓缩，在浓缩液中加入与浓缩液等体积的有机溶剂，搅拌均匀后静置0.5～3h，分别收集水相和有机相，水相继续用有机溶剂反复萃取1～2次，收集合并有机相，减压浓缩得浸膏状浓缩物，浸膏状浓缩物用乙酸乙酯溶解后，按浸膏状浓缩物与硅胶的质量比为1:1.3～1.5的比例，在溶解液中添加硅胶，混匀后干燥制得料胶备用；
所述用于浸提的甲醇水的质量浓度为70～80%；原料和甲醇水的质量体积比为1g:2～4ml；
所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种；
（2）按质量体积比1:1～2的比例在步骤（1）料胶中添加丙酮水，混匀后获得料胶浆，料胶浆装柱，同时按料胶与大孔吸附树脂的质量比1:1～3的比例，配备大孔吸附树脂柱，将料胶柱的出液口与大孔吸附树脂柱的进液口连接，形成连续层析柱；
所述丙酮水的质量浓度为20%～30%；
所述大孔吸附树脂柱的树脂型号为hpd-100、ab-8或512a；
（3）依次将质量浓度30～35%、40～45%、50～55%的丙酮水溶液注入料胶柱的进液口进行梯度洗脱，通过tlc板监控大孔吸附树脂柱的出液口的洗脱液，分别收集合并含有紫杉醇、10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ、10-脱乙酰基紫杉醇的洗脱液；
洗脱时的流速为2～3柱体积/h，每5min收集一次洗出液，通过tlc板监控，当洗出液中出现10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ时，改用质量浓度40～45%的丙酮水洗脱，当洗出液中出现10-脱乙酰基紫杉醇时，改用50～55%的丙酮水洗脱；
洗脱时每隔30min用tlc板监控一次料胶柱出液口中所含组分的情况，当料胶柱洗出液中无紫杉醇出现后，停止对料胶柱供液，改为直接从大孔吸附树脂柱中添加洗脱液；
（4）将步骤（3）收集的含有3个物质的洗脱液分别用大孔吸附树脂柱挂柱吸附，挂柱完成后用丙酮洗出，收集丙酮洗脱液，减压浓缩抽干后加乙酸乙酯或二氯甲烷溶解，溶解完成后加水搅拌均匀后静置，收集有机相，水相继续加乙酸乙酯或二氯甲烷萃取一次，收集合并有机相浓缩抽干，即得10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ、10-脱乙酰基紫杉醇、天然紫杉醇粗品；
所述用于挂柱吸附的大孔吸附树脂的型号为hp20、sp850或sp825l。
本发明相对于现有技术的优点和技术效果：
1、本发明选择甲醇/水混合液作为提取溶剂，提取成本低，提取率高；
2、采用连续柱且用丙酮水梯度洗脱时，各段次之间交互少，除杂质效果明显，含量富集较快，非常适合于工业化生产；
3、本发明方法简单易操作，成本低，得率高，适于工业化应用和市场推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本初步分离天然紫杉醇及紫杉烷类化合物的工业化方法，具体操作如下：
1、以干燥并粉碎的200kg红豆杉枝叶作为原料，按1g:3.5ml的比例在原料中添加入甲醇水（质量浓度80%），在室温下浸泡8h，过滤，滤渣继续加甲醇水（80%）浸泡，反复浸泡提取3次，收集合并滤液，滤液在72℃下浓缩，得到320l含大量水的混合液，加入320l乙酸乙酯搅拌均匀后静置2h，分离并收集水相和乙酸乙酯相，水相继续用乙酸乙酯反复萃取2次，收集合并乙酸乙酯萃液，减压浓缩至流浸膏状，经hplc检测，此浸膏紫杉醇含量3.86‰，10-脱乙酰基紫杉醇含量2.91‰，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量1.54%；将浸膏用乙酸乙酯溶解后，按浸膏状浓缩物与硅胶的质量比为1:1.5的比例，在溶解液中添加硅胶，搅拌均匀后，经干燥箱干燥制备成料胶；
2、将36.95kg料胶用质量浓度20%的丙酮水56l匀浆装柱，同时按料胶与大孔吸附树脂的质量比1:2.5的比例，装填一棵512a树脂柱，将料胶柱的出液口与大孔吸附树脂柱的进液口连接，形成连续层析柱；
3、用自来水和工业级丙酮配制质量浓度30%、40%、52%的丙酮水溶液，然后以流速2.5柱体积/h，先用30%的丙酮水溶液注入料胶柱的进液口进行洗脱，在512a树脂柱出口收集洗出液，每5min收集一次洗出液，通过tlc板监控，当洗出液中出现10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ时，改用质量浓度40%的丙酮水洗脱，当洗出液中出现10-脱乙酰基紫杉醇时，改用52%的丙酮水洗脱，洗脱时每隔30min用tlc板监控一次料胶柱出液口中所含组分的情况，当料胶柱洗出液中无紫杉醇出现后，停止对料胶柱供液，改为直接从大孔吸附树脂柱中添加洗脱液；收集合并得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液；
4、将10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液分别上样至大孔吸附树脂sp825l装填的树脂柱挂柱吸附，挂柱完成后，用丙酮洗出，收集丙酮洗脱液，经浓缩抽干后，用乙酸乙酯溶解后，加入乙酸乙酯等体积的水萃取，水相继续加乙酸乙酯萃取一次，收集合并乙酸乙酯相，减压浓缩抽干，得到紫杉醇粗品435.6g，紫杉醇含量12.7%；得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ粗品656g，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量34%；得到10-脱乙酰基紫杉醇粗品370g，10-脱乙酰基紫杉醇含量11.7%。
实施例2：本初步分离天然紫杉醇及紫杉烷类化合物的工业化方法，具体操作如下：
1、以干燥并粉碎的300kg红豆杉枝叶作为原料，按1g:4ml的比例在原料中添加入甲醇水（质量浓度70%），在室温下浸泡7h，过滤，滤渣继续加甲醇水（70%）浸泡，反复浸泡提取2次，收集合并滤液，滤液在65℃下浓缩，得到400l含大量水的混合液，加入400l乙酸乙酯搅拌均匀后静置1h，分离并收集水相和乙酸乙酯相，水相继续用乙酸乙酯反复萃取2次，收集合并乙酸乙酯萃液，减压浓缩至流浸膏状，经hplc检测，此浸膏紫杉醇含量3.85‰，10-脱乙酰基紫杉醇含量2.905‰，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量1.54%；将浸膏用乙酸乙酯溶解后，按浸膏状浓缩物与硅胶的质量比1:1.4的比例添加硅胶，搅拌均匀后，经干燥箱干燥制备成料胶；
2、将52.48kg料胶用质量浓度25%的丙酮水53l匀浆装柱，同时按料胶与大孔吸附树脂的质量比1:3的比例，装填一棵hpd-100树脂柱，将料胶柱的出液口与大孔吸附树脂柱的进液口连接，形成连续层析柱；
3、用自来水和工业级丙酮配制质量浓度35%、45%、50%的丙酮水溶液，然后以流速2柱体积/h，先用35%的丙酮水溶液注入料胶柱的进液口进行洗脱，在hpd-100树脂柱出口收集洗出液，每5min收集一次洗出液，通过tlc板监控，当洗出液中出现10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ时，改用质量浓度45%的丙酮水洗脱，当洗出液中出现10-脱乙酰基紫杉醇时，改用50%的丙酮水洗脱，洗脱时每隔30min用tlc板监控一次料胶柱出液口中所含组分的情况，当料胶柱洗出液中无紫杉醇出现后，停止对料胶柱供液，改为直接从大孔吸附树脂柱中添加洗脱液；收集合并得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液；
4、将10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液分别上样至大孔吸附树脂hp20装填的树脂柱挂柱吸附，挂柱完成后，用丙酮洗出，收集丙酮洗脱液，经浓缩抽干后，用乙酸乙酯溶解后，加入乙酸乙酯等体积的水萃取，水相继续加乙酸乙酯萃取一次，收集合并乙酸乙酯相，减压浓缩抽干，得到紫杉醇粗品620.68g，紫杉醇含量13.02%；得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ粗品922.4g，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量35.4%；得到10-脱乙酰基紫杉醇粗品500g，10-脱乙酰基紫杉醇含量11.68%。
实施例3：本初步分离天然紫杉醇及紫杉烷类化合物的工业化方法，具体操作如下：
1、以干燥并粉碎的500kg红豆杉枝叶作为原料，按1g:3ml的比例在原料中添加入甲醇水（质量浓度75%），在室温下浸泡9h，过滤，滤渣继续加甲醇水（75%）浸泡，反复浸泡提取3次，收集合并滤液，滤液在70℃下浓缩，得到687l含大量水的混合液，加入687l二氯甲烷搅拌均匀后静置2h，分离并收集水相和二氯甲烷相，水相继续用二氯甲烷反复萃取2次，收集合并二氯甲烷萃液，减压浓缩至流浸膏状，经hplc检测，此浸膏紫杉醇含量3.85‰，10-脱乙酰基紫杉醇含量2.905‰，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量1.32%；将浸膏用乙酸乙酯溶解后，按浸膏状浓缩物与硅胶的质量比为1:1.3的比例，在溶解液中添加硅胶，搅拌均匀后，经干燥箱干燥制备成料胶；
2、将91.1kg料胶用质量浓度30%的丙酮水180l匀浆装柱，同时按料胶与大孔吸附树脂的质量比1:2的比例，装填一棵ab-8树脂柱，将料胶柱的出液口与大孔吸附树脂柱的进液口连接，形成连续层析柱；
3、用自来水和工业级丙酮配制质量浓度33%、43%、55%的丙酮水溶液，然后以流速3柱体积/h，先用33%的丙酮水溶液注入料胶柱的进液口进行洗脱，在ab-8树脂柱出口收集洗出液，每5min收集一次洗出液，通过tlc板监控，当洗出液中出现10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ时，改用质量浓度43%的丙酮水洗脱，当洗出液中出现10-脱乙酰基紫杉醇时，改用55%的丙酮水洗脱，洗脱时每隔30min用tlc板监控一次料胶柱出液口中所含组分的情况，当料胶柱洗出液中无紫杉醇出现后，停止对料胶柱供液，改为直接从大孔吸附树脂柱中添加洗脱液；收集合并得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液；
4、将10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液分别上样至大孔吸附树脂sp850装填的树脂柱挂柱吸附，挂柱完成后，用丙酮洗出，收集丙酮洗脱液，经浓缩抽干后，用二氯甲烷溶解后，加入二氯甲烷等体积的水萃取，水相继续加二氯甲烷萃取一次，收集合并二氯甲烷相，减压浓缩抽干，得到紫杉醇粗品1132g，紫杉醇含量12.8%；得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ粗品1420g，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量35.7%；得到10-脱乙酰基紫杉醇粗品917.5g，10-脱乙酰基紫杉醇含量11.66%。
实施例4：本初步分离天然紫杉醇及紫杉烷类化合物的工业化方法，具体操作如下：
1、以干燥并粉碎的400kg红豆杉枝叶作为原料，按1g:2.5ml的比例在原料中添加入甲醇水（质量浓度72%），在室温下浸泡9h，过滤，滤渣继续加甲醇水（72%）浸泡，反复浸泡提取3次，收集合并滤液，滤液在65℃下浓缩，得到560l含大量水的混合液，加入560l氯仿搅拌均匀后静置3h，分离并收集水相和氯仿相，水相继续用氯仿反复萃取1次，收集合并氯仿萃液，减压浓缩至流浸膏状，经hplc检测，此浸膏紫杉醇含量3.86‰，10-脱乙酰基紫杉醇含量2.92‰，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量1.36%；将浸膏用乙酸乙酯溶解后，按浸膏状浓缩物与硅胶的质量比1:1.4的比例，在溶解液中添加硅胶，搅拌均匀后，经干燥箱干燥制备成料胶；
2、将72.82kg料胶用质量浓度30%的丙酮水105l匀浆装柱，同时按料胶与大孔吸附树脂的质量比1:1的比例，装填一棵512a树脂柱，将料胶柱的出液口与大孔吸附树脂柱的进液口连接，形成连续层析柱；
3、用自来水和工业级丙酮配制质量浓度30%、45%、50%的丙酮水溶液，然后以流速2.5柱体积/h，先用30%的丙酮水溶液注入料胶柱的进液口进行洗脱，在512a树脂柱出口收集洗出液，每5min收集一次洗出液，通过tlc板监控，当洗出液中出现10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ时，改用质量浓度45%的丙酮水洗脱，当洗出液中出现10-脱乙酰基紫杉醇时，改用50%的丙酮水洗脱，洗脱时每隔30min用tlc板监控一次料胶柱出液口中所含组分的情况，当料胶柱洗出液中无紫杉醇出现后，停止对料胶柱供液，改为直接从大孔吸附树脂柱中添加洗脱液；收集合并得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液；
4、将10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ段次、10-脱乙酰基紫杉醇段次、紫杉醇段次的洗脱液分别上样至大孔吸附树脂hp20装填的树脂柱挂柱吸附，挂柱完成后，用丙酮洗出，收集丙酮洗脱液，经浓缩抽干后，用二氯甲烷溶解后，加入二氯甲烷等体积的水萃取，水相继续加二氯甲烷萃取一次，收集合并二氯甲烷相，减压浓缩抽干，得到紫杉醇粗品801.5g，紫杉醇含量13.7%；得到10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ粗品1107g，10-脱乙酰基巴卡亭ⅲ含量32.8%；得到10-脱乙酰基紫杉醇粗品714.8g，10-脱乙酰基紫杉醇含量11.03%。