生产纤维素酶的集胞藻PCC6803的基因工程藻株及其构建方法与流程

本发明涉及一种生产纤维素酶的集胞藻pcc6803的基因工程藻株及其构建方法，属于工业微生物领域。

背景技术：

纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量较丰富的可再生性资源之一。随着石油和煤炭等化石资源的日渐枯竭，如何更为有效地转化和利用纤维素这一自然界分布广泛、丰富和廉价的可再生性有机资源是制约纤维素和生物质利用的一个关键问题。利用纤维素或生物质进行生物炼制，首先要将其转化为水溶性小分子寡糖和单糖，才能进一步发酵供微生物产生物乙醇或生物柴油。利用生物酶法将纤维素转化为可溶性的寡糖或单糖具有条件温和，转化效率高和有毒副产物少等优点，在生物质转化、造纸和环境治理过程中得到广泛应用。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素生产寡糖和葡萄糖。纤维素酶主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶。内切β-葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖生产两分子的葡萄糖。纤维素酶在工、农、畜和医学等领域都有广泛的应用，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。目前，虽然产生纤维素酶的生物种类很多，如霉菌、细菌、真菌、放线菌等。如在工业上应用较广的有木霉属(trichoderma)的几个种如粉状侧孢(sporitrichumpalverulentum)，腐皮镰孢(fusariumsolani)，绳状青霉(pencilliumfuniculosum)等霉菌和木腐菌菌株上，尤其是里氏木霉(t.reesei)研究的最多。生产方法多采用固体发酵法生产，但是，这些产酶方法都是以异养微生物利用有机碳源如麸皮、玉米杆、稻草等有机碳源为原料进行生产，在酶生产过程中消耗了大量有机碳源，这就使得生物质转化为生物能源过程效率以及碳的利用率很低，从能量转化角度是不利的，严重限制了利用生物质进行生物能源转化的效率和可行性。如能通过改造光合生物，依靠光合作用，利用二氧化碳和简单无机盐为主的培养基来产纤维素酶，就可以减少纤维素酶生产过程中的碳源和能源消耗，提高生物质转化的效率，不仅可以降低生物质转化过程的能源和碳源消耗，而且还可以实现对温室气体的有效利用。

蓝藻是一类能进行植物型产氧光合作用的原核生物，集胞藻(synechocystissp.pcc6803)是一种具有自然转化系统的单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不生产毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，它能利用光能进行自养生长，是光合作用分子生物学研究的重要模式生物之一。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化，不需要有机碳源，藻细胞培养成本低等的优点，因此，近年来利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产脂肪酸、药物等高附加值产品成为研究的热点。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明目的在于提供一种可产纤维素纤维素外切酶cbhⅱ的集胞藻pcc6803藻株，该藻株可依靠光合作用，利用无机盐和二氧化碳生产纤维素酶。

本发明还提供一种可产纤维素外切酶cbhⅱ的集胞藻基因工程藻株的构建方法。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种生产纤维素酶的集胞藻pcc6803的基因工程藻株，将外源纤维素外切酶cbhⅱ基因整合至集胞藻pcc6803基因组中，获得一种生产纤维素酶的集胞藻pcc6803的基因工程藻株spsncⅱ。

而且，cbhⅱ基因整合过程采用的载体为表达载体psncⅱ。

而且，所述表达载体psncⅱ的构建方法如下：

(1)以序列表中seqidno:1和seqidno:2为上下游引物，以野生集胞藻pcc6803基因组为模板；以序列表中seqidno:3和seqidno:4为上下游引物，以genbank登录号为u02439.1的大肠杆菌为模板；以序列表中seqidno:5和seqidno:6为上下游引物，以野生集胞藻pcc6803为模板，通过pcr扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因序列promoter-up、终止子t1t2基因片段与下游臂序列downstream；获得序列如序列表中seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11所示；

(2)对步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因序列promoter-up进行apai酶切处理；对步骤(1)中所获得终止子t1t2基因片段进行psti和bamhi双酶切；对步骤(1)中所获得的下游臂序列downstream进行saci与sacⅱ双酶切；

(3)将pbluescriptsk质粒进行psti和bamhi双酶切，与步骤(2)制得的终止子t1t2基因片段用t4连接酶连接，得到质粒pbluescriptskt1t2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用saci与sacⅱ双酶切后与经相同酶切的质粒pbluescriptskt1t2连接,得到质粒p5st1t2-downstream；

(4)用限制性内切酶bamhi处理puc4k质粒回收获得kana抗性序列，序列如序列表中seqidno:12所示；

(5)用限制性内切酶bamhi处理质粒载体p5st1t2-downstream，将步骤(4)所获得的kana序列在连接酶的作用下连接至回收所得的p5st1t2-downstream载体上，制得质粒载体p5st1t2npt；

(6)用限制性内切酶apai处理质粒p5st1t2npt，将所回收获得的promoter-up片段和纤维素外切酶cbhⅱ基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒psncⅱ。

一种生产纤维素酶的集胞藻pcc6803的基因工程藻株的构建方法，包括如下步骤：

(1)质粒构建以质粒p5st1t2-downstream为基础(序列如seqidno:14所示),以seqidno:1和seqidno:2为上下游引物，以野生集胞藻pcc6803基因组为模板，通过pcr扩增技术获得光感启动子兼上游臂promoter-up，通过引物在promoter-up两端+添加酶切位点apai,获得序列如seqidno：9所示；

(2)以序列seqidno:7和seqidno:8为上下游引物，以genbank数据库中里氏木霉trichodermareeseiqm9414的相应基因序列为模板,通过pcr扩增技术获得纤维素外切酶cbhⅱ基因片段，序列如seqidno:13所示；

(3)用限制性内切酶bamhi处理puc4k质粒回收获得kana抗性序列，序列如序列seqidno:12所示；

(4)用限制性内切酶bamhi处理质粒载体p5st1t2-downstream；将步骤(3)所获得的kana序列在t4连接酶的作用下连接至回收所得的p5st1t2-downstream载体上，制得载体p5st1t2npt；

(5)用限制性内切酶apai处理质粒p5st1t2npt，将步骤(1)与步骤(2)所获得的片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒psncⅱ；

(6)将步骤(5)所得的重组表达载体质粒psncⅱ自然转化至集胞藻pcc6803，经抗性筛选，培养,得到转基因集胞藻，命名为spsncⅱ藻株。

而且，所述步骤(1)中，扩增引物核苷酸序列如下：

promotor-up-f:5'-gatgtcgacgctttagcgttccagtg-3’；

promotor-up-r:5'-catttggttataattccttatgtat-3'；

所述步骤(1)中，扩增体系如下：

正反向引物各1μl，模板1μl，重组酶12.5μl，ddh2o9.5μl，总体系共25μl；

所述步骤(1)中，扩增反应条件如下：

94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃复性15s，72℃延伸1.5min，30个循环后；72℃10min，4℃保；

酶切反应体系如下：

dna3μl，内切酶1μl，10×buffer1μl，ddh2o5μl，总体系共10μl。

而且，所述步骤(2)中，扩增引物核苷酸序列如下：

cbhⅱ-f：5′-taaccaaatgcaagcttgctcaagcgt-3′

cbhⅱ-r：5′-gtcgacctcgagggggggcccttagtggtggtggtggtggtg-3′

所述步骤(2)中，扩增体系如下：

正反向引物各1μl，模板1μl，重组酶12.5μl，ddh2o9.5μl，总体系共25μl；

所述步骤(2)中，扩增反应条件如下：

94℃预变性3min；98℃变性10s，55℃复性15s，72℃延伸1.5min，30个循环后；72℃10min，4℃保；

酶切反应体系如下：

dna3μl，内切酶1μl，10×buffer1μl，ddh2o5μl，总体系共10μl。

而且，所述步骤(4)中，载体为p5st1t2-downstream。

一种生产纤维素酶的集胞藻pcc6803基因工程藻株作为生产纤维素酶的应用。

本发明对于现有的技术，具有如下的优点及效果：

本发明将从里氏木霉(trichodermareesei)中获得的外源基因纤维素外切酶cbhⅱ酶基因通过基因重组技术重组至集胞藻pcc6803基因组中，获得一种生产纤维素外切酶cbhⅱ的集胞藻工程藻株spsncⅱ，该藻可在光照和简单无机盐为主培养基中生长并表达纤维素外切酶cbhⅱ，实现了一种光合蓝藻表达外源纤维素酶的方法。

本发明通过同源重组技术将纤维素外切酶cbhⅱ基因整合至集胞藻pcc6803基因组中，应用此方法获得的集胞藻pcc6803藻株spsncⅱ藻株可生产纤维素酶，在相同培养条件下，该藻株所生产的纤维素酶酶活明显优于野生型藻株。本发明所得到的可生产纤维素酶的spsncⅱ藻株对构建生产纤维素酶的基因工程菌具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为同源重组质粒p5st1t2npt结构图

图2为重组表达载体psncⅱ结构图

图3为工程藻株spsncⅱ的pcr检测图

图4为对硝基酚含量标准曲线图

图5为pnpc法野生藻株与工程藻株酶活活性比对图

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明实施例中使用的集胞藻pcc6803野生型藻株由山东农科院惠赠。

实施例1

同源重组质粒p5st1t2npt的构建：

(1)以序列表中seqidno:1和seqidno:2为上下游引物，以野生集胞藻pcc6803基因组为模板；以序列表中seqidno:3和seqidno:4为上下游引物，以genbank登录号为u02439.1的大肠杆菌为模板；以序列表中seqidno:5和seqidno:6为上下游引物，以野生集胞藻pcc6803为模板，通过pcr扩增技术获得光感启动子兼上游臂基因序列promoter-up、终止子t1t2基因片段与下游臂序列downstream。获得序列如序列表中seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11所示；

(2)对步骤(1)中所获得的光感启动子兼上游臂基因序列promoter-up进行apai酶切处理，对步骤(1)中所获得终止子t1t2基因片段进行psti和bamhi双酶切，对步骤(1)中所获得的下游臂序列downstream进行saci与sacⅱ双酶切；

(3)将pbluescriptsk质粒进行psti和bamhi双酶切，与步骤(2)制得的终止子t1t2基因片段用t4连接酶连接，得到质粒pbluescriptskt1t2；然后将步骤(2)制得的downstream基因片段用saci与sacⅱ双酶切后与经相同酶切的质粒pbluescriptskt1t2连接,得到质粒p5st1t2-downstream；

(4)用限制性内切酶bamhi处理puc4k质粒回收获得kana抗性序列，序列如序列表中seqidno:12所示；(5)用限制性内切酶bamhi处理质粒载体p5st1t2-downstream，将步骤(4)所获得的kana序列在连接酶的作用下连接至回收所得的p5st1t2-downstream载体上，制得质粒载体p5st1t2npt。

本实施例中所用酶切体系如下：dna3μl，内切酶1μl，10×buffer1μl，ddh2o5μl，酶切温度为30℃，酶切时间为2h；

pcr体系如下:上下游引物各1μl，模板1μl，重组酶12.5μl，ddh2o9.5μl，总体系共25μl，将反应组分加入pcr管中进行pcr扩增，扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，每扩增1kbdna需1min；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min；

连接体系如下：回收获得的基因片段0.5μl，内切酶处理后的质粒片段2.5μl，t4连接酶1μl，10×buffer1μl，ddh2o5μl，总体系10μl，反应温度为16℃，连接10h。

经过以上实施例获得同源重组质粒p5st1t2npt(如图1所示)。

实施例2

重组表达载体psncⅱ的构建

以序列表中seqidno:7和seqidno:8为上下游引物，以野生集胞藻pcc6803基因组为模板，通过pcr技术获得光感启动子兼上游臂promoter-up，通过引物在promoter-up两端添加酶切位点apai与同源臂,获得序列如序列表中seqidno：5所示；以序列表中seqidno:3和seqidno:4为上下游引物，以genbank数据库中里氏木霉(trichodermareeseiqm9414)的相应基因序列为模板,通过pcr技术获得纤维素外切酶cbhⅱ基因片段，并且通过引物在目的基因两端添加同源臂序列，序列如序列表中seqidno:13所示。

pcr体系如下：上下游引物各1μl，模板1μl，重组酶12.5μl，ddh2o9.5μl，总体系共25μl，将反应组分加入pcr管中进行pcr扩增，扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度55℃，时间为15s；延伸，72℃，每扩增1kbdna需1min；循环，变性-退火-延伸的循环30个；72℃，5min；4℃，10min；

用限制性内切酶apai处理质粒p5st1t2npt，将所回收获得的promoter-up片段和纤维素外切酶cbhⅱ基因片段在重组酶的作用下进行同源重组，制得重组表达载体质粒psncⅱ。

重组连接体系如下:回收获得的纤维素外切酶cbhⅱ基因1μl，回收获得的promoter-up0.5μl，apai处理后的p5st1t2npt质粒2.5μl，重组酶2μl，10×buffer4μl，ddh2o10μl，总体系20μl，反应温度37℃，反应时间2h。

经过以上实施例获得重组表达载体psncⅱ(结构图如图2所示)，将psncⅱ转化至大肠杆菌dh5α中进行保藏。

实施例3

可生产纤维素酶的集胞藻pcc6803基因工程藻株的获得。

(1)质粒转化

将psncⅱ质粒用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，装入2ml无菌离心管中。向其中加入一定量bg11培养基(已加入hepes缓冲液)，使质粒终浓度约为10ng/μl。取30ml处于对数期的野生型pcc6803，6000rpm离心7min，去上清。用20ml新鲜bg11培养基重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清。用含质粒的培养基把藻泥重悬，将重悬的藻液在29℃，150rpm，1400lux连续光照培养6h。将藻液涂于铺有混合纤维滤膜的固体培养基中光照培养1天(正置培养)后，将膜转移至含有10μg/mlkana抗生素的固体培养基中，光照培养数天至膜表面长出单藻落，最后，将长出的藻落转移至含有相同浓度kana抗生素的20mlbg11小瓶培养基中培养，待长至对数期后转接。

(2)藻株筛选

将(1)中得到的藻液进行转接培养，培养条件为29℃，150rpm，1400lux连续光照。转接时，将bg11培养基中抗生素浓度提高到20μg/ml。待长至对数期再进行转接，以后每次转接培养基中抗生素的浓度提10μg/ml。当培养基中的抗生素浓度达到50μg/ml时，将藻液平板划线。待平板上长出单藻落后，挑取单藻落至含有相应抗生素浓度的bg11培养基中培养。当藻长至对数期后，提取该藻的基因组。以此基因组为模板，以seqidno：1和seqidno：4为引物进行pcr，同时以野生型基因组作为对照。本发明中pcr反应体系和程序与实施例2中相同。将pcr产物进行琼脂糖电泳，琼脂糖凝胶检测图如附图3所示。筛选出的菌株为基因工程藻株spsncⅱ。

实施例4

集胞藻pcc6803基因工程藻株spsncⅱ的扩大培养

将野生型集胞藻pcc6803和工程藻株spsncⅱ接种于50mlbg-11液体培养基中，调节od730＝0.2，于30℃，1400lux持续光照条件下振荡培养(150rpm)7day。

实施例5

(1)粗酶液的制备

野生集胞藻pcc6803藻株与工程藻株spsncⅱ的纤维素酶的酶活测定

将野生型集胞藻pcc6803和工程藻株spsncⅱ接种于50mlbg-11液体培养基中，调节od730＝0.2，于30℃，1400lux持续光照条件下振荡培养(150rpm)至对数生长期，取30ml处于对数期的藻液，6000rpm离心7min，去上清，用20ml50mmol/lph5.0的醋酸钠缓冲液重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清，收集藻细胞，收集的藻细胞经液氮研磨、超声破碎后制备成粗酶液。

(2)标准曲线的制备

本发明用pnpc法测纤维素外切酶活性。一个酶活力单位定义为每分钟水解pnpc(对硝基酚-13-d-纤维二苷)产生1μmol对硝基酚所需要的酶量。

称取对硝基酚(简称p-nph，sigma公司出品)55.644mg，用phl0的o.1mol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶解，并定容至100ml，配制成4mm的母液。然后稀释成浓度分别为0，o.04，0.12，0.24，0.36，o.6μmol/ml的对硝基酚标准溶液，410nm比色制成标准曲线(如图4所示)。

(3)pnpc法测定野生集胞藻pcc6803藻株与工程藻株spsncⅱ的纤维素酶酶活

以50mmol/lph5.0的醋酸钠缓冲液配制2.5mmol/l的pnpc溶液，lmlpnpc溶液中加入lml粗酶液，50℃保温30min，以1％的na2c03lml终止反应，410nm比色，以对硝基酚的生成量表示酶活力，一个酶活力单位定义为每分钟水解pnpc产生1μmol对硝基酚所需要的酶量。

酶活测定结果如图5所示。

由图5可以看出，工程藻株spsncⅱ的纤维素酶酶活为1.79u，野生集胞藻pcc6803藻株为5,23u，相对于野生藻株，工程藻株酶活提高了3.2倍。

通过实施例5说明，本发明通过同源重组技术将纤维素外切酶cbhⅱ基因转化至集胞藻pcc6803中，应用此方法获得的集胞藻pcc6803藻株spsncⅱ藻株可生产纤维素酶，在相同培养条件下，该藻株所生产的纤维素酶活性明显优于野生型藻株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

seqidno:1：promotor-up-f:5'-gatgtcgacgctttagcgttccagtg-3’；

seqidno:2：promotor-up-r:5'-catttggttataattccttatgtat-3'；

seqidno:3：tit2-f:5'-atactgcagccaagcttggctgttttggc-3'；

seqidno:4：tit2-r:5'-ttaggatcccccattattgaagcatttat-3’；

seqidno:5：downstream-f:5'-cttcatatgccgcggatgacaacgactctccaac-3’；

seqidno:6：downstream-r:5'-agtgagctcttaaccgttgacagcagg-3'；

seqidno:7：cbhⅱ-f：5′-taaccaaatgcaagcttgctcaagcgt-3′

seqidno:8：cbhⅱ-r：5′-gtcgacctcgagggggggcccttagtggtggtggtggtggtg-3′

seqidno:9：光感启动子兼上游臂基因序列promoter-up

gctttagcgttccagtggatatttgctgggggttaatgaaacattgtggcggaacccagggacaatgtgaccaaaaaattcagggatatcaataagtattaggtatatggatcataattgtatgcccgactattgcttaaactgactgaccactgaccttaagagtaatggcgtgcaaggcccagtgatcaatttcattatttttcattatttcatctccattgtccctgaaaatcagttgtgtcgcccctctacacagcccagaactatggtaaaggcgcacgaaaaaccgccaggtaaactcttctcaacccccaaaacgccctctgtttacccatggaaaaaacgacaattacaagaaagtaaaacttatgtcatctataagcttcgtgtatattaacttcctgttacaaagctttacaaaactctcattaatcctttagactaagtttagtcagttccaatctgaacatcgacaaatacataaggaattataaccaa

seqidno:10：终止子t1t2基因片段

taagcttgatatcgaattcctgcagccaagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatggggga

seqidno:11：下游臂序列downstream

atgacaacgactctccaacagcgcgaaagcgcttccttgtgggaacagttttgtcagtgggtgacctctaccaacaaccggatttatgtcggttggttcggtaccttgatgatccccaccctcttaactgccaccacttgcttcatcattgccttcatcgccgctccccccgttgacatcgacggtatccgtgagcccgttgctggttctttgctttacggtaacaacatcatctctggtgctgttgtaccttcttccaacgctatcggtttgcacttctaccccatctgggaagccgcttccttagatgagtggttgtacaacggtggtccttaccagttggtagtattccacttcctcatcggcattttctgctacatgggtcgtcagtgggaactttcctaccgcttaggtatgcgtccttggatttgtgtggcttactctgcccccgtatccgctgccaccgccgtattcttgatctaccccattggtcaaggctccttctctgatggtatgcccttgggtatttctggtaccttcaacttcatgatcgtgttccaagctgagcacaacatcctgatgcaccccttccacatgttaggtgtggctggtgtattcggtggtagcttgttctccgccatgcacggttccttggtaacctcctccttggtgcgtgaaaccaccgaagttgaatcccagaactacggttacaaattcggtcaagaagaagaaacctacaacatcgttgccgcccacggctactttggtcggttgatcttccaatatgcttctttcaacaacagccgttccttgcacttcttcttgggtgcttggcctgtaatcggcatctggttcactgctatgggtgtaagcaccatggcgttcaacctgaacggtttcaacttcaaccagtccatcttggatagccaaggccgggtaatcggcacctgggctgatgtattgaaccgagccaacatcggttttgaagtaatgcacgaacgcaatgcccacaacttccccctcgacttagcgtctggggagcaagctcctgtggctttgaccgctcctgctgtcaacggttaa

seqidno:12：kana抗性序列

caggaaacagctatgaccatgattacgaattccccggatccgtcgacctgcaggggggggggggaaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgcccccccccccctgcaggtcgacggatccggggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcaca

seqidno:13：纤维素外切酶cbhⅱ基因片段

atgcaagcttgctcaagcgtctggggccaatgtggtggccagaattggtcgggtccgacttgctgtgcttccggaagcacatgcgtctactccaacgactattactcccagtgtcttcccggcgctgcaagctcaagctcgtccacgcgcgccgcgtcgacgacttctcgagtatcccccacaacatcccggtcgagctccgcgacgcctccacctggttctactactaccagagtacctccagtcggatcgggaaccgctacgtattcaggcaacccttttgttggggtcactccttgggccaatgcatattacgcctctgaagttagcagcctcgctattcctagcttgactggagccatggccactgctgcagcagctgtcgcaaaggttccctcttttatgtggctagatactcttgacaagacccctctcatggagcaaaccttggccgacatccgcaccgccaacaagaatggcggtaactatgccggacagtttgtggtgtatgacttgccggatcgcgattgcgctgcccttgcctcgaatggcgaatactctattgccgatggtggcgtcgccaaatataagaactatatcgacaccattcgtcaaattgtcgtggaatattccgatatccggaccctcctggttattgagcctgactctcttgccaacctggtgaccaacctcggtactccaaagtgtgccaatgctcagtcagcctaccttgagtgcatcaactacgccgtcacacagctgaaccttccaaatgttgcgatgtatttggacgctggccatgcaggatggcttggctggccggcaaaccaagacccggccgctcagctatttgcaaatgtttacaagaatgcatcgtctccgagagctcttcgcggattggcaaccaatgtcgccaactacaacgggtggaacattaccagccccccatcgtacacgcaaggcaacgctgtctacaacgagaagctgtacatccacgctattggacctcttcttgccaatcacggctggtccaacgccttcttcatcactgatcaaggtcgatcgggaaagcagcctaccggacagcaacagtggggagactggtgcaatgtgatcggcaccggatttggtattcgcccatccgcaaacactggggactcgttgctggattcgtttgtctgggtcaagccaggcggcgagtgtgacggcaccagcgacagcagtgcgccacgatttgactcccactgtgcgctcccagatgccttgcaaccggcgcctcaagctggtgcttggttccaagcctactttgtgcagcttctcacaaacgcaaacccatcgttcctgcaccaccaccaccaccactaa

seqidno：14：表达载体psncⅱ序列

caggaaacagctatgaccatgattacgaattccccggatccgtcgacctgcaggggggggggggaaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgcccccccccccctgcaggtcgacggatccggggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcaca

序列表

<110>天津科技大学

山东省农业科学院生物技术研究中心

<120>生产纤维素酶的集胞藻pcc6803的基因工程藻株及其构建方法

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>引物(unknown)

<400>1

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<210>2

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<211>29

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<211>27

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<210>11

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