技术领域：
：本发明涉及一种发酵方法，具体涉及一种提高黄腐酸钠含量的发酵方法及其微生物菌剂。
背景技术：
：腐植酸在土壤、泥炭、褐煤、风化煤中普遍存在，腐植酸分子结构式非常的复杂，其中有大量的芬香核物质（苯环、稠环、脂肪环，某些杂环），有较强的离子交换能力、螯合能力、氧化还原力和缓冲能力，其组分主要为黄腐酸，棕腐酸和黑腐酸。黄腐酸溶于酸、碱、水，溶液呈黄色；棕腐酸不溶于酸和水，但溶于乙醇和碱，溶液呈棕色；黑腐酸不溶于酸、乙醇或丙酮，只溶于碱，溶液呈黑色。腐殖酸经碱化提纯烘干后便得到了腐植酸钠。在动物的肠道中，腐植酸钠不仅能有效抑制肠道中的致病菌，还能收敛肠道病灶，减轻炎症反应，在受损的肠道表面形成一道保护膜保护伤口，并加速受损部位组织的生长，促进伤口愈合，此外还能提高动物的机体免疫力。在腐植酸钠中发挥作用的主要物质为黄腐酸钠，但黄腐酸钠含量很低并不是主要成分，因此提高黄腐酸钠的含量，便可以显著提升产品作用效果。目前已有的研究中多采用液体发酵的方法，但液体产品很难直接应用，还需要后期的浓缩干燥等工艺，产业化的难度较高，而固体发酵的方法操作更简便，能直接形成产品，是更有效的发酵形式，但固体发酵对发酵菌种及与其相匹配的发酵工艺提出的较高的要求。因此固体发酵的研究难度更大，但生产工艺更简便，更适应规模化生产的要求。技术实现要素：（一）发明目的：通过微生物的生长代谢对腐植酸钠和麸皮进行发酵,提高黄腐酸钠的总量，使腐植酸钠的使用效果得到提升，提高动物的机体免疫力，提高养殖动物的抗病能力。（二）技术方案：本发明提供了一种提高黄腐酸钠含量的发酵方法，其特征在于，发酵过程中发酵底物所含水水分在50%以下，不超过底物的最大持水力，发酵过程中物料底部不会产生积液。所述发酵方法步骤如下：先将微生物菌剂与等体积30℃左右的温水混合均匀，并保温2h左右，腐植酸钠与辅料按比例均匀混合，同时接入微生物菌剂，调节含水量为40-50%，混合均匀后装袋，将袋口扎紧后，在温度合适的条件下自然发酵。所述辅料为麸皮。所述微生物菌剂的添加量为每1kg发酵底物中接入10g。所述麸皮和腐植酸钠的添加比例为重量比1:2.3-9。所述微生物菌剂由以下菌株组成：地衣芽孢杆菌，植物乳杆菌，罗伊氏乳杆菌，酿酒酵母。所述菌体由菌落形成单位数目比为1-10：0.5-10：1-10：0.1-1的地衣芽孢杆菌，植物乳杆菌，罗伊氏乳杆菌，酿酒酵母，其总量为5×107-5×109cfu/g所述菌剂。（三）意义：通过微生物的发酵，使腐植酸钠中黄腐酸钠的含量的到提升，从而在应用过程中提高腐植酸钠的使用效果，有效抑制肠道中的致病菌，收敛肠道病灶，减轻炎症反应，并加速受损部位组织的生长，促进伤口愈合，提高动物的机体免疫力，提高养殖动物的抗病能力。具体实施方式:实施例1、微生物菌剂的生产菌株筛选：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)wei-70cgmccno.11747的分离，罗伊氏乳杆菌（lactobacillusreuteri）wei-71cgmccno.的分离。地衣芽孢杆菌wei-96和酿酒酵母wei-97分离自土壤、泥炭和褐煤的样品中。以上分离到的菌株分别进行了多次单菌株、两两组合菌株及多菌株复配对发酵效果的实验，筛选的菌株又进行了细菌的内毒素，溶血性，细胞毒性及产生物胺等多种安全性筛选实验。最终确定低温复合菌剂的组成为，地衣芽孢杆菌wei-96，植物乳杆菌wei-70，罗伊氏乳杆菌wei-71，酿酒酵母wei-97。菌株培养：将地衣芽孢杆菌wei-96、植物乳杆菌wei-70，罗伊氏乳杆菌wei-71，酿酒酵母wei-97分别接种到各自的斜面培养基中，其中植物乳杆菌wei-70，罗伊氏乳杆菌wei-71使用mrs琼脂培养基，37℃培养24h，地衣芽孢杆菌wei-96使用lb琼脂培养基，30℃培养24h，酿酒酵母wei-97使用ypd琼脂培养基，30℃培养48h。菌株放大培养：每株菌先分别用斜面接种到装有50ml种子培养基的250ml摇瓶单独培养，其中植物乳杆菌wei-70，罗伊氏乳杆菌wei-71使用mrs液体培养基，37℃静置培养24h，地衣芽孢杆菌wei-96使用lb液体培养基，30℃，180rpm培养20h，酿酒酵母wei-97使用ypd液体培养基，30℃，180rpm培养40h，再将种子液分别接入装有3l培养基的5l发酵罐中培养。其中植物乳杆菌wei-70，罗伊氏乳杆菌wei-71使用mrs液体培养基，37℃静置培养24h，地衣芽孢杆菌wei-96使用lb液体培养基，30℃，180rpm培养20h，酿酒酵母wei-97使用ypd液体培养基，30℃，180rpm培养40h。微生物菌剂的生产：放大培养的菌液分别经高速离心机15000-20000rpm离心收集菌泥，收集到的菌泥分别与辅料或保护剂混合均匀，其中植物乳杆菌wei-70，罗伊氏乳杆菌wei-71与菌体保护剂混合，菌泥与保护剂比例为1:9，之后放入冻干机干燥48h地衣芽孢杆菌wei-96和酿酒酵母wei-97与麦芽糊精混合，菌泥与麦芽糊精比例为1:4，50℃干燥10h。得到真空冷冻干燥与低温烘干，两种菌剂按照相应比例混合即得到固体发酵的微生物菌剂。上述方案中使用的植物乳杆菌wei-70，罗伊氏乳杆菌wei-71保护剂为：脱脂奶粉30%，麦芽糊精5%，可溶性淀粉6%，vc1%。实施例2、微生物菌剂添加量的优化。按照微生物菌剂的菌落形成单位数目比为10：0.5：1：1的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和酿酒酵母的添加比例，分制备微生物菌剂1、微生物菌剂2、微生物菌剂3，其中生物菌剂1的菌落形成单位浓度为5×107cfu/g，微生物菌剂2菌落形成单位浓度为5×108cfu/g，微生物菌剂3的菌落形成单位浓度为5×109cfu/g。先将300g发酵菌剂与等体积30℃左右的温水混合均匀，并保温2h左右，27kg腐植酸钠与2.7kg麸皮均匀混合，将微生物菌剂与水混合均匀，加入到物料中，并调节含水量为40-50%，混合均匀后装袋，将袋口扎紧后，在室温条件下自然发酵7天。将腐植酸钠和麸皮按10:1混合均匀，并设为对照，每组设两个重复，结果见表1。结果分析：三组发酵产物中的黄腐酸钠均有不同程度的提高，尤其是微生物菌剂2和微生物菌剂3，在微生物菌剂添加量提升了10倍和100倍的条件下，黄腐酸钠的产量提高了一倍以上，提升效果显著。其中使用微生物菌剂3的黄腐酸钠含量最高，达到6.19%，但相比微生物菌剂2提高了10倍的添加量，黄腐酸钠的产量仅提升了0.4%，效率太低，因此后续工艺均选用了微生物菌剂2。表1使用不同微生物菌剂发酵物的黄腐酸钠含量对照微生物菌剂1微生物菌剂2微生物菌剂32.313.405.786.19实施例3、不同物料添加量的优化分别设置四组配方，配方1，添加21kg腐植酸钠和9kg麸皮配方2，添加24kg腐植酸钠和6kg麸皮，配方3，添加26kg腐植酸钠和4kg麸皮，配方4，添加27kg腐植酸钠和2.7kg麸皮。先将300g微生物菌剂2与等体积30℃左右的温水混合均匀，并保温2h左右，腐植酸钠与麸皮按相应比例混合均匀，再将微生物菌剂与水混合均匀后，加入到物料中，并调节含水量为40-50%，混合均匀后装袋，将袋口扎紧后，在室温条件下自然发酵7天。将腐植酸钠和麸皮按相对应比例混合均匀，并设为对照，每组设两个重复，结果见表2。结果分析：四组发酵产物中的黄腐酸钠均有不同程度的提高，仅配方4的含量较低在7%以下，其余几个配方的含量超过7%，其中配方2的黄腐酸钠含量最高，达到8.02%，从发酵产量上看配方2也最高，达到了8.02%，因此后续使用配方2继续研究。表2不同底物添加比例的发酵前后黄腐酸钠含量配方1配方2配方3配方4对照0.65%1.09%1.51%2.37%固体发酵8.37%9.11%7.03%6.78%含量提高7.72%8.02%5.52%4.41%实施例4、微生物菌剂添加比例的优化。分别制备微生物菌剂2-1、微生物菌剂2-2、微生物菌剂2-3，其中生物菌剂2-1的菌落形成单位数目比为10：5：10：1的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和酿酒酵母，生物菌剂2-2的菌落形成单位数目比为10：0.5：1：1的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和酿酒酵母，生物菌剂2-3的菌落形成单位数目比为1：5：10：0.1的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和酿酒酵母。三种菌剂的菌落形成单位浓度为5×108cfu/g。先将300g发酵菌剂与等体积30℃左右的温水混合均匀，并保温2h左右，24kg腐殖酸钠与6kg麸皮均匀混合，将微生物菌剂与水混合均匀，加入到物料中，并调节含水量为40-50%，混合均匀后装袋，将袋口扎紧后，在室温条件下自然发酵7天。将腐植酸钠和麸皮按4:1混合均匀，并设为对照，每组设两个重复，结果见表3。结果分析：三组发酵产物中的黄腐酸钠均有不同程度的提高，其中使用微生物菌剂1-1的黄腐酸钠含量最高，达到11.30%，说明微生物菌剂1-1的菌株比例最理想，更有利于发酵。表3使用不同微生物菌剂发酵物的黄腐酸钠含量对照微生物菌剂1-1微生物菌剂1-2微生物菌剂1-31.11%11.30%9.07%8.99%实施例5、固体和液体发酵方法的产量对比。固体发酵：菌落形成单位浓度为5×108cfu/g的微生物发酵菌剂2-2，与等体积30℃左右的温水混合均匀，并保温2h左右。24kg腐殖酸钠与6kg麸皮均匀混合，将微生物菌剂与水混合均匀，加入到物料中，并调节含水量为40-50%，混合均匀后装袋，将袋口扎紧后，在室温条件下自然发酵7天。将腐植酸钠和麸皮按4:1混合均匀，并设为对照，每组设两个重复。液体发酵：渍水（经过酒精发酵的二次废糖蜜）添加量为24kg、蛋白胨150g、氯化钠150g、硫酸镁9g，水3kg，121℃灭菌30分钟，黑曲霉、白地霉和短小芽孢杆菌三个菌种单独培养，达到对数生长期时以1∶2∶1混合，菌种接种量为10％左右(按原料配比描述，补足100％)。接种后按以下工艺进行发酵：前36小时发酵温度为28℃-35℃，通气量1∶1.0-1.2，搅拌速度200rpm，后36小时温度为32℃-35℃，通气量为1∶0.2～0.3，搅拌速度60rpm-80rpm。结果见表4。结果分析：液体发酵的方法参考自专利cn105886589a，通过结果对比可以看到，液体发酵相比固体发酵的黄腐酸钠产量有一定的提升，但考虑到高温灭菌的等动力成本，以及对通气、控温和搅拌速度的要求，都加大了技术产业化的难度。本发明所采用的固体发酵方法及其微生物菌剂，使黄腐酸钠的生产工艺更简单，设备要求更低，更有利于技术的产业化，并且与液体发酵相比，黄腐酸钠的产量没有明显下降，说明其具备极大的技术价值及产业化潜力，能为相关产业发展提供助力，促进产业技术的进步。表4使用不同发酵方法的黄腐酸钠含量对照固体发酵液体发酵1.11%11.35%11.89%本发明所采用的固体发酵方法及其微生物菌剂，使黄腐酸钠的生产工艺更简单，设备要求更低，更有利于技术的产业化，并且与液体发酵相比，黄腐酸钠的产量没有明显下降，说明其具备极大的技术价值及产业化潜力，能为相关产业发展提供助力，促进产业技术的进步。当前第1页12